實(shí)驗(yàn)三十四 植物葉綠體色素的提取、分離、表征及含量測(cè)定

1、摘自王尊本主編，綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)（第二版），第226-244頁，北京：科學(xué)出版社，2007年9月。實(shí)驗(yàn)三十四 植物葉綠體色素的提取、分離、 表征及含量測(cè)定1-27一、葉綠體色素的提?。ㄒ唬?實(shí) 驗(yàn) 目 的1）掌握有機(jī)溶劑提取葉綠體色素等天然化合物的原理和實(shí)驗(yàn)方法。2）了解皂化-萃取提取b-胡蘿卜素的原理。3）了解1,4-二氧六環(huán)沉淀法提取葉綠素的原理。（二） 實(shí) 驗(yàn) 原 理植物光合作用是自然界最重要的現(xiàn)象，它是人類所利用能量的主要來源。在把光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能的光合作用過程中，葉綠體色素起著重要的作用。高等植物體內(nèi)的葉綠體色素有葉綠素和類胡蘿卜素兩類，主要包括葉綠素a、葉綠素b、b-胡蘿卜素和葉黃素四

2、種。它們所呈現(xiàn)的顏色和在葉綠體中含量大約比例見表34.1。 表34.1 高等植物體內(nèi)葉綠體色素的種類、顏色及含量項(xiàng) 目葉綠素類胡蘿卜素葉綠素a葉綠素bb-胡蘿卜素葉黃素顏色藍(lán)綠色黃綠色橙黃色黃色在葉綠體內(nèi)各色素含量比例312131 葉綠素(chlorophylls)是葉綠酸的酯，它在植物進(jìn)行光合作用中吸收可見光，并將光能轉(zhuǎn)變?yōu)榛瘜W(xué)能。葉綠素是植物進(jìn)行光合作用所必需的催化劑。在綠色植物中葉綠素主要以葉綠素a（C55H72O5N4Mg）和葉綠素b（C55H70O6N4Mg）兩種結(jié)構(gòu)相似的形式存在，其差別僅是葉綠素a中一個(gè)甲基被葉綠素b中的甲?；〈?。葉綠素的基本結(jié)構(gòu)見圖34.1。在葉綠素分子結(jié)構(gòu)

3、中含有四個(gè)吡咯環(huán)，它們由四個(gè)甲烯基聯(lián)結(jié)成卟啉環(huán)，在卟啉環(huán)中央有一個(gè)鎂原子，它以兩個(gè)共價(jià)鍵和兩個(gè)配位鍵與4個(gè)吡咯環(huán)的氮原子結(jié)合成內(nèi)配鹽，形成鎂卟啉。在葉綠素分子中還有兩個(gè)羧基，其中一個(gè)與甲醇酯化成COOCH3，另一個(gè)與葉綠醇酯化成COOC20H39長(zhǎng)鏈。 類胡蘿卜素(carotenoids)是一類不飽和的四萜類碳?xì)浠衔铮ɡ绾}卜素，carotenes)，或它們的氧化衍生物（例如葉黃素類，xanthophylls)。所有的類胡蘿卜素均源于非環(huán)狀的C40H56結(jié)構(gòu)。類胡蘿卜素在強(qiáng)光下可防止葉綠素的光氧化；在弱光下，可作為輔助色素吸收光能并傳遞給葉綠素分子。胡蘿卜素有3種異構(gòu)體，即a-、b-和 g

4、-胡蘿卜素，其中 b-胡蘿卜素含量最多，也最為重要。b- 胡蘿卜素還具有維生素A的生理活性，其結(jié)構(gòu)是由兩分子維生素A在端鏈?zhǔn)煞肿铀Y(jié)合而成。在生物體內(nèi)，b-胡蘿卜素受酶催化氧化即形成維生素A。而葉黃素(3，3-二羥基-胡蘿卜素，lutein，C40H56O2)是一種常見的氧化型的類胡蘿卜素。 植物葉綠體色素的提取、分離、表征及含量測(cè)定在植物生理學(xué)、農(nóng)業(yè)和海洋科學(xué)研究中具有重要意義。同時(shí)，葉綠素和胡蘿卜素等天然色素在食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)中也有廣泛的用途。圖34.1 葉綠素a、葉綠素b、b-胡蘿卜素、葉黃素和維生素A的結(jié)構(gòu)式葉綠素a和b都是吡咯衍生物與金屬鎂離子的配合物，盡管它們分子中含有一些極

