酶工程第二章產(chǎn)酶微生物的分離和選育

1、 酶活力的表示方法酶活力的表示方法活力單位活力單位（active unit） 習(xí)慣單位（習(xí)慣單位（U）: 底物底物(或產(chǎn)物或產(chǎn)物)變化量變化量 / 單位時間單位時間 國際單位（國際單位（IU）: 1moL變化量變化量 / 分鐘分鐘 Katal（Kat）：）：1moL變化量變化量 / 秒秒比活力比活力=總活力單位總活力單位總蛋白總蛋白mg數(shù)數(shù)= U(或或IU) mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小量度酶純度量度酶純度比活力比活力（specific activity）回收率和純化倍數(shù)回收率和純化倍數(shù)回收率回收率 100每次總活力每次總活力第一次總活力第一次總活力純化倍數(shù)純化倍數(shù)每次比活

2、力每次比活力第一次比活力第一次比活力1kSE 1kES 2kEP 第二章第二章 產(chǎn)酶微生物的分離和選育產(chǎn)酶微生物的分離和選育 1.1產(chǎn)酶產(chǎn)酶微生物微生物1.2分離和篩選分離和篩選1.3誘變育種誘變育種1.4基因育種基因育種程育種程育種1.5原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合育種融合育種教教 學(xué)學(xué) 內(nèi)內(nèi) 容容1.1 產(chǎn)酶微生物 微生物產(chǎn)酶的優(yōu)勢 1、種類多，產(chǎn)能高，酶種類多樣化2、周期短，繁殖快，培養(yǎng)簡單、成本相對低3、易突變，易選育獲得高產(chǎn)菌株4、易進(jìn)行基因工程改造 從自然界中分離出來直接利用； 對野生菌株進(jìn)行人工誘變，得到突變株才能利用。 使用重組DNA技術(shù)改造的菌株從野生菌轉(zhuǎn)向變異菌；自然選育轉(zhuǎn)向代謝育

3、種；誘發(fā)基因突變轉(zhuǎn)向基因重組的定向育種目前育種總趨勢：工業(yè)生產(chǎn)常用的微生物：細(xì)菌、放線菌、酵母菌、霉菌51、細(xì)菌 2、放線菌 屬原核單細(xì)胞生物，有球菌、桿菌和螺旋菌三類，屬原核單細(xì)胞生物，有球菌、桿菌和螺旋菌三類，分革蘭氏陽性菌和陰性菌。在發(fā)酵專業(yè)中常用的是桿菌，分革蘭氏陽性菌和陰性菌。在發(fā)酵專業(yè)中常用的是桿菌，它易形成芽孢。它易形成芽孢。 屬原核生物，菌落呈放射狀，廣泛存在于泥土中，屬原核生物，菌落呈放射狀，廣泛存在于泥土中，最大經(jīng)濟(jì)價值是用來生產(chǎn)抗生素。最大經(jīng)濟(jì)價值是用來生產(chǎn)抗生素。3、霉菌 屬真核生物，俗稱絲狀真菌。在發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品屬真核生物，俗稱絲狀真菌。在發(fā)酵工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品和

4、皮革等方面有重要用途，但易引起工業(yè)原料、產(chǎn)品和農(nóng)副和皮革等方面有重要用途，但易引起工業(yè)原料、產(chǎn)品和農(nóng)副產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)。產(chǎn)品的發(fā)霉變質(zhì)。4、酵母菌 屬真核單細(xì)胞生物，主要生長在偏酸含糖量較高的屬真核單細(xì)胞生物，主要生長在偏酸含糖量較高的環(huán)境中，酒精、飲料等生產(chǎn)中有重要用途。環(huán)境中，酒精、飲料等生產(chǎn)中有重要用途。1.1.1 產(chǎn)產(chǎn)酶微生物的種類酶微生物的種類 6 工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有工業(yè)生產(chǎn)常用的細(xì)菌有 枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis) 乳酸桿菌乳酸桿菌(Lactobacillus lactics) 醋酸桿菌醋酸桿菌(Acetobacter) 棒狀桿菌棒狀桿菌(Cory

5、nebacterium) 短桿菌短桿菌(Brevibacterium) 用于生產(chǎn)：用于生產(chǎn)： 生產(chǎn)淀粉酶生產(chǎn)淀粉酶(amylase） 蛋白酶（蛋白酶（proteinase） 乳酸乳酸(lactic acid) 醋酸醋酸(acetic acid) 氨基酸氨基酸(amino acid) 肌苷酸肌苷酸(inosinic acid) 細(xì)菌（細(xì)菌（bacteria）： 基因工程常用宿主（工程）菌之一。7 放線菌放線菌(Actinomycetes) 常用的放線菌主要來自以下幾個屬：鏈霉菌屬、小單孢菌屬和諾卡氏菌屬等。 最大經(jīng)濟(jì)價值在于能產(chǎn)生多種抗生素多種抗生素（antibiotics）。）。從微生物中發(fā)現(xiàn)

