甲硝唑與牛血清白蛋白相互作用的電化學行為研究

1、甲硝唑與牛血清白蛋白相互作用的電化學行為研究劉杰1*，張波1，劉艷梅2，張勇2 (1.太原中心醫(yī)院 太原030009 2.山西大學化學化工學院，山西 太原 030006)摘要 目的:采用電化學方法研究了甲硝唑與牛血清白蛋白（BSA）的相互作用的電化學行為。方法:循環(huán)伏安法和線性掃描伏安法。結果: 在pH8.5的Britton-Robinson緩沖溶液和0.6 molL-1氯化鉀溶液組成的底液中，甲硝唑在-0.57V(s.SCE)處出現(xiàn)一靈敏的還原峰，而牛血清白蛋白(BSA)在掃描范圍為-0.3-0.8V處沒有峰。而且，當BSA加入到甲硝唑溶液中，甲硝唑的還原峰明顯降低，實驗證明還原峰的降低值與

2、BSA加入的濃度呈線性關系，線性范圍為5.0×10-71.0×10-4 molL-1， (r=0.995)，檢出限為8.0×10-8molL-1。并對甲硝唑和BSA的相互作用機理進行了探討，二者主要通過疏水鍵相結合。結論: 測定了甲硝唑與BSA的結合比和結合常數(shù), 并對結合反應機理進行了初步的探討。 關鍵詞：甲硝唑；牛血清白蛋白；電化學行為；相互作用中文分類號: 文獻標識碼: 文章編號:Study on the interaction between metronidazole and bovine serum albumin using electrochemi

3、cal methodLIU Jie , ZHANG bo,(Department of pharmacentics,The Central Hospital of Taiyuan.Taiyuan 030009) LIU Yan-mei , ZHANG Yong* (School of Chemistry and Chemical Engineer, Shanxi University, Taiyuan 030006)Abstract Objective: The electrochemical methods has been used for study on the interaction

4、 between metronidazole and bovine serum albumin. Methods:Cyclic voltammetry and linear sweep voltammetry. Results: The results showed that a sensitive reduction peak of metronidazole has been obtained in the base solution of Britton-Robinson buffer solution (pH8.5) and 0.6 molL-1 KCl solution, but b

5、ovine serum albumin has not reduction peak in the rang of -0.3-0.8V. When bovine serum albumin was added in metronidazole solution, the reduction peak of metronidazole will fall down. The peak current declining value was directly proportional to the bovine serum albumin concentration in the rang of

6、5.0×10-71.0×10-4 molL-1 (r=0.995). The detection limit was 8.0×10-8 molL-1. In addition, the interaction mechanism between metronidazole and BSA has been studied, the results demonstrate that combination of them mainly by hydrophobicity. Conclusion: The binding ratio and binding const

7、ant of metronidazole with BSA calculated. Furthermore , the binding mechanism was also preliminarily discussed.Key Words: metronidazole; bovine serum albumin; electrochemical behavior; interaction蛋白質的定量測定是生物化學、藥學、食品檢驗及臨床分析中常涉及的重要內容, 目前蛋白質的定量測定主要是光譜探針法1-8 。近年來,電化學法由于其簡便、快速、價廉, 在生命科學領域內日益受到重視9-11 。本文用

8、電化學分析方法對甲硝唑和BSA之間的相互作用進行了研究。建立了一種測定BSA的新方法，并對結合反應機理進行了初步探討12,13。1 儀器與試劑LK2005型電化學工作站(天津蘭力科化學電子高技術有限公司)；三電極體系：參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，輔助電極為鉑絲電極，工作電極為銀盤電極(：50µm天津蘭力科化學電子高技術有限公司)。甲硝唑標準儲備溶液（1.0×10-3 molL-1）： 準確稱取0.0171g甲硝唑（太原制藥廠，質量分數(shù)99.5%），用二次蒸餾水溶解并定容于l00mL容量瓶中，置于棕色試劑瓶中于冷暗處保存；牛血清白蛋白(BSA) （Sigma公司，分子量

