生物工藝學(xué)原理教案

1、南昌大學(xué)教學(xué)檔案課程名稱： 生物工藝原理 學(xué)院： 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院教師姓名： 熊濤 職稱： 教授 教學(xué)課時(shí)安排內(nèi)容體系教學(xué)內(nèi)容課時(shí)生物過程原理第一章 生物技術(shù)概論2第二章 菌種來源，生物活性物質(zhì)的篩選和菌和保藏2第三章 新技術(shù)育種原理及其進(jìn)展3第四章 基因工程原理3第五章 代謝調(diào)控4第六章 培養(yǎng)基2第七章 種子擴(kuò)大培養(yǎng)2第八章 培養(yǎng)技術(shù)過與過程建模2第九章 發(fā)酵工藝監(jiān)控2第十章 酶與細(xì)胞的固定化技術(shù)及其應(yīng)用2第十一章 蛋白質(zhì)組學(xué)及其在微生物研究中的應(yīng)用4第十二章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)2第十三章 植物細(xì)胞培養(yǎng)2生物物質(zhì)分離和純化原理第十四章 下游加工過程概論2第十五章 發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離方法

2、4第十六章 細(xì)胞破碎與非選擇性蛋白分離3第十七章 沉淀法2第十八章 膜分離過程4第十九章 溶劑萃取，兩水相萃取法4第二十章 離子交換法3第二十一章 吸附法與色層分離4第二十二章 電泳分離法4第二十三章 結(jié)晶與干燥2合計(jì)64課程教材：儲(chǔ)炬、李友榮主編，現(xiàn)代生物工藝學(xué)（上冊(cè)），華東理東大學(xué)出版社，2007主要參考書：1 陳代杰, 朱寶泉. 工業(yè)微生物菌種選育與發(fā)酵控制技術(shù). 上海: 科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社, 1995.2 美C.賈德森.金. 分離過程. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，19903 劉茉娥等. 新型分離技術(shù)基礎(chǔ). 杭州：浙江大學(xué)出版社，19934 王學(xué)松. 膜分離技術(shù)及其應(yīng)用. 北京：科學(xué)出版社，

3、19945 陸九芳等. 分離過程化學(xué). 北京：清華大學(xué)出版社，19946 劉國詮. 生物工程下游技術(shù).北京： 化學(xué)工業(yè)出版社, 2003. 7 Weather L R. Engineerin Processes for Bioseparation. London: Butterworth-Heineman, 1994第一部分 生物過程原理（共32學(xué)時(shí)）第一章 緒論教學(xué)基本要求：使學(xué)生掌握生物工藝學(xué)的定義，特點(diǎn)，生物技術(shù)概念的范疇，了解生物技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用概況，了解生物技術(shù)在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用及發(fā)展趨勢，激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)生物工藝原理的興趣。教學(xué)內(nèi)容：1.1 生物技術(shù)的定義 1919年匈牙利艾里基提出：“

4、凡是以生物機(jī)體為原料，無論其用何種生產(chǎn)方法進(jìn)行產(chǎn)品生產(chǎn)的生物技術(shù)”都屬于生物技術(shù)； 20世紀(jì)70年代末，80年代初提出的定義傾向于：必須采用基因工程等一類具有現(xiàn)代生物技術(shù)內(nèi)涵或以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的技術(shù)； 國際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（IECDO）在1982年提出定義：應(yīng)用自然科學(xué)和工程學(xué)的原理，依靠生物作用劑的作用，將物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品或用以為社會(huì)服務(wù)的技術(shù)； 在國際經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（IECDO）提出生物技術(shù)定義的特點(diǎn)：生物作用劑：指從活的或死的微生物、動(dòng)物或植物的機(jī)體、組織、細(xì)胞、體液以致分泌物以及上組分中提取出來的生物催化劑酶或其他生物活性物質(zhì)；提供的產(chǎn)品：可以是工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等產(chǎn)

5、品；被作用的物料：可以是有關(guān)的生物機(jī)體或其中的有關(guān)器官，如細(xì)胞、體液以及極少量必須的無機(jī)物質(zhì)；應(yīng)用的自然科學(xué)：可以是生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)等以及相關(guān)的分支學(xué)科，交叉學(xué)科；應(yīng)用的工程學(xué)：可以是化學(xué)工程、機(jī)械工程、電氣工程、電子工程；1.2 生物技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用概況生物技術(shù)的發(fā)展分為四個(gè)時(shí)期：經(jīng)驗(yàn)生物技術(shù)時(shí)期；近代生物技術(shù)的形成和發(fā)展時(shí)期；近代生物技術(shù)的全盛時(shí)期，現(xiàn)代生物技術(shù)的建立和發(fā)展時(shí)期；1.2.1 經(jīng)驗(yàn)生物技術(shù)時(shí)期 （人類出現(xiàn)到19世紀(jì)中期）生物技術(shù)的發(fā)展和利用可以追溯到1000多年（甚至4000多年）以前如酒類的釀造，豆糧輪作的方法等，主要產(chǎn)品有果酒、酸奶、啤酒、大豆釀醬油，多種植物配制劑麻

6、沸散等。經(jīng)驗(yàn)生物技術(shù)時(shí)期的技術(shù)為其后生物技術(shù)相關(guān)理論的建立創(chuàng)造了條件。1.2.2 近代生物技術(shù)建立時(shí)期 （19世紀(jì)中期至20世紀(jì)40年代）這一時(shí)期的誕生是與顯微鏡的誕生和微生物的發(fā)展以及微生物學(xué)的問世密切相關(guān)的。20世紀(jì)初，人們發(fā)現(xiàn)某些梭菌能夠引起丙酮、丁醇的發(fā)酵，隨之引發(fā)了一系列初級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。這一時(shí)期是人類有意識(shí)地利用某些微生物進(jìn)行生產(chǎn)的時(shí)期， 這一時(shí)期的發(fā)酵產(chǎn)物的特點(diǎn)：都屬于微生物形成的初級(jí)代謝產(chǎn)物，發(fā)酵以厭氧發(fā)酵居多，發(fā)酵產(chǎn)品主要為某些有機(jī)溶劑。這一時(shí)期進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)的發(fā)酵產(chǎn)品有乳酸、酒精、面包酵母、檸檬酸和蛋白酶等。1.2.3 近代生物技術(shù)全盛時(shí)期 （20世紀(jì)40年代至20世紀(jì)7

7、0年代末）1929年Flemming發(fā)現(xiàn)了青霉素，從此生產(chǎn)技術(shù)產(chǎn)品中增加一大類新的產(chǎn)品抗生素。第二次世界大戰(zhàn)促進(jìn)許多科學(xué)家和工程師齊心協(xié)力，攻克許多難關(guān)，實(shí)現(xiàn)了青霉素的工業(yè)化生產(chǎn)。20世紀(jì)40年代，抗生素工業(yè)成為生物發(fā)酵工業(yè)技術(shù)的支柱產(chǎn)業(yè)。這一時(shí)期生物技術(shù)的發(fā)展主要成就有：青霉素的發(fā)現(xiàn)及其開發(fā)概況、酶反應(yīng)過程和生物轉(zhuǎn)化的過程的開發(fā)概況等，為基因工程的建立和新的生物技術(shù)時(shí)期的來臨創(chuàng)造條件。區(qū)分初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物初級(jí)代謝產(chǎn)物：指微生物處于對(duì)數(shù)生長期所形成的產(chǎn)物，主要是與細(xì)胞生長有關(guān)的產(chǎn)物，如氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)、碳水化合物以及能量代謝有關(guān)的副產(chǎn)品，如乙醇、丙酮、丁醇等。次級(jí)代謝產(chǎn)物：次生代