6、的抗生素，有60%以上是放線菌產(chǎn)生的，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。8 酵母菌（酵母菌（yeast） 工業(yè)上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假絲酵母(Candida)、類酵母(Saccharomycodes)等用于釀酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固點石油、生產(chǎn)脂肪酶（lipase），以及生產(chǎn)可食用、藥用和飼料用酵母菌體蛋白等。 基因工程常用宿主（工程）菌之一?；蚬こ坛Ｓ盟拗鳎üこ蹋┚弧? 霉菌（霉菌（mould）工業(yè)上常用的霉菌有：工業(yè)上常用的霉菌有： 藻狀菌綱的根霉、毛霉、犁頭霉，子囊菌綱的紅曲霉，半知菌類的曲霉、青霉等；

7、產(chǎn)品產(chǎn)品： 酶制劑（enzyme preparation）、抗生素(antibiotic)、有機(jī)酸（organic acid）及甾體激素（steroid hormone） 等。10幾種菌落11常見酶u蛋白酶u酸性蛋白酶u中性蛋白酶u堿性蛋白酶u糖化酶u淀粉酶u脂肪酶u纖維素酶1.1.2 微生物酶的種類醫(yī)藥與分析研究用酶u青霉素?；竨SODu溶栓酶u透明質(zhì)酸酶121.1.3 產(chǎn)酶微生物的來源 向有關(guān)科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種 土壤 水體 空氣 極端環(huán)境13菌落數(shù)與空氣清潔度的關(guān)系空氣清潔度菌落數(shù)最清潔的空氣1潔凈空氣30個以下普通空氣30

8、-150輕度污染空氣300以下嚴(yán)重污染空氣301以上14 微生物工業(yè)對菌種的要求P55 作為大規(guī)模生產(chǎn)，對菌種有下列要求： (1)產(chǎn)酶量高、易分離。 (2)易于控制培養(yǎng)條件，酶活性高；發(fā)酵周期較短。 (3)非致病菌、不產(chǎn)生任何有害的物質(zhì)和毒素， (4)菌株穩(wěn)定、抗雜菌和抗噬菌體能力強(qiáng)。15分離思路分離思路 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來。 實驗室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進(jìn)行分離純化。 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。第二節(jié)第二節(jié) 產(chǎn)酶微生物的分離和篩選產(chǎn)酶微生物的

9、分離和篩選 從自然界篩選從自然界篩選17 定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。 采樣：有針對性地采集樣品。 增殖：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。 分離：利用分離技術(shù)得到純種。 發(fā)酵性能測定：進(jìn)行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。新種分離與篩選的新種分離與篩選的步驟（步驟（P56）（一）樣品采集從大自然中分離篩選新的微生物菌種纖維素酶：堆積和腐爛纖維素區(qū)域，如腐爛樹干上；果膠酶：霉?fàn)€果蔬淀粉酶：釀酒廠、淀粉廠周圍土壤、污泥、排水中

10、蛋白酶：屠宰場、豆制品廠污泥中。土壤分離為主要來源：15cm處土壤19農(nóng)田上層 15cm 處微生物的數(shù)量微生物每克土壤中的數(shù)量細(xì)菌9.8107放線菌2.0106真菌1.2105藻菌2.5104原生動物3.0104方法：35個取樣點、10g/點，混合后于滅菌紙袋中，標(biāo)記：地點、日期、土壤性質(zhì)、植被情況及pH。采樣季節(jié)：以溫度適中，雨量不多的秋初為好。20方方 法法 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群，特別是分離在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時，必須十分重視樣本的采集。 樣本采集時所需的工具通常有無菌刮鏟、土樣采集器、鑷子、解剖刀、手套、無菌小塑料袋和塑料瓶等。1土樣采集方法土樣采集方

11、法 森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下層向上層順序采集； 水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集。如果層次要求不嚴(yán)格，可取離地面515cm處的土。將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。2 2植物體采集方法植物體采集方法 在采集葉面時，一般是用滅菌的剪刀、打孔器、安全刀片等，由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊，并注意不要損傷周圍邊緣。 選擇葉面時應(yīng)考慮葉位、葉齡、葉片正反面和在一片葉上的取樣部位。 采集植物根及根系時，將洗凈的根裝入采樣袋中。3 3水樣采集方法水樣采集方法 用于細(xì)菌檢測的水樣應(yīng)收集于100m1干凈、滅菌的廣口塑料瓶中。 由于表層水中含有泥沙，故在采樣時應(yīng)在較深的靜水層中

12、采集水樣。 方法是：握住采樣瓶底浸入水中30-50cm處，然后瓶口朝下打開瓶蓋，讓水樣進(jìn)入。如果有急流存在的話，應(yīng)直接將瓶口反向于急流。采集瓶從水中取出時應(yīng)迅速并帶有較大的弧度。水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶。所有水樣都應(yīng)在24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測，或者4下貯存。（二）增殖培養(yǎng)（二）增殖培養(yǎng) 為了容易分離到所需的菌種，讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加，可以通過配制選擇性培養(yǎng)基，選擇一定的培養(yǎng)條件來控制。 例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。富集方法富

13、集方法1、添加特殊的營養(yǎng)物質(zhì)2、調(diào)整培養(yǎng)基的酸堿性3、控制培養(yǎng)溫度和熱處理4、添加抑制劑（三）培養(yǎng)分離（三）培養(yǎng)分離 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著，但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài)。因此還必須分離，純化。在這步，增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用，而且控制得細(xì)一點，好一點。純種分離的方法有劃線分離法、稀釋分離法。1.稀釋平皿分離法1.稀釋平皿分離法100ml1g9ml9ml9ml9ml9ml9ml1/1001/100010-810-710-610-510-41ml1ml1ml1ml1ml(1)稀 釋1.稀釋平皿分離法b.涂布平皿分離法涂布平皿分離法a.傾注平皿分離法傾注平皿分離法2.平皿劃線分離