5、性基團(tuán)，但大的烷基結(jié)構(gòu)使它們易溶于丙酮、乙醇、乙醚和石油醚等有機(jī)溶劑中。而b-胡蘿卜素和葉黃素是典型的四萜化合物。與胡蘿卜素相比，葉黃素易溶于醇而在石油醚中的溶解度較小。由于葉綠體色素在植物細(xì)胞內(nèi)并非以游離態(tài)存在，而是與蛋白質(zhì)等結(jié)合存在于葉片中，在提取時(shí)應(yīng)先將植物細(xì)胞擊破，釋放出葉綠體色素，然后再根據(jù)色素的溶解特性，采用丙酮、乙醇、乙醚、丙酮-乙醚和甲醇-石油醚等有機(jī)溶劑提取。 由于粗提取液中還可能包括殘余植物組織和其它可溶性雜質(zhì)，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)對(duì)粗提液進(jìn)一步純化。（三）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.儀器 研缽，量筒，分液漏斗等常用玻璃儀器一套，離心機(jī)一臺(tái)。2.試劑 丙酮，乙醇，乙醚，石油醚等有機(jī)溶劑。飽和氯化

6、鈉水溶液。碳酸鎂和無水硫酸鈉。（四）實(shí) 驗(yàn) 步 驟1葉綠體色素的提取方法一：新鮮綠葉蔬菜，如菠菜、空心菜等，洗凈后棄除葉柄和中脈，然后用吸水紙將菜葉表面的水分吸干。稱取處理過的菜葉5 g，剪碎后放在干凈的研缽內(nèi)，加入0.1 g碳酸鎂，先將菜葉粗搗爛，然后加入10 mL乙醇 - 石油醚（2:3），迅速研磨5 min。用一不銹鋼網(wǎng)濾去菜葉殘?jiān)傺心ヌ崛∫淮?。最后再?0 mL乙醇 - 石油醚（2:3）洗滌研缽等容器，一并過濾。方法二：類似于方法一，采用丙酮提取，但在純化時(shí)應(yīng)事先在分液漏斗中加入15 mL石油醚。2粗提取液的純化 純化色素時(shí)，將合并的濾液轉(zhuǎn)入分液漏斗，加入5 mL飽和的NaCl溶液

7、和45 mL蒸餾水，輕輕振蕩，放置分層。小心地把下層的含乙醇或丙酮水溶液放掉，余下的色素提取液進(jìn)一步采用離心分離。取上層有機(jī)相，加入少量無水Na2SO4除去殘余水分。若提取液色素濃度太低，可用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（控制3035水?。┗蚶浯碉L(fēng)方式進(jìn)行適當(dāng)濃縮（約10 mL），轉(zhuǎn)入具塞的棕色瓶中置于暗處保存。3.皂化-萃取法提取b-胡蘿卜素將20 mL植物色素甲醇-石油醚提取溶液移入100 mL分液漏斗中，加入5 mL 30 % KOH甲醇溶液（將KOH加到90 %甲醇水溶液中配制），充分混合后避光放置1 h。葉綠素發(fā)生皂化反應(yīng)脫去甲基和葉醇基，生成葉綠酸。然后，加水25 mL，輕輕振蕩后靜置10 min分層

8、，除去水溶液，即得黃色的b-胡蘿卜素石油醚溶液。然后將石油醚溶液用100 mL蒸餾水分34次洗滌，再經(jīng)過適當(dāng)濃縮后移入分液漏斗，用10 mL 92 %甲醇洗滌，搖動(dòng)后靜置分離，葉黃素萃取進(jìn)入甲醇中。重復(fù)處理3次，合并所得b-胡蘿卜素石油醚溶液。往分離后的甲醇溶液加入等體積的乙醚和等體積的水。振蕩后用分液漏斗分出上層乙醚溶液，加入少量無水硫酸鈉進(jìn)行干燥。過濾后蒸去乙醚，即得深紅色的葉黃素軟膏狀物質(zhì)。4. 1,4-二氧六環(huán)沉淀法提取葉綠素綠色植物葉片的葉綠素用異丙醇提取。往 40 mL冷的濃縮粗提液中滴加 70 mL 1,4-二氧六環(huán)+ 200 mL 0.1 mol/L Na2HPO4 NaH2P