8、謝物的產(chǎn)生與產(chǎn)生這種產(chǎn)物的微生物本身的生長和生命活動(dòng)并不是密切相關(guān)的，它們一般產(chǎn)生于微生物生長的穩(wěn)定期，他們的結(jié)構(gòu)往往非常復(fù)雜。1.2.4 現(xiàn)代生物技術(shù)建立和發(fā)展時(shí)期 （20世紀(jì)70年代末開始）現(xiàn)代生物技術(shù)時(shí)期是以分子生物學(xué)的理論為先導(dǎo)，基因工程的技術(shù)開始能作為生物技術(shù)新產(chǎn)品的一種開發(fā)手段或關(guān)鍵技術(shù)后算起的。80年代以來，隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，人們可以按人類社會(huì)的需要，定向培養(yǎng)出有用的菌株，這為發(fā)酵工程技術(shù)引入了遺傳工程的技術(shù)，使生物技術(shù)進(jìn)入了一個(gè)新的階段?；蚬こ痰膽?yīng)用首先集中于許多多肽或蛋白質(zhì)的生化藥物中，如胰島素、干擾素等。這一時(shí)期生物技術(shù)的發(fā)展主要有：單克隆抗體的發(fā)展和應(yīng)用；動(dòng)、植

9、物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用；雜交技術(shù)在動(dòng)植物生產(chǎn)中的應(yīng)用；轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物的研究和開發(fā)，克隆動(dòng)物的發(fā)展及取得的成就等方面。1.3 生物技術(shù)的發(fā)展趨勢1.3.1. 深入開展人類后基因組學(xué)的研究，逐步掌握人類生、老、病、死的自然規(guī)律有關(guān)后基因組學(xué)的研究概括講就是：首先要將完成圖的堿基對(duì)序列中所有的基因識(shí)別出來，其次要鑒別每一個(gè)基因的生物化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，最后要搞清所有基因與人類生、老、病、死的關(guān)系。后基因組學(xué)的研究主要包括：結(jié)構(gòu)基因組學(xué)、功能基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)。1.3.2. 逐步深入的開展基因診斷和基因治療研究基因診斷是通過基因工程的手段對(duì)生物體的基因組DNA片段及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析；基因治療

10、是以正?；蛲ㄟ^病毒載體原位轉(zhuǎn)入病人體內(nèi)以取代原來缺陷或病變的基因，也可以是使原來喪失表達(dá)能力或使原來喪失表達(dá)能力或使機(jī)體產(chǎn)生免疫基因已達(dá)到抗腫瘤、抗病毒的目的。1.3.3 加強(qiáng)各種生物技術(shù)新藥物的研究開發(fā)加強(qiáng)對(duì)重組激素、重組細(xì)胞因子、從足溶血栓物質(zhì)、治療性抗體的研究開發(fā)。1.3.4. 人類干細(xì)胞培養(yǎng)或胚胎工程的發(fā)展人類干細(xì)胞可分為兩類：全能性干細(xì)胞和多能性干細(xì)胞；前者能發(fā)育成完整的個(gè)體，后者只能發(fā)育成人體某一臟器或組織，如肝臟、腎臟、心臟或骨胳、皮膚、肌肉等。人類胚胎干細(xì)胞來自早期胚胎，這些全能型干細(xì)胞后來發(fā)育成多能性干細(xì)胞。1.3.5 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的發(fā)展，克隆動(dòng)物的發(fā)展成就轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是通過基

11、因工程手段獲得在基因中整合了外源基因的動(dòng)物?？寺?dòng)物是指通過無性繁殖的手段復(fù)制而誕生的動(dòng)物，其外形和生理性狀均與其供體細(xì)胞相同的動(dòng)物。1.3.6 加速對(duì)人類功能基因的研究開發(fā)由于功能基因?qū)θ祟惖慕】狄约八幬镅芯块_發(fā)的關(guān)系密切，因此各國科學(xué)家相互爭先把已知的功能基因進(jìn)行相當(dāng)深入的研究以獲得發(fā)明專利權(quán)。1.3.7 基因農(nóng)作物為農(nóng)作物方面的發(fā)展前景轉(zhuǎn)基因農(nóng)作的重點(diǎn)發(fā)展方向是：抗蟲害的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；尋找新的抗病毒基因并將其轉(zhuǎn)入一些重要農(nóng)作物中；抗干旱、抗鹽堿、抗重金屬、抗水澇、抗寒凍等的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物；1.3.8 加強(qiáng)與環(huán)境保護(hù)學(xué)科的合作研究主要集中在對(duì)環(huán)境污染的生物治理。 1.3.9 積極開展海洋生物

12、技術(shù)的研究1.3.10 大力發(fā)展與生物技術(shù)相關(guān)的工程技術(shù)學(xué)科的研究第二章 菌種來源教學(xué)基本要求：使學(xué)生掌握典型微生物新種分離篩選過程，微生物選擇性分離的原理和發(fā)展，并了解常見的工業(yè)微生物及其用途。教學(xué)內(nèi)容：2.1 微生物的特點(diǎn) 微生物的資源非常豐富，廣泛分布于土壤，水和空氣中，尤其土壤中最多。 有的微生物從自然界中分離出來就能被利用，有的需要對(duì)分離到的微生菌種進(jìn)行人工誘變，得到突變株才能被利用。 微生物的特點(diǎn)是：種類多，分布廣；生長迅速，繁殖速度快；代謝能力強(qiáng)；適應(yīng)性強(qiáng)，容易培養(yǎng)。2.2 常見的工業(yè)微生物2.2.1 細(xì)菌工業(yè)常用細(xì)菌有：枯草芽孢桿菌，醋酸桿菌，棒狀桿菌，端桿菌等； 用途：用于生

13、產(chǎn)淀粉酶，乳酸，氨基酸和肌苷等。2.2.2 酵母菌工業(yè)常用酵母菌有：啤酒酵母，假絲酵母，類酵母等。用途：釀酒，制造面包，生產(chǎn)脂肪酶以及生產(chǎn)可食用，藥用和飼料用酵母菌蛋白等。2.2.3 霉菌 工業(yè)常用霉菌有：藻狀菌綱的根霉，毛霉，犁頭霉，子囊霉綱的紅曲霉，半知菌類的曲霉，青霉等。 用途：多種酶制劑，抗生素，有機(jī)酸及輜體激素等。2.2.4 放線菌 工業(yè)常用放線菌有：鏈霉菌屬，小單孢菌屬和諾長菌屬等。 用途：產(chǎn)生抗生素，微生物中發(fā)現(xiàn)的抗生素，有60%來自放線菌。2.2.5 擔(dān)子菌 通常所說的菇類微生物。 用途：多糖，橡膠物質(zhì)和抗癌藥物的開發(fā)。2.2.6 藻類 自然界分布極廣的一類自養(yǎng)微生物。 人類保

