熒光定量PCR檢測(cè)項(xiàng)目PPT學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1與目標(biāo)序列互補(bǔ)5端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， R與Q分開(kāi)，發(fā)熒光Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針第1頁(yè)/共28頁(yè)535535ForwardPrimerReversePrimerTaqMan ProbeRQTaqman實(shí)時(shí)實(shí)時(shí)PCR的反應(yīng)過(guò)程的反應(yīng)過(guò)程第2頁(yè)/共28頁(yè)535535ForwardPrimerReversePrimerRQ第3頁(yè)/共28頁(yè)535535QR第4頁(yè)/共28頁(yè)535535RQ每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，

2、可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)檢測(cè)熒光第5頁(yè)/共28頁(yè)第6頁(yè)/共28頁(yè)第7頁(yè)/共28頁(yè)介紹三個(gè)概念：介紹三個(gè)概念： 擴(kuò)增曲線(xiàn)、熒光閾值、擴(kuò)增曲線(xiàn)、熒光閾值、Ct值值第8頁(yè)/共28頁(yè)擴(kuò)增曲線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)擴(kuò)增曲線(xiàn)圖擴(kuò)增曲線(xiàn)圖： 橫坐標(biāo)：擴(kuò)增循環(huán)數(shù)（Cycle）；縱坐標(biāo)：熒光強(qiáng)度 每個(gè)循環(huán)進(jìn)行一次熒光信號(hào)的收集熒光基熒光基團(tuán)團(tuán)熒光檢測(cè)元件熒光檢測(cè)元件第9頁(yè)/共28頁(yè)熒光閾值熒光閾值熒光信號(hào)閾值熒光信號(hào)閾值 （threshold threshold ）：q 前15個(gè)循環(huán)信號(hào)作為熒光本底信號(hào)（baseline），即樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光值q 熒光域值的缺省設(shè)置是315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍q

3、手動(dòng) 設(shè)置：原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對(duì)照的熒光最高值，同時(shí)要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸系數(shù)大于q 真正的信號(hào):熒光信號(hào)超過(guò)域值第10頁(yè)/共28頁(yè)Ct值CtCt值的定義值的定義： PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)C(t) value 第11頁(yè)/共28頁(yè)Ct值的重現(xiàn)性橫軸：橫軸：PCR反映循環(huán)數(shù)反映循環(huán)數(shù)縱軸：熒光信號(hào)量縱軸：熒光信號(hào)量CtCt值的特點(diǎn)值的特點(diǎn)：相同模板進(jìn)行96次擴(kuò)增，終點(diǎn)處產(chǎn)物量不恒定； Ct值則極具重現(xiàn)性第12頁(yè)/共28頁(yè)定量原理定量原理理想的PCR反應(yīng)： X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)： X=X0 (1+Ex)

4、n n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù) X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量 X0：初始模板量 Ex：擴(kuò)增效率第13頁(yè)/共28頁(yè)定量原理定量原理在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線(xiàn)時(shí): XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的量. 在閾值線(xiàn)設(shè)定以后,它是一個(gè)常數(shù),我們?cè)O(shè)為M方程式(1)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2)整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到濃度與循環(huán)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增達(dá)到域域值的循環(huán)數(shù)即值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計(jì)算出樣品

5、中所含的模板量就可計(jì)算出樣品中所含的模板量第14頁(yè)/共28頁(yè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)q 模板DNA量越多，熒光達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)越少，即Ct值越小q Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，通過(guò)已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，根據(jù)樣品Ct值，就可以計(jì)算出樣品中所含的模板量第15頁(yè)/共28頁(yè)Sample25第16頁(yè)/共28頁(yè)第17頁(yè)/共28頁(yè)第18頁(yè)/共28頁(yè)第19頁(yè)/共28頁(yè)HBV基因型的臨床意義基因型的臨床意義HBV標(biāo)志物清除與B基因型相比，C基因型有更高的HBeAg陽(yáng)性率，分別為16%與53% 基因型的自發(fā)性HBeAg清除要比C基因型早10年，并且在HBeAg清除后，肝臟生物化學(xué)指標(biāo)持續(xù)正常。病毒致病性

6、HBsAg陽(yáng)性者中， C基因型比B 基因型的肝功能異常更為常見(jiàn)。C基因型引起的臨床表現(xiàn)及組織學(xué)損傷更嚴(yán)重。第20頁(yè)/共28頁(yè)乙型肝炎的病程及轉(zhuǎn)歸亞洲無(wú)癥狀HBV攜帶中 ，與B基因型比較,C基因型在肝硬化及50歲以上的肝細(xì)胞癌患者中比例較高,而B(niǎo)基因型與50歲以下,特別是35歲以下的肝細(xì)胞癌患者有關(guān)。藥物敏感性第21頁(yè)/共28頁(yè) B B型型 C C型型流行性流行性 低低 高高HBeAgHBeAg陽(yáng)性率陽(yáng)性率 低低 高高 HBeAgHBeAg自然清除時(shí)間自然清除時(shí)間 短短 長(zhǎng)長(zhǎng) HBV DNA HBV DNA 載量載量 低低 高高致病性致病性 輕輕 重重HCCHCC發(fā)生率發(fā)生率 低（低年齡組高）低（低年齡組高） 高（高年齡組高）高（高年齡組高）干擾素治療完全應(yīng)答率干擾素治療完全應(yīng)答率 高高 低低抗病毒治療效果抗病毒治療效果 好好 差差肝