9、O4 緩沖液( pH 7.0 )混合液，然后放在 +5 冰箱過夜。由于1,4-二氧六環(huán)與葉綠素中心的Mg原子進(jìn)一步配合，降低了色素溶解度，析出葉綠素沉淀。離心分離后，可進(jìn)一步用水洗去葉綠素沉淀表面吸附的黃色的類胡蘿卜素。（五）注 意 事 項(xiàng)1）葉綠體色素對(duì)光、溫度、氧氣環(huán)境、酸堿及其它氧化劑都非常敏感。色素的提取和分析一般都要在避光、低溫及無酸堿等干擾的情況下進(jìn)行。乙醚使用前應(yīng)重蒸除去過氧化物。2）使用低沸點(diǎn)易揮發(fā)有機(jī)溶劑要注意實(shí)驗(yàn)室安全。實(shí)驗(yàn)室要保持良好的通風(fēng)條件，不得靠近明火操作。3）提取液不宜長(zhǎng)期存放，必要時(shí)應(yīng)抽干充氮避光低溫保存。（六）思 考 題1）什么是光合作用？2）試討論葉綠素、b

10、-胡蘿卜素的生理意義及實(shí)際應(yīng)用。3）綠色植物葉片的主要成分是什么？提取液可能含有哪些化合物？4）一般天然產(chǎn)物的提取方式有哪些？殘余的植物組織應(yīng)如何除去？5）直接用丙酮提取與用乙醇-石油醚混合溶劑提取對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能會(huì)有什么影響？二、葉綠體色素的色譜分離（一）實(shí) 驗(yàn) 目 的1）掌握紙色譜分離原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。2）掌握薄層色譜分離原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3）掌握快速柱色譜分離原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。（二）實(shí) 驗(yàn) 原 理 色譜法是與植物天然色素的分離提取同時(shí)發(fā)展起來的。色譜法（紙色譜、薄層色譜和柱色譜）至今仍然是分離葉綠素等天然色素最有效的方法。 色譜法分離葉綠體色素的基本原理是利用不同色素在各種有機(jī)溶劑中的分配系數(shù)或

11、在吸附劑上的吸附能力的不同，當(dāng)它們通過色譜柱/床時(shí)，這種分配或吸附過程反復(fù)多次地進(jìn)行，最后將它們一一分離開來。 通常認(rèn)為，紙色譜屬于分配色譜。它是以濾紙為惰性支持物，濾紙纖維一般能吸收約20 % 的水分，其中有6%7 % 以氫鍵形式與纖維素上的羥基結(jié)合，構(gòu)成紙色譜的固定相。在展開過程中，被分離組分在展開劑和固定相之間不斷進(jìn)行分配，達(dá)到相互分離。薄層色譜和柱色譜的吸附劑（固定相）有硅膠、氧化鋁、硅藻土等無機(jī)物，也有糖類、纖維素、聚酰胺、C18和離子交換樹脂等有機(jī)物。它們的分離機(jī)理也各不相同，如吸附、分配，氫鍵、正相和反相色譜等。對(duì)于紙色譜或薄層色譜，毛細(xì)管作用是推動(dòng)溶劑展開的動(dòng)力。被分離物質(zhì)在圖

12、譜上的位置，可用比移值Rf表示 （34.1）比移值的大小與被分離物質(zhì)的分配系數(shù)大小有關(guān)，它是紙色譜法和薄層色譜法實(shí)驗(yàn)中唯一可用數(shù)值表示的重要參數(shù)。在一定的色譜系統(tǒng)中，在確定的溫度下，Rf是被分離物質(zhì)的特征常數(shù)。Rf值差別越大，則分離越完全。對(duì)于相同的色譜體系，薄層色譜的Rf值與液相色譜的容量因子k值之間有一定的關(guān)系 (34.2)即在薄層色譜中展開快的組分，在柱色譜中先出峰。通過薄層色譜實(shí)驗(yàn)可以探索高效液相色譜合適的流動(dòng)相組成。 值得一提的是快速柱色譜（flash chromatography），即加壓柱色譜技術(shù)，它是介于經(jīng)典柱色譜和高效制備型液相色譜之間的一種實(shí)驗(yàn)室分離技術(shù)，主要用于天然產(chǎn)物和