9、：68000）；pH8.5的Britton-Robinson緩沖溶液；1.2 molL-1氯化鉀溶液。(其它試劑均為分析純，實際用水為二次蒸餾水。)2 實驗方法電極預處理：先用小號金相砂紙將銀盤電極磨平滑，再在稠布上用Al2O3粉末拋光成鏡面，然后在超聲波水浴中依次用水和乙醇徹底清洗。循環(huán)伏安法電化學測量：在10 mL 的比色管中，依次加入1 mL 0.1 molL-1 pH 8.5的Britton-Robinson緩沖溶液，1.2 molL-1氯化鉀溶液5mL，0.5 mL 1.0×10-3 molL-1甲硝唑和不同濃度的BSA，用水定容至刻度，勻后室溫下靜置25 min，以未加B

10、SA 的甲硝唑溶液作參比進行研究和測定。3 結果與討論3.1線性掃描伏安圖的變化對甲硝唑與BSA 二者的反應體系進行了電化學研究。在pH8.5 的Britton-Robinson緩沖溶液和0.6molL-1KCl溶液組成的底液中， BSA 在-0.3 -0.8 V 掃描范圍內無峰。甲硝唑在此范圍內有一靈敏的還原峰，峰電位約為-0.57 V(s. SCE)。當將BSA加入到甲硝唑溶液中后，甲硝唑還原峰電流減小，甲硝唑峰電流的降低值與加入BSA 的濃度在一定范圍內呈良好的線性關系可用于BSA 的定量測定。如圖1為甲硝唑濃度5.0×10-5 molL-1時加入不同濃度BSA的線性掃描疊加伏

11、安圖。圖1 BSA-甲硝唑反應的線性掃描伏安圖Fig. 1 Linear sweep voltammogram of reaction system of BSA - Metronidazole (pH8.5)a. 5.0×10-5 mol·L-1甲硝唑; b. a+BSA 1.0×10-5 mol·L-1; c. a+BSA 2.0×10-5 mol·L-1; d. a+BSA 3.0×10-5mol·L-1.3.2實驗條件的選擇（1）緩沖介質和酸度的選擇固定甲硝唑和BSA 的濃度分別為5.0×10 -

12、5 molL-1 和1.0×10-5 molL-1，改變Britton-Robinson緩沖溶液的pH，考察酸度對反應體系的影響，結果表明在pH8.5的Britton-Robinson緩沖液中峰電流具有最大差值即ip 最大(如圖2所示)。在10mL 測定溶液中, 分別加入0.53.0 mL Britton-Robinson緩沖液進行測定，當 Britton-Robinson緩沖液用量為1mL，峰電流靈敏度越高，ip 越大。實驗選擇Britton-Robinson 緩沖液加入量為1.0mL。圖2 緩沖溶液pH對峰電流的影響Fig. 2 Effects between the pH an

13、d peak current（2）甲硝唑用量對反應體系的影響在pH 8.5 的Britton-Robinson 緩沖液中, 固定BSA 為1.0×10-5 molL-1 ,甲硝唑濃度為1. 0×10-5 1.0×10-4 molL-1 時對體系測定的影響。結果表明當甲硝唑濃度為5.0×10-5 molL-1時，ip 最大。所以選擇甲硝唑濃度為5.0×10-5 molL-1。（3）試劑加入順序對體系的影響分別改變Britton-Robinson、甲硝唑和BSA三種溶液的加入順序, 測定體系的ip 。結果表明，先加入Britton-Robinson

14、 緩沖液再加入甲硝唑溶液，最后加入BSA 的順序ip 最大，故為最佳加液順序。（4）反應時間對體系的影響實驗測定了反應時間對甲硝唑和BSA 作用體系的影響。二者反應速度較快，25 min后ip 值達到最大，實驗選擇室溫下放置25 min作為實驗條件（如圖3所示）。（5）掃描速度與峰電流的關系在50200mV/s范圍內，反應體系的峰電流(ip)與掃速(v)之間均呈線性關系，線性相關系數(shù)為0.9995，說明還原峰性質為吸附還原峰（如圖4所示）。（6）干擾物質的影響當BSA 的濃度為1. 0×10-5 molL-1 時，測定誤差小于±5% , 試驗了常見的氨基酸如：L-異白氨酸、