14、健食品和飼料，（螺旋藻）環(huán)境治理，產(chǎn)生能源。2. 3 典型的微生物新種分離篩選過程分離微生物新種的具體過程大體可分為采樣、增殖、純化和性能測定等步驟，如下圖所示。2.4 微生物選擇性分離的原理和發(fā)展在過去的半個(gè)世紀(jì)里曾篩選出許多產(chǎn)生新的有用的刺激代謝產(chǎn)物的菌種，這些菌種多半是利用經(jīng)驗(yàn)式的篩選方法獲得的。大多數(shù)的抗生素均由放線菌綱產(chǎn)生。下面介紹以放線菌為主的分離方法原理的發(fā)展。選擇性分離方法大致分為五個(gè)步驟：含微生物材料的選擇；材料的預(yù)處理；所需菌種的分離；菌種的培養(yǎng)；菌種的選擇和純化。以上任何一個(gè)階段都可以引入選擇壓力。2.4.1 微生物材料的選擇在選擇菌種來源時(shí)，存在以下一些標(biāo)準(zhǔn)： 對(duì)于天然

15、材料，如土壤的選擇，來源越是廣泛的樣品，含有目的微生物的可能性就越大，越有可能獲得新的菌種；可尋找已適應(yīng)相當(dāng)苛刻的環(huán)境壓力的微生物類群；在酸性土壤圈的放線菌類群與緊接下層的中性圈的放線菌類群有很大的不同；自然環(huán)境的菌群可因?yàn)槿祟惢顒?dòng)而改變；更新的生態(tài)環(huán)境有待于進(jìn)一步開發(fā)。2.4.2 材料的預(yù)處理為了提高菌種的分離效果，人們?cè)O(shè)計(jì)了各種處理材料的方法，有物理方法、化學(xué)方法和生物方法。物理方法：加熱，過路，離心，沉淀池中攪拌。化學(xué)方法：加幾丁質(zhì)或碳酸鈣提高PH。誘餌法：花粉，蛇皮，人的頭發(fā)，涂石蠟的棒。2.4.3 所需菌種的分離所需菌種的分離效率取決于分離培養(yǎng)基的養(yǎng)分、pH和加入的選擇性抑制劑。一般

16、憑經(jīng)驗(yàn)而不是絕對(duì)的選擇。培養(yǎng)基養(yǎng)分：幾丁質(zhì)（用來分離土壤或水中的放線菌），淀粉羅素（和幾丁質(zhì)相類同），M3群脂(阻滯鏈霉素的生長，容易分離到其他霉菌)。PH值： (1) 6.77.5之間（大多數(shù)放線菌，嗜中型） (2) 4.55.0（嗜酸性） (3) 6.16.8（嗜堿性)選擇抑制劑：抗細(xì)菌抗生素，抗真菌抗生素；分離培養(yǎng)基中加入抗生素。2.4.4 菌種的培養(yǎng)溫度，時(shí)間兩方面主要變量為時(shí)間。放線菌平板通常在25-30； 嗜熱菌通常在45-55； 嗜冷菌通常在4-10； 在此三者中可加入時(shí)間變量。分離嗜溫菌如鏈霉菌和小單胞菌一般培養(yǎng)714天；嗜熱菌如高溫放線菌只需12天。有時(shí)培養(yǎng)時(shí)間短會(huì)漏掉一些新

17、的和不尋常的菌種，因此有人在30和40將培養(yǎng)時(shí)間延長1個(gè)月，結(jié)果分離出一些不尋常的種屬。2. 5 重要工業(yè)微生物的分離篩選具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的微生物的第一個(gè)階段是分離，分離是指獲得純的或混合的培養(yǎng)物。接著篩選出那些能產(chǎn)生所需產(chǎn)物或具有某種生化反應(yīng)的菌種。在篩選所需菌種時(shí)宜考慮：（1）菌的營養(yǎng)特性；（2）菌的生長溫度，應(yīng)選擇溫度高于40的菌種；(3)菌對(duì)所采用的設(shè)備和生產(chǎn)過程的適應(yīng)性；（4）菌的穩(wěn)定性；（5）菌的產(chǎn)物的率；（6）容易從培養(yǎng)液中回收產(chǎn)物。理想的分離步驟是從土壤環(huán)境開始的，土壤中富于各種分離的菌。設(shè)計(jì)的分離步驟應(yīng)有利于具有工業(yè)重要特征的菌的生長。2. 5.1 施加選擇壓力的分離方法

18、 富集液體培養(yǎng)只能增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)。方法的原理是：給混合菌群提供一些有利于所需菌種生長或不利于其他菌型生長的條件。供給特殊基質(zhì)或加入某些抑制劑。液體培養(yǎng)（分批富集，連續(xù)富集） 固體培養(yǎng)基的使用常用于分離某些酶產(chǎn)生菌，其選擇培養(yǎng)基中常含有所需的基質(zhì)，以便促進(jìn)酶產(chǎn)生菌的生長。2. 5.2 隨機(jī)分離方法有些微生物的產(chǎn)物對(duì)產(chǎn)生菌的篩選沒有任何選擇性優(yōu)勢，可以用采用隨機(jī)分離法獲得所需菌種。隨機(jī)分離法發(fā)展了一些快速篩選方法和歸納出高產(chǎn)培養(yǎng)基成分的選擇性準(zhǔn)則如下：1 制備一系列培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長限制因素；2 使用一聚合或復(fù)合形式的生長限制養(yǎng)分；3 避免使用容易同化的碳；

19、4 確定含有所需的輔因子， 加入緩沖液以減少pH變化。 例如：抗生素產(chǎn)生菌的篩選；藥理活性化合物的篩選；生長因子產(chǎn)生菌的篩選；多糖產(chǎn)生菌的篩選。第三章 新技術(shù)育種原理及其進(jìn)展教學(xué)基本要求：使學(xué)生掌握幾種常用的工業(yè)微生物育種方法。教學(xué)內(nèi)容：3.1 重要工業(yè)微生物的分離篩選具有潛在工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的微生物的第一個(gè)階段是分離，分離是指獲得純的或混合的培養(yǎng)物。接著篩選出那些能產(chǎn)生所需產(chǎn)物或具有某種生化反應(yīng)的菌種。3.1.1理想工業(yè)微生物應(yīng)具備的條件（1）遺傳性狀穩(wěn)定；（2）生長速度快，不易被噬菌體等污染；（3）目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量盡可能接近理論轉(zhuǎn)化率； （4）目標(biāo)產(chǎn)物最好能分泌到胞外，以降低產(chǎn)物抑制并利 于產(chǎn)物

20、分離； （5）盡可能減少產(chǎn)物類似物的產(chǎn)量，以提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量及利于產(chǎn)物分離； （6）培養(yǎng)基成分簡單、來源廣、價(jià)格低廉； （7）對(duì)溫度、pH、離子強(qiáng)度、剪切力等環(huán)境因素不敏感； （8）對(duì)溶氧的要求低，便于培養(yǎng)及降低能耗。 3.2 菌種選育目前菌種選育常采用自然選育和誘變育種等方法，隨著微生物學(xué)、生化遺傳學(xué)的發(fā)展出現(xiàn)了轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、原生質(zhì)體融合、代謝調(diào)控和基因工程較為定向的方法。經(jīng)典育種：自然選育和誘變育種。菌種選育常采用。定向育種：轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，接合，原生質(zhì)體融合，代謝調(diào)控，基因工程。3.2.1自然選育生產(chǎn)中，不經(jīng)過人工處理，利用菌種的自然突變而進(jìn)行菌種篩選的過程叫自然選育。一般認(rèn)為引起自然