13、化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物的快速分離和純化工作。本實(shí)驗(yàn)通過紙色譜、薄層色譜和快速柱色譜方式，進(jìn)一步將植物色素提取液分離成葉綠素a、葉綠素b、b-胡蘿卜素和葉黃素幾個(gè)組分，并對(duì)其進(jìn)行光譜表征和純度鑒定。通過多次制備紙色譜方式也可以得到少量葉綠素a和葉綠素b純品。（三）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1儀器層析缸，大量筒，培養(yǎng)皿，自制的帶有加壓裝置的玻璃快速柱色譜裝置等。新華1號(hào)層析濾紙。2試劑1）CCl4，石油醚，乙醚，乙醇和甲醇等有機(jī)溶劑。2）硅膠G，中性氧化鋁等吸附劑。（四）實(shí) 驗(yàn) 步 驟1紙色譜分離 紙色譜展開方式有上升法、下降法、輻射法和雙向展開等形式。葉綠體色素的分離一般采用新華1# 層析濾紙，展開劑有CCl4、石油

14、醚-乙醚乙醇（30:10:0.5）等。(1)下降法采用2cm25 cm的新華1# 層析濾紙，用毛細(xì)管點(diǎn)樣，斑點(diǎn)不應(yīng)超過5 mm。晾干后，放入圓型層析缸，以CCl4（可選擇其它溶劑，下同）為展開劑展開，使藍(lán)綠色葉綠素a、黃綠色葉綠素b及黃色的類胡蘿卜素相互分開。當(dāng)展開結(jié)束時(shí)，將濾紙取出放在通風(fēng)櫥中避光晾干，觀察斑點(diǎn)的顏色和形狀，計(jì)算各色素的Rf值。(2)上升法上升法可在大試管或250 mL的量筒中進(jìn)行。采用2cm30 cm的新華1# 層析濾紙，CCl4展開。(3)制備層析 方法一：取一張11cm層析濾紙，利用毛細(xì)管將色素提取液在濾紙的中心點(diǎn)樣，為提高制備量，吹干后反復(fù)點(diǎn)樣34次，斑點(diǎn)約1cm 。

15、吹干后，用另一干凈毛細(xì)管在樣斑中心斑點(diǎn)點(diǎn)12滴展開劑，讓樣品形成一均勻的樣品環(huán)。沿著濾紙斑點(diǎn)中心穿一個(gè)約3mm洞，做一2cm長(zhǎng)的濾紙芯穿過。取一對(duì)10cm培養(yǎng)皿，其中一個(gè)倒入約1/3的石油醚-乙醚-乙醇（30:10:0.5），放上層析濾紙，蓋好另一培養(yǎng)皿展開。為了減少葉綠素的分解，可將培養(yǎng)皿置于棕色干燥器中。本法可以很好的分離天然葉綠素a和葉綠素b，重現(xiàn)性較好。多次制備可以得到少量高純的天然葉綠素a和葉綠素b純品。 方法二：在一個(gè)半升大的層析缸里進(jìn)行，放入1.5 cm深的CCl4，并讓溶劑飽和一段時(shí)間。取一2020 cm層析濾紙，在濾紙的底部大約2.5 cm處畫一條鉛筆線。利用毛細(xì)管將色素提取

16、液沿著鉛筆線間斷劃一條大約23 cm長(zhǎng)的樣品線，然后使其晾干。必要時(shí)可重復(fù)點(diǎn)樣直至樣品帶呈深綠色。晾干后，將紙卷成一個(gè)松散的圓筒，上端用回型針固定，將其立在層析缸里展開。當(dāng)展開至靠近頂端時(shí)，取出濾紙晾干。 紙色譜分離后，可將葉綠素a和葉綠素b色帶分別剪下，用90% 丙酮浸取色素，低溫避光保存，以備配制光譜標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)使用。2薄層色譜 薄層色譜是一種常用的實(shí)驗(yàn)室分離技術(shù)，具有快速、微量、靈敏度高、分離效率好等優(yōu)點(diǎn)。薄層色譜對(duì)天然產(chǎn)物的分離、鑒定更有獨(dú)到之處，在中草藥有效成分的純化鑒定中廣泛應(yīng)用。 分離葉綠體色素的薄層色譜吸附劑有硅膠、纖維素、聚酰胺和C18等。下面僅介紹常用的硅膠薄層色譜法。(1)薄