14、法 a. 連續(xù)劃線分離法 b. 分區(qū)劃線分離法（四）篩（四）篩 選選 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗，以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。（五）毒性試驗（五）毒性試驗 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心，尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種，更應(yīng)慎重。據(jù)有的國家規(guī)定，微生物中除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗外，其他微生物作為食用，均需通過兩年以上的毒性試驗。優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征對菌種的要求對菌種的要求 天然菌種的生產(chǎn)性能較低，一般需要進(jìn)行選天然菌種的生產(chǎn)性能較低，一般需要進(jìn)行選育。

15、育。1.生產(chǎn)力：生產(chǎn)力：能在廉價的培養(yǎng)基上迅速生長，所需的代謝產(chǎn)能在廉價的培養(yǎng)基上迅速生長，所需的代謝產(chǎn) 物的產(chǎn)量高，其它代謝產(chǎn)物少物的產(chǎn)量高，其它代謝產(chǎn)物少2.操作性：操作性：培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵易控制，產(chǎn)品易分離培養(yǎng)條件簡單，發(fā)酵易控制，產(chǎn)品易分離3.穩(wěn)定性：穩(wěn)定性：抗噬菌體能力強(qiáng)，菌種純，不易變異退化抗噬菌體能力強(qiáng)，菌種純，不易變異退化4.安全性：安全性：是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素是非病源菌，不產(chǎn)有害生物活性物質(zhì)或毒素優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征優(yōu)良菌種應(yīng)具備的特征 選擇生產(chǎn)菌種應(yīng)注意的因素1.原料方面：原料方面：廣，轉(zhuǎn)化率高；廣，轉(zhuǎn)化率高；2.產(chǎn)物方面：產(chǎn)物方面：目的產(chǎn)物含量高，副產(chǎn)

16、物少；目的產(chǎn)物含量高，副產(chǎn)物少；3.菌體方面：菌體方面：生長快、繁殖力強(qiáng)，耐受力強(qiáng)，生長快、繁殖力強(qiáng)，耐受力強(qiáng)，抗污染、抗噬菌體能力強(qiáng)，遺傳特性穩(wěn)定抗污染、抗噬菌體能力強(qiáng)，遺傳特性穩(wěn)定4. 設(shè)備方面設(shè)備方面：產(chǎn)泡沫少，適宜大罐生產(chǎn)。：產(chǎn)泡沫少，適宜大罐生產(chǎn)。（培養(yǎng)條件異，周期短，需氧量小，抗污染能力強(qiáng)（培養(yǎng)條件異，周期短，需氧量小，抗污染能力強(qiáng)）從自然界中分離篩選菌種的方法步驟從自然界中分離篩選菌種的方法步驟 方法、地點、時間和周圍環(huán)境記錄方法、地點、時間和周圍環(huán)境記錄純種分離的原則就是使培養(yǎng)物獲得單個菌落：純種分離的原則就是使培養(yǎng)物獲得單個菌落：1稀釋分離法稀釋分離法 2平板劃線分離法平板劃

17、線分離法 涂菌：涂菌： 劃線分離：劃線分離：分步劃線法；一次劃線法：分步劃線法；一次劃線法： 3組織分離法組織分離法 二、誘變劑和誘變處理 物理誘變劑：物理誘變劑： 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線。其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的，有一定的穿透力，一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用，否則有一定危險性。 化學(xué)誘變劑：化學(xué)誘變劑： 如堿基類似物、烷化劑等。 ：化學(xué)誘變劑中使用最多、最有效的是烷化劑。 1. 使用經(jīng)濟(jì)方便使用經(jīng)濟(jì)方便 2. 專一性專一性 不同藥劑對不同植物、組織或細(xì)胞、染色體不同藥劑對不同植物、組織或細(xì)胞、染色體節(jié)段、基因的誘變有一定專一性。節(jié)段、基因的誘變有一定專一性

18、。 3. 誘變機(jī)制與輻射育種不同誘變機(jī)制與輻射育種不同輻射誘變因高能射線造成，染色體結(jié)構(gòu)變異輻射誘變因高能射線造成，染色體結(jié)構(gòu)變異廣泛廣泛化學(xué)誘變是化學(xué)藥劑與遺傳物質(zhì)發(fā)生生化反化學(xué)誘變是化學(xué)藥劑與遺傳物質(zhì)發(fā)生生化反應(yīng)，結(jié)果多是基因的點突變，所以更為適用應(yīng)，結(jié)果多是基因的點突變，所以更為適用。 注意：致癌劑三、誘變育種步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸液的制備誘變處理篩選保藏2.制備細(xì)胞懸液要求：要求： 菌體處于對數(shù)生長期，并使細(xì)胞處于同步生長；菌體處于對數(shù)生長期，并使細(xì)胞處于同步生長； 細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，以避免細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，以避免表型遲延現(xiàn)象（表型遲延現(xiàn)象（phenotypic lagphen