21、突變的原因有兩個(gè)：多因素低劑量的誘變效應(yīng)和互變異構(gòu)效應(yīng)。自然突變有兩種情況： 菌種衰退，對(duì)生產(chǎn)無利的突變，對(duì)生產(chǎn)有利的突變的。自然選育優(yōu)缺點(diǎn)： 優(yōu)點(diǎn)：是簡單易行；缺點(diǎn)：效率低、進(jìn)展慢。3.2.2 誘變育種3.2.2.1 誘變育種的基本原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變。突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。誘發(fā)突變是指用各種物理、化學(xué)因素人工誘發(fā)的基因突變。其中誘發(fā)突變的變異幅度大大高于自然突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學(xué)的和生物的三大類。3.2.2.2 誘變育種的一般步驟誘變育種的整個(gè)流程包括：誘變和篩選兩個(gè)部分。誘發(fā)所形成的突變與菌種本身的遺傳背景、誘變劑種類及劑

22、量的選擇和合理使用方法均有密切的關(guān)系。3.2.2.3 誘變育種工作中應(yīng)該注意的幾個(gè)問題 選擇好出發(fā)菌種 復(fù)合誘變因素的使用 劑量的選擇 出發(fā)菌株的篩選 高產(chǎn)菌株的獲得需要篩選條件的配合3.3 原生質(zhì)體融合3.3.1 原生質(zhì)體融合技術(shù)原生質(zhì)體融合是通過人工方法，使遺傳性狀不同的兩個(gè)細(xì)胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并產(chǎn)生重組子的過程。該技術(shù)始于1976年,最早是在動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)展起來的，后來，在酵母菌、霉菌、高等植物、以及細(xì)菌和放線菌中也得到了應(yīng)用。3.3.2 原生質(zhì)體融合技術(shù)步驟：3.4 基因工程技術(shù)（第四章中詳細(xì)介紹）3.4.1 基因工程育種技術(shù)定義基因工程是用人為的方法將所需的某一供體生物的遺傳物

23、質(zhì)DNA分子提取出來，在離體條件下切割后，把它與作為載體的DNA分子連接起來，然后導(dǎo)入某一受體細(xì)胞中，讓外來的遺傳物質(zhì)在其中進(jìn)行正常的復(fù)制和表達(dá)，從而獲得新物種的一種嶄新的育種技術(shù)。3.4.2 主要步驟3.5 菌種的篩選方法3.5.1 一次性篩選法定義：對(duì)出發(fā)菌株完全致死的環(huán)境中，一次性篩選出少量抗性變異株。（1）抗噬菌體菌株篩選：噬菌體數(shù)大于菌體細(xì)胞數(shù)，平板分離。誘變選育，平板分離：敏感菌株經(jīng)誘變因素處理，然后將處理過的孢子液分離在含有高濃度的噬菌體的平板培養(yǎng)基上，經(jīng)處理后的存活的孢子中，如存在抗性變異菌株就能在此平板上生長。誘變育種、液體培養(yǎng)、平板分離：誘變因素處理后接入種子培養(yǎng)基，待菌絲

24、長濃后加入高濃度的噬菌體再繼續(xù)培養(yǎng)幾天；再加入噬菌體反復(fù)感染，使敏感菌被噬菌體所裂解，最后取出菌絲進(jìn)行平板分離，從中篩選抗性菌株。 2）耐高溫菌株篩選：節(jié)約冷卻水，減少染菌。 方法：一定高溫處理一段時(shí)間，再分離。敏感菌株被大量殺死，殘存的細(xì)胞則對(duì)高溫有較好的耐受性。3）耐高濃度酒精酵母菌的篩選，用于濃醪發(fā)酵。 方法：加入高濃度酒精。4）耐高滲透壓酵母菌株篩選，用于甘油發(fā)酵。方法：添加蔗糖。3.5.2 其他篩選方法3.5.2.1 條件抗性突變型的篩選3.5.2.2 抗藥性突變株的篩選1）梯度平板法2）紙片擴(kuò)散法 第四章 基因工程原理教學(xué)基本要求：使學(xué)生掌握基因工程原理及操作過程，并深入了解運(yùn)用基

25、因工程技術(shù)育種的方法。教學(xué)內(nèi)容：4.1 重要的工具酶 基因工程中的工具酶主要是指用于DNA和RNA分子的 切割、連接、聚合、修飾、反轉(zhuǎn)錄等 有關(guān)的各種酶系統(tǒng)。4.1.1限制性核酸內(nèi)切酶是一類由細(xì)菌產(chǎn)生的能專一識(shí)別雙鏈DNA中的特定堿基序列、并水解該點(diǎn)磷酸二酯鍵 的核酸內(nèi)切酶，簡稱限制酶或切割酶。根據(jù)限制酶的作用特性，一般分為三類：（3個(gè)亞基）、（單條肽鏈）和（多亞基蛋白）型，其中常用的是型限制酶。限制酶（型）識(shí)別及切割位點(diǎn)特異識(shí)別及切割48個(gè)bp長度且具有回文序列的DNA片斷，主要產(chǎn)生3種缺口： 5粘性末端，3粘性末端，平端或鈍端?；匚男蛄校菏侵冈摬课坏暮塑账嵝蛄谐?80O旋轉(zhuǎn)對(duì)稱;其特點(diǎn)是在

26、該段的堿基序列的互補(bǔ)鏈之間正讀反讀都相同（并非在同一條鏈上正讀反讀）。例如5GGTACC3 粘性末端：是指經(jīng)內(nèi)切酶特異切割后產(chǎn)生的5末端突出或3末端突出的堿基序列相互具有互補(bǔ)性。4.1.1.1同裂酶又稱異源同工酶。指來源不同，但具有相同的識(shí)別序列。在切割DNA時(shí)，其切割點(diǎn)可以是相同的，產(chǎn)生平頭末端，稱為同識(shí)同切；切割點(diǎn)也可以是不同的，產(chǎn)生3或5粘性末端，稱為同識(shí)異切。4.1.1.2 同尾酶 指來源不同，但識(shí)別與切割順序有一定的相關(guān)性的一類酶。它們作用后產(chǎn)生相同的粘性末端。 4.1.2 DNA聚合酶最常用的DNA聚合酶有以下4種：DNA聚合酶；DNA聚合酶大片段Klenow片段；Taq DNA聚

27、合酶；T4 噬菌體DNA聚合酶。（一） DNA聚合酶E.Coli DNA聚合酶（DNA pol ） 是一個(gè)具有3 種酶活性的多功能性酶。包括：53DNA 聚合酶活性；53核酸外切酶活性；35核酸外切酶活性。DNA pol 應(yīng)用： 催化DNA缺口平移反應(yīng)，制備高比活性DNA探針；第二條cDNA鏈的合成； 對(duì)DNA3突出末端進(jìn)行標(biāo)記； DNA序列分析。 （二）Klenow片段（DNA pol.大片斷） （三） Taq DNA pol（耐熱DNA聚合酶）作用特點(diǎn)1）Taq DNA pol催化DNA合成的最適溫度范圍70- 75，2）95以上高溫，半小時(shí)不失活， 3）最適合用于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）。

28、4.1.3逆轉(zhuǎn)錄酶特點(diǎn)： 由兩條肽鏈組成，其中一條同時(shí)具有53DNA聚合酶活性和53RNA外切酶活性。逆轉(zhuǎn)錄酶是一個(gè)多功能性酶，至少具有以下3種酶活性：以單鏈RNA 為模板， 催化合成cDNA單鏈具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA雜交鏈中的RNA以DNA為模板，催化合成cDNA雙鏈。4.1.4 DNA連接酶DNA連接酶可以催化帶有粘性末端或平頭末端的雙鏈DNA中一條鏈的3OH與另一條鏈的5PO3H2形成磷酸二酯鍵而相連，從而構(gòu)成一條完整的DNA長鏈。最常用的DNA連接酶是T4連接酶，是在T4噬菌體感染的大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的了分離的。T4連接酶不僅適用于DNA之間的粘性末端連接，也可以適