17、層板的制備取若干塊洗凈的載玻片（5cm20 cm ），采用硅膠G加適量蒸餾水調(diào)制后制成薄層板，晾干后在105活化0.5 h，放在干燥器內(nèi)備用。(2)點(diǎn)樣取制備好的薄層板一塊，在板兩側(cè)距底邊1.5 cm處各做一記號(hào)，用玻璃毛細(xì)管吸取濃縮的色素石油醚提取液，從距兩側(cè)記號(hào)1.5 cm處，分別用毛細(xì)管點(diǎn)樣，斑點(diǎn)不應(yīng)超過5 mm，晾干。(3)展開分離葉綠體色素的展開劑有：石油醚（6090）-丙酮-乙醚（3:1:1）；石油醚-丙酮（8:2）；石油醚-乙酸乙酯（6:4）和石油醚（3060）-丙酮-正丁醇（90:10:4.5）等。 本實(shí)驗(yàn)將150 mL石油醚（6090）-丙酮-乙醚（3:1:1）展開劑倒入層析

18、缸中，并在層析缸的內(nèi)壁四周貼一張5 cm高的濾紙，濾紙下部浸在展開劑中，蓋好蓋子平衡1015 min。將點(diǎn)好樣的硅膠板放入展開缸里，液面不能超過點(diǎn)樣線，蓋好蓋子進(jìn)行上行層析。待展開劑前沿上升到距硅膠板上端1.52 cm時(shí)，取出硅膠板置于通風(fēng)櫥里晾干，可看到層析板上出現(xiàn)若干色素帶，其排列順序一般是b-胡蘿卜素、去鎂葉綠素、葉綠素a、葉綠素b和葉黃素等多條色帶。用鉛筆標(biāo)記出樣品斑點(diǎn)，計(jì)算各色素的比移值Rf。(4)樣品收集將層析板上分開的b-胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b的色帶分別用干凈的刮刀刮入試管中，加入5 mL丙酮提取，低溫避光保存。（5）溫度對(duì)薄層色譜分離的影響 取兩塊1cm5 cm的商品硅膠

19、板，點(diǎn)樣后，以相同的展開劑，分別置于冰箱（4）和室溫（20以上）展開。觀察和對(duì)比它們的分離結(jié)果。3柱色譜（1）氧化鋁柱色譜 中性氧化鋁應(yīng)在500烘干4 h，然后冷卻至100，迅速裝瓶，置于干燥器中待用。 在直徑1.0 cm的層析柱底部放少量的玻璃絲，上面鋪一層0.5 cm高的海沙，然后加入10 cm高的中性氧化鋁（250目）。輕敲柱子將填料弄平，必要時(shí)可用吸氣機(jī)將氧化鋁填料吸實(shí)。然后再加上一層0.5 cm高的海沙。加入25 mL石油醚，用打氣球加壓浸濕氧化鋁填料。整個(gè)洗脫過程應(yīng)保持液面高于氧化鋁填料。當(dāng)液面接近氧化鋁填料時(shí)，將2.0 mL植物色素的濃縮提取液小心地加到色譜柱頂部。加完后，打開下

20、端活塞，讓液面下降到高于氧化鋁填料1 mm左右，關(guān)閉活塞，加2 mL石油醚，打開活塞，使液面下降，經(jīng)幾次反復(fù)洗滌，使色素全部進(jìn)入氧化鋁柱體。 待色素全部進(jìn)入柱體后，在柱頂小心加入25 mL石油醚-丙酮（9:1）溶液，適當(dāng)加壓洗脫出第一個(gè)有色組分 橙黃色的b-胡蘿卜素溶液。然后用石油醚-丙酮（7:3）溶液洗脫出第二個(gè)色帶 葉黃素(黃色)和第三個(gè)色帶 葉綠素a（藍(lán)綠色）。最后用石油醚-丙酮（1:1）溶液洗脫葉綠素b（黃綠色）組分。收集各色帶后，轉(zhuǎn)入棕色瓶低溫保存。（2）蔗糖柱色譜 將市售白砂糖在粉碎機(jī)中磨碎，摻入3 % 的優(yōu)質(zhì)淀粉，充分混勻，以防止層析過程中糖粉結(jié)塊。糖粉須過140目分樣篩，裝柱前