19、otypic lag）; ;方法：方法： 玻璃珠打散玻璃珠打散10-15min; 10-15min; 加加.3%.3%吐溫吐溫8080（表面活性劑）（表面活性劑） 用無菌脫脂棉過濾。用無菌脫脂棉過濾。 制備：制備： 物理誘變劑物理誘變劑生理鹽水（生理鹽水（0.85%NaCl) 0.85%NaCl) 化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑緩沖液緩沖液 濃度：濃度： 細(xì)菌、放線菌細(xì)菌、放線菌 10108 8個個/ml /ml 霉菌、酵母菌霉菌、酵母菌 10106 6個個/ml/ml指某一突變在指某一突變在DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂后，復(fù)制和細(xì)胞分裂后，才在表型上顯示出才在表型上顯示出來，造成不純的菌來，造成不純的菌落。落

20、。分離性遲延現(xiàn)象分離性遲延現(xiàn)象生理性遲延現(xiàn)象生理性遲延現(xiàn)象why3.誘變處理：誘變劑的作用：誘變劑的作用： 提高突變的頻率 擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度 使產(chǎn)量變異朝著正突變或負(fù)突變移動劑量的表示法：劑量的表示法：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。致死率是最好的誘變劑相對劑量的表示方法。最適劑量的選擇：最適劑量的選擇：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在7080%）l選擇誘變劑的種類：選擇誘變劑的種類：在選用理化因子作誘變劑時，在同樣效果下，應(yīng)選用最方便的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇最高

21、效的因素。在物理誘變劑中，尤以紫外線為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如NTG。l簡便有效的誘變方法：簡便有效的誘變方法：紫外線紫外線的照射最為方便。 化學(xué)誘變劑化學(xué)誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反應(yīng)的方法很多，實際工作時可參看有關(guān)書籍。一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個檢出法選出突變種。 篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速

22、篩出大量的篩選分初篩和復(fù)篩。初篩以迅速篩出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。達(dá)到初步要求的分離菌落為目的，以量為主。透明圈法：透明圈法：混濁底物被分解后形成透明圈。如混濁底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等?？扇苄缘矸?、碳酸鈣等。變色圈法：變色圈法：直接用顯色劑或指示劑。直接用顯色劑或指示劑。生長圈法：生長圈法：利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條物作為工具菌，要分離的微生物能在一般培養(yǎng)條件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長，形件下生長而合成該營養(yǎng)物而使工具菌能生長，形成生長圈。成生長圈。抑制圈法抑制圈法

23、：瓊脂塊培養(yǎng)法。：瓊脂塊培養(yǎng)法。 1 1、復(fù)印技術(shù)、復(fù)印技術(shù) 2 2、大通量篩選（瓊脂塊法）、大通量篩選（瓊脂塊法）孢子菌懸液誘變劑瓊脂平皿29度，3d6mm打孔器取出放入另一平皿溫度，4-5d生物鑒定板17-18h復(fù)篩：則是精選，以質(zhì)為主，也就是以精確度為主。因此在具體方法上就有差異.在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再復(fù)篩的菌株，最后才能選得優(yōu)秀菌株。在以后的復(fù)篩階段，還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離，純化菌株。第一輪：第一輪：一個出發(fā)菌株一個出發(fā)菌株選出選出200個菌株個菌株選出選出50株株選出選出5株株誘變處理初篩（每瓶一株）復(fù)篩（每瓶四株）第二輪：第二輪：5個出發(fā)菌株個出發(fā)菌株 選出選出50株株

24、 選出選出5株株40株株40株株40株株40株株40株株誘變處理初篩復(fù)篩（每瓶一株）（每瓶四株）紫外線的誘變育種紫外線的誘變育種 紫外線誘變一般采用15W紫外線殺菌燈，波長為2537A燈與處理物的距離為1530cm，照射時間依菌種而異，一般為幾秒至幾十分鐘。一般我們常以細(xì)胞的死亡率表示，照射的劑量死亡率控制在7080%為宜。例子例子： 被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為106個ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為106107個ml。由于紫外線穿透力不強(qiáng)，要求照射液不要太深，約0.51.0cm厚，同時要用電磁攪拌器或手工進(jìn)行攪拌，使照射均勻。 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時和照射后的處理應(yīng)在紅燈下

25、進(jìn)行。 (二)操作步驟 1將細(xì)菌培養(yǎng)液以3000rmin離心5min，傾去上清液，將菌體打散加入無菌生理鹽水再離心洗滌。 2將菌懸液放入一已滅菌的，裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)用手搖動，以打散菌體。將菌液倒入有定性濾紙的漏斗內(nèi)過濾，單細(xì)胞濾液裝入試管內(nèi)，一般處于渾濁態(tài)的細(xì)胞液含細(xì)胞數(shù)可達(dá)107個ml左右，作為待處理菌懸液。 3取24m1制備的菌液加到直徑9cm培養(yǎng)皿內(nèi)，放入一無菌磁力攪拌子，然后置磁力攪拌器上、15W紫外線下30cm處。在正式照射前，應(yīng)先開紫外線10min，讓紫外燈預(yù)熱，然后開啟皿蓋正式在攪拌下照射1050s。操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行，或用黑紙包住，避免白熾光。 4取未照射的制備菌液和照射