29、用于平末端的連接。催化反應(yīng)時(shí)需要Mg2+和ATP。4.1.5堿性磷酸酶堿性磷酸酶(BAP) 能夠催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基團(tuán)。4.2基因克隆常用的載體載體是將外源DNA(目的DNA)片斷引入宿主細(xì)胞的運(yùn)載工具，其化學(xué)本質(zhì)為DNA 。4.2.1載體必須具備的基本條件1） 有自身的復(fù)制子，能獨(dú)立復(fù)制2）具備多個(gè)限制酶的識(shí)別位點(diǎn)(多克隆位點(diǎn))3） 具有遺傳表型或篩選標(biāo)記4） 有足夠的容量以容納外源DNA片段。5） 表達(dá)型載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動(dòng)子、前導(dǎo)序列、增強(qiáng)子等調(diào)控元件。6） 載體DNA中均有一段非必需區(qū)，將外源基因插入該非必需區(qū)，而載體本身不受影響。4.2.2載體的種類

30、一般來說，載體是通過改造天然質(zhì)粒、噬菌體和病毒構(gòu)建而成。（一）克隆載體：用來克隆和擴(kuò)增DNA片段的載體，具有3點(diǎn)共性： 能夠在受體細(xì)胞復(fù)制； 帶有藥物抗性基因，便于篩選； 可導(dǎo)入受體細(xì)胞。（二）表達(dá)載體：除具有克隆載體所具有的性質(zhì)外，還帶有表達(dá)構(gòu)件轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須的DNA順序，以保證外源基因的表達(dá)。4.2.3 常用的載體4.2.3.1 質(zhì)粒是存在于細(xì)菌染色體外的、能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子。作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備以下特點(diǎn)：1）分子量相對(duì)較小，能穩(wěn)定存在于細(xì)菌體內(nèi)，有較高的拷貝數(shù)2）具有1個(gè)以上的遺傳標(biāo)志，便于篩選3）具有多克隆位點(diǎn)廣泛應(yīng)用的質(zhì)粒：pBR322質(zhì)粒、pUC系列等pBR322

31、質(zhì)粒特點(diǎn)： 4363 bp含一個(gè)復(fù)制點(diǎn)含一個(gè)抗氨卞青霉素標(biāo)記(ampR)一個(gè)抗四環(huán)素標(biāo)記 (tetR) ampR和tetR基因內(nèi)各有一些限制酶的酶切位點(diǎn)，供外源基因插入當(dāng)外原基因插入抗藥基因位點(diǎn)時(shí)，AmpRAmp敏感(AmpS )、TetRTet敏感(TetS). pUC系列質(zhì)粒特點(diǎn)：由pBR322和M13噬菌體構(gòu)建而成的雙鏈質(zhì)粒載體；1）2674bp；2）有ampr和與M13噬菌體相同的多克隆位點(diǎn)（MCS）；3）有一個(gè)來自大腸桿菌的LacZ操縱子的DNA片斷, 編碼半乳糖苷酶。4.3.2.2 噬菌體組成特點(diǎn)：雙鏈線狀DNA分子，全長50kb，含65個(gè)基因，在其分子兩端各含有12個(gè)堿基的互補(bǔ)單

32、鏈，是天然的粘性末端，被稱為COS位點(diǎn)。 噬菌體結(jié)構(gòu)噬菌體感染細(xì)菌后的溶菌性生長和溶源性生長： 溶菌性生長（lytic pathway） 溶源性生長(lysogenic pathway) 4.3重組DNA基本原理DNA重組基本過程分獲取目的基因和載體；接目的基因與載體的連接；轉(zhuǎn)重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞篩重組DNA的篩選與鑒定。4.3.1目的基因的獲?。ǚ郑┠康幕騺碓矗?1） 制備基因組DNA；2）制備cDNA；3）聚合酶鏈反應(yīng)；4）人工合成基因。4.3.2目的基因與載體的連接（接）主要有以下3種連接方式：1)粘性末端連接 2）平頭末端連接 3）人工接頭法4.3.3重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞（轉(zhuǎn)）依

33、據(jù)重組載體不同可分為：1）轉(zhuǎn)化：以質(zhì)粒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；2）轉(zhuǎn)染：以病毒作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程；3）轉(zhuǎn)導(dǎo)：以噬菌體作載體構(gòu)建的重組體導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程。4.3.4重組DNA的篩選與鑒定（篩）篩選含重組體的陽性菌落，一般有下列幾種方法：（一）平板篩選是指利用載體的遺傳性標(biāo)記直接篩選的方法。 如，具有抗藥性標(biāo)記的載體，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后，能在含抗生素（Amp或Tet）的培養(yǎng)平板上生長；未轉(zhuǎn)化的則不能生長。有插入失活和藍(lán)白斑篩選兩種。（二）限制性內(nèi)切酶圖譜鑒利用限制性核酸內(nèi)切酶分析法可以進(jìn)一步篩選鑒定重組子，而且能夠判斷外源DNA片段的插入方向以及大小。（三）PCR篩選

34、重組體 抽提少量重組DNAPCR擴(kuò)增電泳鑒定序列分析。（四）菌落（噬菌斑）原位雜交技術(shù)4.4重組技術(shù)在醫(yī)學(xué)和制藥工業(yè)中的應(yīng)用1）疾病基因的發(fā)現(xiàn)；2）生產(chǎn)蛋白質(zhì)和多肽類活性物質(zhì)；3）制備基因工程疫苗；4）改良物種特性；5）動(dòng)物克隆。第五章 代謝調(diào)控教學(xué)基本要求：使學(xué)生了解微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)。教學(xué)內(nèi)容：第一節(jié) 微生物的代謝調(diào)控了解微生物的代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)不僅有理論意義，更重要的是能有目的地改造微生物和為微生物提供最適合的環(huán)境條件，使微生物能最大限度地生產(chǎn)人類所需的代謝產(chǎn)品。5.1代謝調(diào)控部位（調(diào)節(jié)方式）微生物的代謝調(diào)節(jié)主要通過養(yǎng)分的吸收排泄、限制基質(zhì)與酶的接近和控制代謝流等幾個(gè)部位實(shí)現(xiàn)的，在這方面真

35、核生物與原核生物略有區(qū)別，主要表現(xiàn)在前者有各種各樣的細(xì)胞器。其中以調(diào)節(jié)代謝流的方式最為重要，它包括兩個(gè)方面，一是“粗調(diào)”，即調(diào)節(jié)酶的合成量，二是“細(xì)調(diào)”，即調(diào)節(jié)現(xiàn)成酶分子的催化活力，兩者往往密切配合和協(xié)調(diào)，以達(dá)到最佳調(diào)節(jié)效果。5.2酶合成的調(diào)節(jié)酶合成的調(diào)節(jié)是通過調(diào)節(jié)酶合成的量來控制微生物代謝速度的調(diào)節(jié)機(jī)制。這類調(diào)節(jié)在基因轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行，對(duì)代謝活動(dòng)的調(diào)節(jié)是間接的、也是緩慢的。酶合成的調(diào)節(jié)主要有兩種類型：酶的誘導(dǎo)和酶的阻遏。5.2.1誘導(dǎo)按照酶的合成與環(huán)境影響的不同關(guān)系，可以將酶分為兩大類，一類稱為組成酶(Structural enzymes)，它們的合成與環(huán)境無關(guān)，隨菌體形成而合成，是細(xì)胞固有的