21、放在70烘箱中干燥4 h。 小心將糖粉裝入色譜柱中，邊裝時(shí)邊敲柱外壁，隨后抽氣使糖柱緊實(shí)。最后制得糖柱高度約為15 cm，并在上面鋪一層海沙。用50 mL石油醚加壓浸濕糖柱。若色譜分離不在暗室中進(jìn)行，色譜柱外面應(yīng)用黑紙包住，以免光照破壞葉綠素。 取5 mL石油醚色素提取液加在柱上，用石油醚洗脫胡蘿卜素。接著用汽油-苯（10:1）洗脫葉黃素，用汽油-苯（1:2）洗脫葉綠素a，最后用乙醚洗脫葉綠素b。4樣品純度的鑒定 色譜法分離得到的樣品組分，可用吸收光譜（400700 nm）和熒光光譜進(jìn)行表征和鑒定。純度和含量參照后面介紹的三種分析技術(shù)進(jìn)行測(cè)定。（五）注 意 事 項(xiàng)1）強(qiáng)光會(huì)破壞色素，提取過程應(yīng)

22、盡可能在弱光或暗室中進(jìn)行。2）使用低沸點(diǎn)易揮發(fā)的有機(jī)溶劑要注意實(shí)驗(yàn)室安全。實(shí)驗(yàn)室要保持良好的通風(fēng)條件，使用有機(jī)溶劑不得靠近明火操作。3）分離后的單一色素提取液不宜長(zhǎng)期存放，必要時(shí)應(yīng)抽干充氮避光低溫保存。（六）思 考 題1）色譜法是一種高效分離技術(shù)，其“高效性”在于獨(dú)特的色譜分離過程。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)觀察到的植物色素分離過程，聯(lián)想和體會(huì)GC和HPLC的分離過程。2） 試簡(jiǎn)述紙色譜分離色素的原理。3） 根據(jù)葉綠體色素的薄層色譜和柱色譜分離情況，試討論流出順序以及Rf和tr參數(shù)之間的關(guān)系。4）試比較葉綠素、胡蘿卜素和葉黃素三種色素的極性。為什么胡蘿卜素在氧化鋁色譜柱中移動(dòng)最快？5）為什么葉綠體色素在中性氧

23、化鋁吸附柱上會(huì)分離成不同的色帶？試從柱色譜原理和有關(guān)色素的化學(xué)結(jié)構(gòu)加以分析。6）有實(shí)驗(yàn)表明，葉綠體色素在硅膠薄板上用異辛烷丙酮乙醚(3:1:1)展開和在反相C18薄板上用甲醇丙酮水（20:4:3）展開的順序正好相反，試解釋這一現(xiàn)象。三、葉綠素a和葉綠素b的導(dǎo)數(shù)分光光度法同時(shí)測(cè)定（一）實(shí) 驗(yàn) 目 的1）了解導(dǎo)數(shù)分光光度法的基本原理和方法。2）掌握利用導(dǎo)數(shù)分光光度法同時(shí)測(cè)定葉綠素a和葉綠素b的方法。（二）實(shí) 驗(yàn) 原 理 取適量葉綠素a（Chl a）和葉綠素b（Chl b）以及類胡蘿卜素（R）的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋到適當(dāng)濃度，均以 600 nm/min的掃描速率在自動(dòng)掃描式分光光度計(jì)上繪制其吸收光譜，并均