26、菌液各o.5ml進(jìn)行稀釋分離，計數(shù)活菌細(xì)胞數(shù)。 5取照射菌液2ml于液體培養(yǎng)基中(300ml三角瓶內(nèi)裝30ml培養(yǎng)液)，120rmin振蕩培養(yǎng)46h。 6取中間培養(yǎng)液稀釋分離、培養(yǎng)。 7挑取菌落進(jìn)行篩選。亞硝基胍誘變曲霉菌亞硝基胍誘變曲霉菌 N甲基N-硝基-N-亞硝基胍(NGN，MNNG或TG)對真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用。其精確的作用機(jī)制尚不很清楚，認(rèn)為是伴隨著重氮甲烷的生成及在酸性條件下生成亞硝酸， 直 接 作 用 于 細(xì) 胞 內(nèi) 的DNA復(fù)制系統(tǒng)，從而誘發(fā)了變異。MNNG的誘變作用隨pH的升高而增強(qiáng)。 (二)操作步驟 1單孢子懸液制備 取斜面，加入6ml 0.1molL pH6.

27、o的磷酸緩沖液，用接種環(huán)刮下孢子，振蕩試管，立即通過帶濾紙漏斗過濾，由此制得單孢子懸液，若孢子液渾濁狀，其孢子濃度可達(dá)l06個ml，此為待處理孢子懸液。 2MNNG溶液的制備 用分析天平稱取2mg，加入2ml 0.1molL pH 6.0磷酸緩沖液，于暗處振蕩溶解。3誘變處理 吸取MNNG溶液lml，加入到1m1孢子懸液中，30振蕩30min，立即稀釋1000倍停止作用，然后以10-2，10-4兩個稀釋度分離培養(yǎng)，30 3天后計數(shù)。 4死亡率計算 將未處理的孢子液1ml加入1ml磷酸緩沖液中，同上逐級稀釋分離， 30下培養(yǎng)3天。根據(jù)處理前后的活孢子數(shù)可計算出死亡率。 5挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白

28、酶產(chǎn)量篩選第四節(jié)第四節(jié) 基因育種基因育種 定義：是運(yùn)用體外DNA各種操作或修改手法獲得目的基因，再借助于病毒、細(xì)菌質(zhì)?；蚱渌d體，將目的基因轉(zhuǎn)移至新的宿主細(xì)胞并使其在新的宿主細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)， 或者通過細(xì)胞間的相互作用，使一個細(xì)胞的優(yōu)秀性狀經(jīng)其間遺傳物質(zhì)的交換而轉(zhuǎn)移給另個細(xì)胞的方法。一、步驟一、步驟、獲得待克隆的、獲得待克隆的DNA片段（基因）；片段（基因）；、目的基因與載體在體外連接；、目的基因與載體在體外連接；、重組、重組DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞；、篩選、鑒定陽性重組子；、篩選、鑒定陽性重組子；、重組子的擴(kuò)增與或表達(dá)。、重組子的擴(kuò)增與或表達(dá)。 （一）載體（一）載體（

29、Vector）的選擇）的選擇種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。種類：質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒。選擇標(biāo)準(zhǔn)：選擇標(biāo)準(zhǔn)：、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制；、能在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中復(fù)制；、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點）、具有多種限制酶的單一切點（即所謂多克隆位點） 以便外源以便外源DNADNA插入；插入；、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；、具有篩選標(biāo)志以區(qū)別陽性與陰性重組分子；、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體、載體分子較小，以便體外基因操作，同時載體DNADNA與與 宿主宿主DNADNA便于分離；便于分離；、對于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動、對于表達(dá)型載體還應(yīng)具有與宿主

30、細(xì)胞相適應(yīng)的啟動 子、增強(qiáng)子、加尾信號等基因表達(dá)元件。子、增強(qiáng)子、加尾信號等基因表達(dá)元件。二、載體系統(tǒng)二、載體系統(tǒng) 是存在于細(xì)是存在于細(xì)菌染色體外的小菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈型環(huán)狀雙鏈DNADNA分子分子, ,大小約為大小約為數(shù)千堿基對。常數(shù)千堿基對。常有有1 31 3個抗藥個抗藥性基因，以利于性基因，以利于篩選。篩選。(二二)質(zhì)粒載體（質(zhì)粒載體（Plasmid）抗生素標(biāo)記： tetrampr r常用質(zhì)粒載體： pBR322質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體pBR322pBR322BamBamHIHISalSalI IHinHindIIIdIIIPstPstI IScaScaI IAmpAmpr roriori

31、(4.36 kb)(4.36 kb) pBR322質(zhì)粒是由質(zhì)粒是由3個不同來源的部分組成個不同來源的部分組成的的:含有氨卡青霉素抗性基因（含有氨卡青霉素抗性基因（ampr)、四、四環(huán)素抗性基因環(huán)素抗性基因(tetr)和和DNA復(fù)制起點復(fù)制起點(ori)。 pBR322質(zhì)粒載體較小質(zhì)粒載體較小,其長度為其長度為4363bp。不僅易于純化，而且即使攜帶上一段較大不僅易于純化，而且即使攜帶上一段較大（6-8kb）的外源）的外源DNA片段，操作起來仍片段，操作起來仍較為便利。較為便利。 pBR322質(zhì)粒載體具有兩種抗生素抗性基因以質(zhì)粒載體具有兩種抗生素抗性基因以用作轉(zhuǎn)化子的選擇記號，方便選擇。例如，用