36、酶，在菌體內(nèi)的含量相對(duì)穩(wěn)定。如糖酵解途徑(EMP)有關(guān)的酶。另一類酶稱為誘導(dǎo)酶(Inducible enzyme)或適應(yīng)性酶，只有在環(huán)境中存在誘導(dǎo)劑(Inducer)時(shí)，它們才開始合成，一旦環(huán)境中沒有了誘導(dǎo)劑，合成就終止。誘導(dǎo)酶：在對(duì)數(shù)生長期的大腸桿菌(E.coli)培養(yǎng)基中加入乳糖，就會(huì)產(chǎn)生與乳糖代謝有關(guān)的 -半乳糖苷酶和半乳糖苷透過酶等。這時(shí)，細(xì)胞生長速度和總的蛋白質(zhì)合成速度幾乎沒有改變，這種環(huán)境物質(zhì)促使微生物細(xì)胞中合成酶蛋白的現(xiàn)象稱為酶的誘導(dǎo)。5.2.2酶合成的阻遏在某代謝途徑中，當(dāng)末端產(chǎn)物過量時(shí)，微生物的調(diào)節(jié)體系就會(huì)阻止代謝途徑中包括關(guān)鍵酶在內(nèi)的一系列酶的合成，從而徹底地控制代謝，減少

37、末端產(chǎn)物生成，這種現(xiàn)象稱為酶合成的阻遏。合成可被阻遏的酶稱為阻遏酶(repressible enzyme)。阻遏的生理學(xué)功能是節(jié)約生物體內(nèi)有限的養(yǎng)分和能量。酶合成的阻遏主要有末端代謝產(chǎn)物阻遏和分解代謝產(chǎn)物阻遏兩種類型末端代謝產(chǎn)物阻遏：由于某代謝途徑末端產(chǎn)物的過量積累而引起酶合成的(反饋)阻遏稱為末端代謝產(chǎn)物阻遏。通常發(fā)生在合成代謝中，特別是在氨基酸、核苷酸和維生素的合成途徑中十分常見。生物合成末端產(chǎn)物阻遏的特點(diǎn)是同時(shí)阻止合成途徑中所有酶的合成。末端代謝產(chǎn)物阻遏的機(jī)制也可以用操縱子學(xué)說解釋。分解代謝物阻遏：當(dāng)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在兩種可利用底物(碳源或氮源)時(shí)，利用快的底物會(huì)阻遏與利用慢的底物有關(guān)的酶合

38、成。現(xiàn)在知道，這種阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的結(jié)果，而是由這種底物分解過程中產(chǎn)生的中間代謝物引起的，所以稱為分解代謝物阻遏。5.2.3乳糖操縱子大腸桿菌的乳糖操縱子含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼-半乳糖苷酶、透酶、乙?；D(zhuǎn)移酶，此外還有一個(gè)操縱序列O、一個(gè)啟動(dòng)序列P及一個(gè)調(diào)節(jié)基因?；蚓幋a一種阻遏蛋白，后者與O序列結(jié)合，使操縱子受阻遏而處于轉(zhuǎn)錄失活狀態(tài)。在啟動(dòng)序列P上游還有一個(gè)分解（代謝）物基因激活蛋白CAP結(jié)合位點(diǎn)，由P序列、O序列和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成LAC操縱子的調(diào)控區(qū)，三個(gè)酶的編碼基因即由同一調(diào)控區(qū)調(diào)節(jié)，實(shí)現(xiàn)基因產(chǎn)物的協(xié)調(diào)表達(dá)。阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié) ： cAMP的正性調(diào)節(jié)：

39、當(dāng)沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時(shí)，cAMP與CAP結(jié)合，形成cAMP-CAP復(fù)合物，結(jié)合在乳糖啟動(dòng)序列附近的CAP位點(diǎn)，可刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性，使之轉(zhuǎn)錄頻率大大提高；當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，cAMP濃度降低，cAMP與CAP結(jié)合受阻，因此乳糖操縱子表達(dá)下降。5.3酶活性的調(diào)節(jié)通過改變酶分子的活性來調(diào)節(jié)代謝速度的調(diào)節(jié)方式稱為酶活性的調(diào)節(jié)。與酶合成調(diào)節(jié)方式相比，這種調(diào)節(jié)方式更直接，并且見效快。是發(fā)生在蛋白質(zhì)水平上的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)酶:某些酶的活性受到底物或產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物的影響，這些酶稱為調(diào)節(jié)酶。酶活性調(diào)節(jié)機(jī)理：調(diào)節(jié)酶通常是變構(gòu)酶，一般具有多個(gè)亞基，包括催化亞基和調(diào)節(jié)亞基。變構(gòu)酶激活過程的效應(yīng)物稱為激活劑(ac

40、tivator)，而抑制過程的效應(yīng)物稱為抑制劑(inhibitor)。 變構(gòu)酶受效應(yīng)物的調(diào)節(jié)過程1. 激活劑激活無活性的酶；2.抑制劑抑制有活性的酶在微生物代謝調(diào)節(jié)中更常見的是反饋調(diào)節(jié)，尤其是末端產(chǎn)物對(duì)酶活的反饋抑制。抑制劑與調(diào)節(jié)亞基結(jié)合引起酶構(gòu)象發(fā)生變化，使催化亞基的活性中心不再能與底物結(jié)合，酶的催化性能隨之消失。調(diào)節(jié)酶的抑制劑通常是代謝終產(chǎn)物或其結(jié)構(gòu)類似物，作用是抑制酶的活性。效應(yīng)物的作用是可逆的，一旦效應(yīng)物濃度降低，酶活性就會(huì)恢復(fù)。調(diào)節(jié)酶常常是催化分支代謝途徑一系列反應(yīng)中第一個(gè)反應(yīng)的酶，這樣就避免了不必要的能量浪費(fèi)。 5.4微生物代謝調(diào)節(jié)的模式在微生物合成代謝過程中，反饋?zhàn)瓒艉头答佉种仆?/p>

41、往共同對(duì)代謝起著調(diào)節(jié)作用，它們通過對(duì)酶的合成和酶的活性進(jìn)行調(diào)節(jié)，使細(xì)胞內(nèi)各種代謝物濃度保持在適當(dāng)?shù)乃?。反饋?zhàn)瓒羰寝D(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)慢，反饋抑制是酶活性水平調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)快。此外，前者的作用往往會(huì)影響催化一系列反應(yīng)的多個(gè)酶，而后者往往只對(duì)是一系列反應(yīng)中的第一個(gè)酶起作用。反饋?zhàn)瓒簦?feedback repression ）與反饋抑制（ feedback inhibition ）的性質(zhì)比較反饋?zhàn)瓒舴答佉种普{(diào)控對(duì)象酶的合成酶的活性調(diào)控開關(guān)終產(chǎn)物濃度終產(chǎn)物濃度調(diào)控的水平DNA-mRNA-酶蛋白（轉(zhuǎn)錄水平）酶蛋白的構(gòu)象變化調(diào)控方式終產(chǎn)物與阻遏蛋白親和力終產(chǎn)物與變構(gòu)部位親和力調(diào)控動(dòng)作阻遏蛋白與操縱