15、DL-纈氨酸、DL-絲氨酸、DL-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-谷氨酰胺和檸檬酸根、葡萄糖、HPO42-、H2 PO4- 及金屬離子Ca2+、K+、Mn2+、Na+、Zn2+、Cr3+、Cu2+、Co2+、Mg2+等對BSA 測定的影響，結果發(fā)現(xiàn)上述物質對測定均產生一定的影響。少量的Ag+、Fe3+干擾較為嚴重。圖3 反應時間對體系的影響Fig. 3 Effects between the reaction time level and reaction system圖4 掃描速度與峰電流的關系Fig. 4Relationship between the scan rate and peak cu

16、rrent3.3甲硝唑與BSA濃度的線性范圍、檢出限和線性相關系數(shù)在優(yōu)化條件下，采用線性掃描伏安法測定了甲硝唑的峰電流下降值與BSA的濃度的關系線性范圍為5.0×10-71.0×10-4 molL-1，線性回歸方程為：ip=2.7459C(BSA)+0.1168(r=0.995, ip:A, C(BSA):10-5 molL-1)，檢出限為8.0×10-8molL-1。對1.0×10-6 molL-1BSA平行測定了8次，其相對標準偏差為2.31%。3.4回收率試驗在已知BSA濃度的體系中，再加入不同濃度的BSA，測定其回收率，測定結果見下表1。表1 回

17、收率試驗結果(n=6)Table 1 Result of recovery編號(NO.)原始樣品量(×10-6molL-1)加入量(×10-6molL-1)測得量(×10-6molL-1)回收率(%)10.800.501.29193.120.800.501.29799.731.000.501.512100.841.000.501.503100.251.100.501.609100.5261.100.501.59399.563.5甲硝唑與牛血清白蛋白反應體系結合常數(shù)和結合比的測定根據(jù)文獻12，如果甲硝唑與BSA形成單一的復合物，那么該反應體系滿足以下方程：MNZ +

18、 nBSA = MNZnBSA (1)由此可以推斷結合常數(shù)：MNZnBSA/ MNZ BSAn (2)如果MNZnBSA復合物不具有電活性，那么甲硝唑還原峰電流的下降值與該復合物的濃度應呈線性關系：ip = kMNZnBSA (3)由此可以推斷：C MNZ = MNZ + MNZnBSA (4)ip max = k C MNZ (5)ip max -ip = k(C MNZ -MNZnBSA ) = kMNZ (6)由上述式(3)、(6)、(2)可以推導出：ip / (ip max -ip) BSAn 或1/ip = 1/ip max + 1/ip max BSAn (7)式中, ip表示加入

19、BSA 前后的峰電流降低的差值，ip max表示峰電流降低的最大差值。BSA表示牛血清白蛋白的平衡濃度。若只形成一種簡單的復合物, 以1/ip1/ BSAn ( n = 1 , 2 , 3 ) 作圖應為一直線, n 值即為結合比, 由直線的斜率的和截距可算出結合常數(shù)。結果表明, 如圖5所示, 當n = 1 時1/ip1/ BSAn呈直線關系，線性方程為y = 1.5009x(105mol·L-1) + 0.2434，相關系數(shù)r =0.991。甲硝唑與BSA 形成11的復合物, 其結合常數(shù)= 2.24×104 L·mol-1。圖5 1/ip與1/ BSA關系圖Fig

20、.5 Plot of 1/ip versus 1/ BSA3.6甲硝唑與BSA反應機理的探討蛋白質是通過肽鍵連接的氨基酸的多聚體。不同的氨基酸通過氫鍵、鹽鍵、疏水作用力、共價鍵等作用構成了蛋白質的多級結構。藥物分子與生物大分子的作用包括氫鍵、范德華力、靜電引力、疏水作用等。藥物不同，與蛋白質作用類型不同。由實驗結果和文獻13可知，甲硝唑主要通過疏水鍵與BSA發(fā)生結合反應。甲硝唑以疏水鍵和蛋白質相結合，可以在蛋白質中運輸和儲存，并有明顯的生理活性，甲硝唑對蛋白質的構象有一定的影響，它們的結合服從位點結合模式，在298K時近似形成一個結合位點。參考文獻：1 黃波，鄒國林，楊天鳴. 阿霉素與牛血清白

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