32、作轉(zhuǎn)化子的選擇記號，方便選擇。例如，將外源將外源DNA克隆在克隆在Bam H I位點上，將這樣位點上，將這樣的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌細(xì)胞中，的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到野生型大腸桿菌細(xì)胞中，并涂布在含有氨卡青霉素的選擇性培養(yǎng)基平并涂布在含有氨卡青霉素的選擇性培養(yǎng)基平板上，那么存活下來的菌落都將具有板上，那么存活下來的菌落都將具有Ampr的的表型，它們也必定是獲得了編碼有這種抗性表型，它們也必定是獲得了編碼有這種抗性基因的轉(zhuǎn)化子?；虻霓D(zhuǎn)化子。 具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增，每個具較高的拷貝數(shù)，若經(jīng)過氯霉素擴(kuò)增，每個細(xì)胞中可累積細(xì)胞中可累積10003000個拷貝，為重組體個拷貝，為重組體DNA的制

33、備提供了極大的方便。的制備提供了極大的方便。三、重組三、重組DNADNA中常用的工具酶中常用的工具酶 包括限制性核酸內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶等.限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶 切開DNA分子所需的酶：每一種酶都有其各自的作用位點。 常用限制性內(nèi)切酶 種類及特性限制性內(nèi)切酶的剪切方式限制性內(nèi)切酶的剪切方式 粘性未端：切開后的兩段粘性未端：切開后的兩段DNADNA各留下一個各留下一個尾，這尾，這2 2個尾的核苷酸順序完全一樣，但個尾的核苷酸順序完全一樣，但是方向相反。它們之間是互補(bǔ)的，在適是方向相反。它們之間是互補(bǔ)的，在適當(dāng)條件下可以再連接一起。當(dāng)條件下可以再連接一起。其它工具酶其它

34、工具酶 聚合聚合酶酶T4 DNA 修補(bǔ)工具酶修補(bǔ)工具酶DNA聚合酶聚合酶I 末端加工酶末端加工酶S1核酸酶核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶堿性磷酸單脂酶 末端轉(zhuǎn)移酶末端轉(zhuǎn)移酶人工加人工加polyA 或或polyT 尾尾 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶四、目的基因的獲取四、目的基因的獲取一、通過建立基因文庫分離靶基因基因文庫包括兩類：基因組文庫：利用限制性內(nèi)切酶。cDNA：用mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈DNA，再經(jīng)DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈DNA?？扇コ婧松锘蛑胁槐磉_(dá)的內(nèi)含子。二、化學(xué)合成法制備二、化學(xué)合成法制備DNADNA片段片段 從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照

35、密碼合成基因。它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段三、聚合酶鏈反應(yīng)法擴(kuò)增基因片段 對于已知全部或部分核苷酸序列的基對于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（），因，可以通過聚合酶鏈反應(yīng)（），以基因組以基因組DNADNA或或cDNAcDNA模板擴(kuò)增得到目的基模板擴(kuò)增得到目的基因片段。因片段。PCRPCR技術(shù)技術(shù) 根據(jù)需擴(kuò)增片段的兩端設(shè)計引物。根據(jù)需擴(kuò)增片段的兩端設(shè)計引物。 使使DNADNA解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的解鏈（高溫），引物結(jié)合于基因的兩端（低溫），在合適溫度下開始合成兩端（低溫），在合適溫度下開始合成（鏈延長）反應(yīng)。（鏈延長）反應(yīng)。 特點

36、：需要很少的特點：需要很少的DNADNA模板，且能直接從模板，且能直接從基因組中得到目的基因?；蚪M中得到目的基因。DNADNA擴(kuò)增擴(kuò)增PCRPCR反應(yīng)反應(yīng) DNADNA分子的體外連接分子的體外連接 DNADNA片段的體外連接是重組片段的體外連接是重組DNADNA技術(shù)的技術(shù)的關(guān)鍵。關(guān)鍵。DNADNA連接是由連接是由DNADNA連接酶催化完成連接酶催化完成的。的。 DNA DNA連接酶催化兩條雙鏈連接酶催化兩條雙鏈DNADNA片段相鄰片段相鄰的的5 5- -磷酸和磷酸和3 3- -羥基間形成磷酸二酯鍵。羥基間形成磷酸二酯鍵。 在分子克隆中最有用的的在分子克隆中最有用的的DNADNA連接酶連接酶是

37、來自噬菌體的是來自噬菌體的DNA DNA 連接酶。連接酶。 T4 DNAT4 DNA連接酶在分子克隆中主要用于：連接酶在分子克隆中主要用于：、連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的片、連接具有同源互補(bǔ)粘性末端的片段；段；、連接雙鏈、連接雙鏈DNADNA分子間的平端；分子間的平端；、在雙鏈平端的、在雙鏈平端的DNADNA分子上添加合成的人分子上添加合成的人工接頭或適配子。工接頭或適配子。五、重組五、重組DNADNA導(dǎo)入宿主菌導(dǎo)入宿主菌 體外連接的重組體外連接的重組DNADNA分子必須導(dǎo)入分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制、增殖和表達(dá)。根據(jù)所采用的載體的性增殖和表達(dá)。根