42、基因結(jié)合，不能合成mRNA通過變構(gòu)效應(yīng)，酶的構(gòu)象變化對(duì)酶的影響影響催化一系列反應(yīng)的多個(gè)酶只對(duì)是一系列反應(yīng)中的第一個(gè)酶起作用形成的控制開、關(guān)控制控制酶活性大小調(diào)控反應(yīng)速度遲緩迅速5.5 微生物代謝調(diào)節(jié)的模式5.5.1 直線式代謝途徑的反饋控制對(duì)于只有一個(gè)末端代謝產(chǎn)物的途徑，即直線式代謝途徑，當(dāng)末端代謝產(chǎn)物達(dá)到一定濃度時(shí)，就會(huì)反饋控制該代謝途徑。末端產(chǎn)物的反饋?zhàn)瓒粢话闶亲柚乖撏緩街兴忻傅暮铣?，末端產(chǎn)物抑制一般是抑制該途徑第一個(gè)酶的活性。5.5.2 分支代謝途徑的反饋控制由幾種末端代謝產(chǎn)物共同對(duì)生物合成途徑進(jìn)行控制的體系較為復(fù)雜。即便是同一代謝途徑，不同菌種也會(huì)有不同的控制模式。這些控制可以是反饋

43、阻遏或反饋抑制單獨(dú)作用的結(jié)果，也可以是兩者共同作用的結(jié)果。5.5.2.1協(xié)同反饋調(diào)節(jié)分支代謝途徑的幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)過量時(shí)，該途徑的第一個(gè)酶才會(huì)受到反饋?zhàn)瓒艋蚍答佉种啤?.5.2.2增效反饋調(diào)節(jié)這類控制體系與協(xié)同反饋控制類似，但是該體系中的末端產(chǎn)物都有較弱的獨(dú)立控制作用。當(dāng)所有的末端產(chǎn)物同時(shí)過剩時(shí)，會(huì)導(dǎo)致增效的阻遏或抑制，即其阻遏或抑制的程度比這些末端產(chǎn)物各自獨(dú)立過量時(shí)的總和還要大，因此，又稱為增效反饋控制 。5.5.2.3累積反饋控制每個(gè)分支途徑的末端產(chǎn)物都獨(dú)立于其它末端產(chǎn)物，以一定百分比控制該途徑第一個(gè)共同的酶所催化的反應(yīng)。當(dāng)幾個(gè)末端產(chǎn)物同時(shí)存在時(shí)，它們對(duì)酶反應(yīng)的抑制是累積的，各末端產(chǎn)物之間

44、既無協(xié)同效應(yīng)，也無拮抗作用。5.5.2.4順序反饋調(diào)節(jié)在順序反饋控制體系中，直接對(duì)第一個(gè)共同的酶起控制作用的并不是末端產(chǎn)物，而是分支點(diǎn)上的中間產(chǎn)物。5.6能荷調(diào)節(jié)能荷指細(xì)胞中、AMP系統(tǒng)中可為代謝反應(yīng)供能的高能磷酸鍵的量度。能荷調(diào)節(jié)也稱腺苷酸調(diào)節(jié)，系指細(xì)胞通過改變ATP、ADP、AMP三者比例來調(diào)節(jié)其代謝活動(dòng)。它們所含能荷依次遞減，上述三者在細(xì)胞中的含量不同，表明細(xì)胞的能量狀態(tài)不同。細(xì)胞中能荷的作用：1）調(diào)節(jié)形成ATP的分解代謝酶類的活性;2）調(diào)節(jié)利用ATP的生物合成酶類的活性。5.7次級(jí)代謝與次級(jí)代謝調(diào)節(jié)次級(jí)代謝是相對(duì)于初級(jí)代謝而言的，所謂初級(jí)代謝是一類普遍存在于生物中的代謝類型，是與生物生

45、存有關(guān)的，涉及能量產(chǎn)生和能量消耗的代謝類型。5.7.1 碳、氮分解代謝物調(diào)節(jié)指能迅速被利用的碳源（氮源）及其分解代謝物 ，對(duì)其它代謝中的酶的調(diào)節(jié)。例如:葡萄糖是菌體生長良好的碳源和能源，但對(duì)青霉素、卡那霉素等都有明顯降低其產(chǎn)量的作用 5.7.2磷酸鹽的調(diào)節(jié)磷酸鹽對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物合成抑制作用的調(diào)節(jié)機(jī)制是不同的、有的是通過抑制酶的作用，有的是導(dǎo)致細(xì)胞能荷變化，或是提高磷酸鹽競爭某些必需金屬離子的作用實(shí)現(xiàn)的。5.7.2細(xì)胞膜透性的調(diào)節(jié)在青霉素發(fā)酵中，產(chǎn)生菌細(xì)胞膜輸入硫化物能力的大小影響青霉素發(fā)酵單位的高低。若輸入硫化物能力增大，硫源供應(yīng)充足，合成青霉素的量就增多。第二節(jié) 微生物代謝的人工控制人為地打破

46、微生物的代謝控制體系，就有可能使代謝朝著人們希望的方向進(jìn)行，這就是所謂代謝的人工控制。雖然微生物代謝調(diào)節(jié)的理論目前還有很大的局限性，但它已在微生物育種和發(fā)酵工藝的優(yōu)化中發(fā)揮了重要的作用。隨著代謝調(diào)節(jié)理論的不斷充實(shí)和完善，代謝的人工控制將對(duì)發(fā)酵工業(yè)發(fā)揮更加重要的作用。目前，人工控制代謝主要是通過遺傳學(xué)和生物化學(xué)方法來實(shí)現(xiàn)的。5.8 遺傳學(xué)方面通過改變微生物遺傳物質(zhì)可以從根本上打破微生物原有的代謝控制機(jī)制，具體包括應(yīng)用：1）營養(yǎng)缺陷型突變株；2）抗反饋調(diào)節(jié)的突變株;3)滲漏突變菌株;4)抗分解代謝突變株;5)組成型突變菌株.5.9 生化方面不通過遺傳學(xué)方法也能改變菌株的調(diào)節(jié)機(jī)制，具體包括：1）添加

47、前體；2）控制誘導(dǎo)劑；3）發(fā)酵與分離過程耦合；4）控制細(xì)胞膜的通透性；5）培養(yǎng)基成分和濃度控制。5.10 代謝調(diào)控在氨基酸發(fā)酵中的應(yīng)用以谷氨酸為例： 目前工業(yè)上應(yīng)用的谷氨酸產(chǎn)生菌有谷氨酸棒狀桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、散枝短桿菌、黃色短桿菌、嗜氨短桿菌等。在發(fā)酵過程中，氧、溫度、pH和磷酸鹽等的調(diào)節(jié)和控制如下： 氧。谷氨酸產(chǎn)生菌是好氧菌，通風(fēng)和攪拌不僅會(huì)影響菌種對(duì)氮源和碳源的利用率，而且會(huì)影響發(fā)酵周期和谷氨酸的合成量。尤其是在發(fā)酵后期，加大通氣量有利于谷氨酸的合成。其中谷氨酸棒狀桿菌在溶氧不足時(shí)產(chǎn)生的是乳酸或琥珀酸。溫度。菌種生長的最適溫度為3032 。當(dāng)菌體生長到穩(wěn)定期，適當(dāng)提高溫度有利于氨基酸產(chǎn)