24、以= 4 nm 轉(zhuǎn)換成一階導(dǎo)數(shù)光譜。三條導(dǎo)數(shù)光譜的重疊圖見圖34.2。由圖可見：在646 nm 波長(zhǎng)處葉綠素b的一階導(dǎo)數(shù)值為零，而在此波長(zhǎng)處葉綠素a有一定的負(fù)一階導(dǎo)數(shù)值；類似地，在635 nm 波長(zhǎng)處葉綠素a的一階導(dǎo)數(shù)值為零，而在此波長(zhǎng)處葉綠素b有一定的負(fù)一階導(dǎo)數(shù)值,因而在此兩波長(zhǎng)處進(jìn)行測(cè)定，兩者互不干擾。由于類胡蘿卜素（R）在此波長(zhǎng)范圍內(nèi)的一階導(dǎo)數(shù)值均為零，因此也不干擾Chl a和Chl b的測(cè)定。分別以Chl a和Chl b的濃度（由分光光度法確定）為橫座標(biāo)，以相應(yīng)的導(dǎo)數(shù)值為縱座標(biāo)繪制各自的工作曲線。由樣品溶液在相應(yīng)波長(zhǎng)處的導(dǎo)數(shù)值，從各自的工作曲線上即可查得樣品溶液中兩者的含量，再經(jīng)換算即

25、可求得蔬菜葉片樣品中Chl a和Chl b的百分含量。（三）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.儀器1）自動(dòng)掃描式分光光度計(jì)。2）離心機(jī)。2.試劑1）Chl a、Chl b和類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)溶液用購買來的純品試劑配制，或自行用波菜葉經(jīng)紙色譜分離提純后稀釋而得均可。2）丙酮溶液（90%）。 3）MgCO3 (AR)。（四）實(shí) 驗(yàn) 步 驟1）配制 Chl a 和 Chl b的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，應(yīng)用分光光度法確定其濃度。分別移取用購買來的純品試劑配制或用菜葉經(jīng)紙色譜分離提純稀釋而得的Chl a 標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL和5.00 mL于5個(gè)10 mL的棕色容量瓶中，用90的丙酮溶液定

26、容，用分光光度法分別測(cè)定其在644 nm和662 nm 圖34.2 Chla、Chlb和類胡蘿卜素的一階導(dǎo)數(shù)光譜圖 1.Chla(2.815 g/mL)；2.Chlb(2.787 g/mL )；3.類胡蘿卜素(5.802 g/mL).處的吸光度，用CChla(g/mL) = 9.78 A662 - 0.99 A644 計(jì)算其濃度。再分別移取用購買來的純品試劑配制或用菜葉經(jīng)色譜分離提純稀釋而得的Chlb 標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL和5.00 mL于5個(gè)10 mL的棕色容量瓶中，用90 的丙酮溶液定容，用分光光度法分別測(cè)定其在644 nm和662 nm 處的吸光

27、度，用CChlb (g/mL) = 21.43 A644 - 4.65 A662計(jì)算其濃度。2）繪制Chl a 和Chl b的一階導(dǎo)數(shù)譜圖，并確定其導(dǎo)數(shù)測(cè)定波長(zhǎng)。按實(shí)驗(yàn)原理中所闡述的方法繪制Chl a 和Chl b的一階導(dǎo)數(shù)譜圖，并按實(shí)驗(yàn)原理中所述的方法確定其可供測(cè)定的導(dǎo)數(shù)波長(zhǎng)。各組獲得的一階導(dǎo)數(shù)測(cè)定波長(zhǎng)可能略有不同，應(yīng)以自己測(cè)得的為準(zhǔn)。3）繪制Chl a 和Chl b的工作曲線。按上述方法操作，分別測(cè)量各份Chl a 標(biāo)準(zhǔn)溶液一階導(dǎo)數(shù)光譜中646.0 nm 處的導(dǎo)數(shù)峰值Ha（單位：cm）。以Chl a 的含量為橫坐標(biāo)，以Ha為縱坐標(biāo)作圖即得Chl a的工作曲線。同樣按上述方法操作，分別測(cè)量各