38、據(jù)所采用的載體的性質(zhì)，將重組質(zhì)，將重組DNADNA分子導(dǎo)入受體可有不分子導(dǎo)入受體可有不同的方法。同的方法。重組重組DNADNA的鑒定的鑒定 遺傳學(xué)方法遺傳學(xué)方法五、載體宿主系統(tǒng)五、載體宿主系統(tǒng) 載體載體(vector)(vector)是攜帶外源是攜帶外源DNADNA進(jìn)入宿主進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的DNADNA； 一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等一般是通過改造質(zhì)粒、噬菌體或病毒等構(gòu)建的。構(gòu)建的。宿主細(xì)胞必須符合以下條件宿主細(xì)胞必須符合以下條件、對載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制；、對載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制；、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源、不存在特異的內(nèi)切酶體系降

39、解外源DNADNA；、在重組、在重組DNADNA增殖過程中，不會對它進(jìn)行修飾；增殖過程中，不會對它進(jìn)行修飾；、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；、重組缺陷型，不會產(chǎn)生體內(nèi)重組；、容易導(dǎo)入重組、容易導(dǎo)入重組DNADNA分子；分子；、符合重組、符合重組DNADNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。l 聚聚-羥基丁酸酯羥基丁酸酯(Poly-hydroxybutyrate,PHB)是一種是一種深受國際生物工程界重視的新型高分子材料，它最重深受國際生物工程界重視的新型高分子材料，它最重要的特性是可生物降解性，因此可望為解決日益嚴(yán)重要的特性是可生物降解性，因此可望為解決日益嚴(yán)重的的“白色污染白色污染”問題帶來希

40、望。問題帶來希望。l 透明顫菌血紅蛋白基因透明顫菌血紅蛋白基因(Vitreoscilla Hemoglobin gene,vgb)位于位于1.4-kb的基因片段上，且此基因片段攜帶內(nèi)的基因片段上，且此基因片段攜帶內(nèi)啟動子。啟動子。 vgb基因產(chǎn)物，即透明顫菌血紅蛋白基因產(chǎn)物，即透明顫菌血紅蛋白(Vitreoscilla Hemoglobin,VHb)，能夠從分子水平上提高細(xì)，能夠從分子水平上提高細(xì)胞自身對溶氧的利用能力，從而使細(xì)胞在貧氧環(huán)境中胞自身對溶氧的利用能力，從而使細(xì)胞在貧氧環(huán)境中存活，且可以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和收率。存活，且可以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量和收率。 例子例子透明顫菌血紅蛋白基因在

41、產(chǎn)透明顫菌血紅蛋白基因在產(chǎn)PHBPHB重組重組大腸桿菌中的克隆表達(dá)大腸桿菌中的克隆表達(dá) 利用生物技術(shù)，對基因片段按照不同的利用生物技術(shù)，對基因片段按照不同的克隆策略進(jìn)行基因重組，以構(gòu)建具有可誘導(dǎo)克隆策略進(jìn)行基因重組，以構(gòu)建具有可誘導(dǎo)裂解破壁和高溶氧利用能力的裂解破壁和高溶氧利用能力的PHB高產(chǎn)重組高產(chǎn)重組大腸桿菌大腸桿菌(Escherichia coli,E.coli)，將同時從，將同時從發(fā)酵和分離兩方面降低發(fā)酵和分離兩方面降低PHB的生產(chǎn)成本，從的生產(chǎn)成本，從而使而使PHB的大規(guī)模推廣和應(yīng)用成為可能的大規(guī)模推廣和應(yīng)用成為可能透明顫菌血紅蛋白基因在產(chǎn)透明顫菌血紅蛋白基因在產(chǎn)PHBPHB重組重組

42、大腸桿菌中的克隆表達(dá)大腸桿菌中的克隆表達(dá) 質(zhì)粒質(zhì)粒pBR322-vgb的長度為的長度為5.76kb,vgb基因長度為基因長度為1.4kb，且，且該片段可用限制性核酸內(nèi)切酶該片段可用限制性核酸內(nèi)切酶Hind 和和Sal 從質(zhì)粒上酶切下從質(zhì)粒上酶切下來。酶切溫度為來。酶切溫度為37，時間為，時間為3h。酶切后的。酶切后的vgb片段用低熔點瓊脂片段用低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化分離并回收。同糖凝膠電泳純化分離并回收。同樣，用樣，用Hind 和和Sal 酶切質(zhì)粒酶切質(zhì)粒pTU14，其酶切位點位于多克隆，其酶切位點位于多克隆位點上。用位點上。用T4噬菌體噬菌體DNA連接酶連接酶將將vgb基因片段連接到酶切后

43、的質(zhì)基因片段連接到酶切后的質(zhì)粒載體粒載體pTU14上，得到攜帶氨芐上，得到攜帶氨芐青霉素抗性青霉素抗性(Apr)的新質(zhì)粒的新質(zhì)粒pTU14-vgb。 經(jīng)過約經(jīng)過約80h的補(bǔ)料培養(yǎng)，重組菌的補(bǔ)料培養(yǎng)，重組菌VG1(pTU14)的菌體濃度的菌體濃度可高達(dá)可高達(dá)25.9g/L，菌體細(xì)胞中的，菌體細(xì)胞中的PHB百分含量可高達(dá)百分含量可高達(dá)95%以以上，這是迄今為止報道的利用大腸桿菌生產(chǎn)上，這是迄今為止報道的利用大腸桿菌生產(chǎn)PHB過程的搖過程的搖瓶最高值。對補(bǔ)料培養(yǎng)瓶最高值。對補(bǔ)料培養(yǎng)45h后的重組菌進(jìn)行超薄切片電鏡照后的重組菌進(jìn)行超薄切片電鏡照相，進(jìn)一步證實了相，進(jìn)一步證實了PHB可以在菌體細(xì)胞中大量