48、生，因此，在發(fā)酵后期，可將溫度提高到3437 。 pH。谷氨酸產(chǎn)生菌發(fā)酵的最適pH在7.08.0。但在發(fā)酵過程中，隨著營養(yǎng)物質(zhì)的利用，代謝產(chǎn)物的積累，培養(yǎng)液的pH會(huì)不斷變化。如隨著氮源的利用，放出氨，pH會(huì)上升；當(dāng)糖被利用生成有機(jī)酸時(shí)，pH會(huì)下降。其中谷氨酸棒狀桿菌在pH呈酸性時(shí)生成乙酰谷胺酰胺。 磷酸鹽。它是谷氨酸發(fā)酵過程中必需的，但濃度不能過高，否則會(huì)轉(zhuǎn)向纈氨酸發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)束后，常用離子交換樹脂法等進(jìn)行提取。從代謝調(diào)控的角度分析一株谷氨酸高產(chǎn)菌應(yīng)具備的代謝特征： 第六章 培養(yǎng)基教學(xué)基本要求：使學(xué)生掌握培養(yǎng)基成分選擇的一些基本原則，掌握和了解培養(yǎng)及優(yōu)化的基本方法以及培養(yǎng)基設(shè)計(jì)時(shí)主義的一些相關(guān)

49、問題。教學(xué)內(nèi)容：6.1 定義培養(yǎng)基通常指人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)。廣義上說，凡是支持微生物生長和繁殖的介質(zhì)或材料均可作為微生物的培養(yǎng)基。 用途：培養(yǎng)基是微生物學(xué)尤其是工業(yè)微生物學(xué)研究的重要內(nèi)容。一個(gè)恰當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基配方，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量有著極大的影響。 6.2 培養(yǎng)基的基本要求必須含有作為細(xì)胞合成的原料；滿足一般生化反應(yīng)的基本條件，如碳源、氮源、無機(jī)鹽、生長因子，還有一定的pH條件等等；原材料營養(yǎng)豐富，配比合理、各成分之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；含有能夠促進(jìn)微生物合成產(chǎn)物所必需的成分（工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基）；來源豐富、價(jià)格便宜、質(zhì)量穩(wěn)定、有利于提取。6.3 培養(yǎng)基的成分及種類大

50、部分微生物為異養(yǎng)型微生物所以培養(yǎng)基的基本成分有以下幾類：碳源，氮源，無機(jī)鹽和微量元素，前體、促進(jìn)劑和抑制劑，水分。培養(yǎng)基的種類6.4 培養(yǎng)基配置原則在考慮某一菌種對(duì)培養(yǎng)記得總體要求時(shí)，在成分選擇時(shí)應(yīng)該注意一下幾個(gè)方面的問題。6.4.1菌體的同化能力小分子物質(zhì)能夠通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝。大分子物質(zhì)則需要相應(yīng)的水解酶才能利用。由于微生物來源和種類的不同，能分泌的水解酶系不一樣，所以利用的的物質(zhì)也不一樣，所以必須要充分考慮微生物的同化能力。葡萄糖是幾乎所有微生物都能利用的碳源，因此在選擇培養(yǎng)基時(shí)一般優(yōu)先加以考慮。工業(yè)生產(chǎn)中一般采用淀粉水解糖糖化過程，得到的糖液稱為淀粉水解糖。目前淀粉水解糖的制

51、備方法分為酸法、酸酶法和雙酶法，其中以雙酶發(fā)制得的糖液質(zhì)量最好。許多有機(jī)氮源都是很復(fù)雜的大分子蛋白質(zhì)。有些微生物缺乏蛋白分解酶，不能直接分解蛋白質(zhì)必須將有機(jī)氮源水解后才能被利用。6.4.2 代謝的阻遏和誘導(dǎo)在配制培養(yǎng)基考慮碳源和氮源時(shí)，應(yīng)該根據(jù)微生物的特性和培養(yǎng)的目的，注意快速利用的碳（氮）源和慢速利用的碳（氮）源的相互配合。對(duì)于快速利用的碳（氮）源，當(dāng)菌體利用葡萄糖時(shí)產(chǎn)生的分解代謝產(chǎn)物會(huì)阻遏或抑制某些產(chǎn)物合成所需酶系的形成或酶的活性，即發(fā)生葡萄糖效應(yīng)6.4.3 合適的C、N 比培養(yǎng)基中碳氮比對(duì)微生物生長繁殖和產(chǎn)物合成的影響極為顯著。氮源過多，菌體生長旺盛，pH偏高，不利于代謝產(chǎn)物的積累；氮源

52、不足，菌體繁殖量少，從而影響產(chǎn)量。碳源不足，容易引起菌體的衰老和自溶碳氮比不當(dāng)還會(huì)引起菌體按比例的吸收營養(yǎng)物質(zhì)，從而直接影響菌體的生長和產(chǎn)物的合成。微生物在不同的生長階段，其對(duì)碳氮比的最適要求也不一樣。6.4.4 pH的要求pH對(duì)于微生物的生長是一個(gè)極為重要的環(huán)境因子，在配制培養(yǎng)基培養(yǎng)基選取營養(yǎng)物質(zhì)時(shí)，也要考慮其代謝后對(duì)培養(yǎng)體系pH緩沖體系的影響，保證整個(gè)發(fā)酵過程中pH處于較為適宜的狀態(tài)。6.5 影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素6.5.1 培養(yǎng)基成分的影響6.5.2 高溫滅菌對(duì)培養(yǎng)基成分的影響第七章 種子擴(kuò)大培養(yǎng)教學(xué)基本要求：使學(xué)生了解并掌握種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念、種子要求及制備過程，以及種子罐級(jí)數(shù)的確定，并

53、了解種子擴(kuò)大培養(yǎng)在發(fā)酵生產(chǎn)中的重要作用。教學(xué)內(nèi)容：7.1種子擴(kuò)大培養(yǎng)的概念種子擴(kuò)大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過三角瓶或搖瓶及種子罐逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)過程中的種子的必須滿足以下條件：（1）菌種細(xì)胞的生長活力強(qiáng)，移種至發(fā)酵罐后能迅速生長，遲緩期短；（2）生理形狀穩(wěn)定；（3）菌體總量及濃度能滿足大容量發(fā)酵罐的要求；（4）無雜菌污染； （5）保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力7.2 種子的制備過程 實(shí)驗(yàn)室階段：不用種子罐，所用的設(shè)備為培養(yǎng)箱、搖床等實(shí)驗(yàn)室常見設(shè)備，在工廠這些培養(yǎng)過程一般都在菌種室完成，因此現(xiàn)象地將這些培養(yǎng)過程稱為實(shí)驗(yàn)室階段的種子培養(yǎng)。生產(chǎn)車間階段：種子培養(yǎng)在種子罐里面進(jìn)行，一般在工程歸為發(fā)酵車間管理，因此形象地稱這些培養(yǎng)過程為生產(chǎn)車間階段。7.2.1 實(shí)驗(yàn)室種子的制備實(shí)驗(yàn)室種子的制備一般采用兩種方式：對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基培養(yǎng)孢子，孢子可直接作為種子罐的種子，這樣操作簡便，不易污染雜菌。 對(duì)于產(chǎn)孢子能力不強(qiáng)或孢子發(fā)芽慢的菌種，可以用液體培養(yǎng)法。7.2.2 生產(chǎn)車間種子制備 實(shí)驗(yàn)室制備的孢子或液體種子移種至種子罐擴(kuò)大