44、積累可以在菌體細(xì)胞中大量積累(見圖見圖4)。第五節(jié)第五節(jié) 原生質(zhì)體育種原生質(zhì)體育種 原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體育種技術(shù)主要有原生質(zhì)體融合、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，此外尚有原生質(zhì)體誘變育種等。變育種等。 原生質(zhì)體融合育種是基因重組的一種重要原生質(zhì)體融合育種是基因重組的一種重要方法。方法。 原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段原生質(zhì)體融合作為一種新的基因重組手段是是19781978年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討年第三屆國際工業(yè)微生物遺傳學(xué)討論會上提出來的。論會上提出來的。 一、原生質(zhì)體融合育種的特點一、原生質(zhì)體融合育種的特點( (一一) )雜交頻率較

45、高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下雜交頻率較高：細(xì)胞壁去除后在高滲條件下形成類似于球形的原生質(zhì)體。形成類似于球形的原生質(zhì)體。( (二二) )受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任受接合型或致育型的限制較?。憾H株中任何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利何一株都可能起受體或供體的作用，因此有利于不同種屬間微生物的雜交。于不同種屬間微生物的雜交。( (三三) )遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二遺傳物質(zhì)傳遞更為完整：原生質(zhì)體融合是二親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的親株的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核進(jìn)行類似的合二為一的過程。過程。 ( (四四) )存在著兩株以上親株同時參與融合形成存在著兩株以上親株同時

46、參與融合形成融合子的可能性。融合子的可能性。（五（五) )有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融有可能采用產(chǎn)量性狀較高的菌株作融合親株。合親株。 ( (六六) )提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。提高菌株產(chǎn)量的潛力較大。 ( (七七) )有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。有助于建立工業(yè)微生物轉(zhuǎn)化體系。二、原生質(zhì)體融合育種步驟二、原生質(zhì)體融合育種步驟1 1標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。標(biāo)記菌株的篩選和穩(wěn)定性驗證。2 2原生質(zhì)體制備。原生質(zhì)體制備。3 3等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。等量原生質(zhì)體加聚乙二醇促進(jìn)融合。4 4涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。涂布于再生培養(yǎng)基，再生出菌落。5 5選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證

47、，選擇性培養(yǎng)基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進(jìn)一步試驗、保藏。挑取融合子進(jìn)一步試驗、保藏。6 6生產(chǎn)性能篩選。生產(chǎn)性能篩選。原生質(zhì)體融合基本過程示意圖 細(xì)胞壁細(xì)胞壁細(xì)胞壁溶解細(xì)胞壁溶解細(xì)胞膜細(xì)胞膜營養(yǎng)細(xì)胞營養(yǎng)細(xì)胞原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合融合細(xì)胞融合細(xì)胞原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體形成原生質(zhì)體形成細(xì)胞壁再生細(xì)胞壁再生原生質(zhì)體名詞名詞原生質(zhì)體融合基本過程示意圖 三、原生質(zhì)體融合育種的要點三、原生質(zhì)體融合育種的要點（一）標(biāo)記菌種的選擇（一）標(biāo)記菌種的選擇 獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變獲得標(biāo)記菌種的方法是采用常規(guī)誘變育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或和抗藥性菌育種，篩選出營養(yǎng)缺陷型或和

48、抗藥性菌株。這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定。株。這里最重要的是標(biāo)記必須穩(wěn)定。 采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外，在實采用抗藥性菌株除可作標(biāo)記外，在實驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是驗室中還可排除雜菌污染的干擾。為的是確證融合的成功，可以采用多標(biāo)記菌種。確證融合的成功，可以采用多標(biāo)記菌種。 ( (二二) )原生質(zhì)體的制備原生質(zhì)體的制備 原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中原生質(zhì)體的制備主要是在高滲壓溶液中加入細(xì)胞壁分解酶，將細(xì)胞壁分離剝離，加入細(xì)胞壁分解酶，將細(xì)胞壁分離剝離，結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)結(jié)果剩下由原生質(zhì)膜包住的類似球狀的細(xì)胞，它保持原細(xì)胞的一切活性。胞，它保持原細(xì)胞的一切活性。

49、在放線菌和細(xì)菌中，制備原生質(zhì)體主要在放線菌和細(xì)菌中，制備原生質(zhì)體主要采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶采用溶菌酶；酵母和霉菌一般可用蝸牛酶或纖維素酶等。或纖維素酶等。 影響原生質(zhì)體制備的因素影響原生質(zhì)體制備的因素1 1菌體的前處理菌體的前處理 為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些為了使酶作用的效果好一些，可將菌作一些前處理。如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素。前處理。如細(xì)菌加入亞抑制劑量的青霉素。2 2菌體的培養(yǎng)時間菌體的培養(yǎng)時間 為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖為了使細(xì)胞易于原生質(zhì)體化，一般選擇增殖期的菌體。期的菌體。3 3 酶濃度酶濃度 對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要對于不同種屬的微生物，不僅對酶的種類要求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最求不同，就是對酶的濃度也有差異。另外，最佳酶濃