28、份Chl b標(biāo)準(zhǔn)溶液一階導(dǎo)數(shù)光譜中635.0 nm 處的導(dǎo)數(shù)峰值Hb(單位：cm)。以Chl b 的含量為橫坐標(biāo)，以Hb 為縱坐標(biāo)作圖即得Chlb的工作曲線。在計(jì)算機(jī)上分別求出Chl a 和Chlb的工作曲線的擬合方程和相關(guān)系數(shù)。將數(shù)據(jù)和計(jì)算結(jié)果填入表34.2和表34.3中。4）蔬菜葉片樣品中Chl a 和Chl b含量的測(cè)定。取0.5 g左右新鮮去脈的菜葉，準(zhǔn)確稱重。剪碎，置于研缽中，加0.15 g MgCO3和 3 mL 90% 丙酮，研磨至漿狀。抽濾，多次洗滌。濾液收集在 50 mL容量瓶中，以90% 丙酮定容。按上述方法以90 丙酮溶液作為參比溶液進(jìn)行測(cè)定,即可獲得樣品溶液的一階導(dǎo)數(shù)譜

29、圖。分別量取Ha和Hb，由Chl a和Chl b的標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查出樣品溶液中Chl a和Chl b的含量。將數(shù)據(jù)和計(jì)算結(jié)果填入表34.4中。 因?yàn)镃hl a和Chl b很容易受光分解，因此上述樣品溶液的制備過程應(yīng)盡可能快些。（五）數(shù)據(jù)記錄與處理 完成表34.2表34.4的填寫。表 34.2 Chl a 工作曲線的繪制 序號(hào) A644A662Cchla/(g/mL)H646/cm 1 2 3 4 5擬合方程： ： 表 34.3 Chl b 工作曲線的繪制序號(hào)A644A662Cchlb/(g/mL)H435/cm12345擬合方程： 表 34.4 樣品測(cè)定結(jié)果（ 樣品： 菜葉；稱重： g ）H6

30、46/cmCchla/(g/mL)樣品中Cchla含量/%H635/cmCchlb/(g/mL)樣品中Cchlb含量/%（六）思 考 題1）既然文獻(xiàn)上可以用分光光度法的經(jīng)驗(yàn)公式測(cè)定Chl a和Chl b，為何還要用導(dǎo)數(shù)分光光度法測(cè)定蔬菜葉片中Chl a和Chl b的含量？2） 導(dǎo)數(shù)分光光度法有何特點(diǎn)？如何選擇Chl a和Chl b的測(cè)定波長(zhǎng)？3） 研磨菜葉樣品時(shí)為何要加入固體碳酸鎂？四、葉綠素a和葉綠素b的同步熒光法測(cè)定（一）實(shí) 驗(yàn) 目 的1）掌握同步熒光分析基本原理和測(cè)量方法。2）進(jìn)一步掌握熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)。（二）實(shí) 驗(yàn) 原 理 同步熒光分析法是多組分同時(shí)分析的良好手段之一

31、，以其譜圖簡(jiǎn)單、選擇性高及散射光干擾少等優(yōu)點(diǎn)而引起人們的注意，獲得廣泛的應(yīng)用。 在常規(guī)熒光分析中，所獲得的兩種類型的光譜是熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。而同步熒光光譜是在同時(shí)掃描激發(fā)和發(fā)射兩個(gè)單色器波長(zhǎng)的情況下測(cè)繪光譜的，由測(cè)得的熒光強(qiáng)度信號(hào)與對(duì)應(yīng)的激發(fā)波長(zhǎng)(或發(fā)射波長(zhǎng))構(gòu)成光譜圖，稱為同步熒光光譜。根據(jù)單色器掃描方式的不同，同步熒光法又可分為恒波長(zhǎng)法、可變角法和恒能量法。最早提出、目前最廣為使用的恒波長(zhǎng)同步熒光分析法，即在掃描過程中使激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)兩者之間始終保持固定的波長(zhǎng)間隔（=em - ex）。對(duì)該法而言，波長(zhǎng)差是關(guān)鍵性的實(shí)驗(yàn)參數(shù)?？勺兘峭綗晒夥ㄌ峁┝烁鼮殪`活的波長(zhǎng)掃描方式。該法激發(fā)和發(fā)

32、射單色器保持同時(shí)掃描，但掃描速率不同，所得的可變角同步熒光光譜常更能滿足體系中各組分的波長(zhǎng)要求，光譜選擇性更好, 但一般商品化熒光分光光度計(jì)上尚不具備該掃描功能。Lumex公司新近的Fluorat02-Panorama型熒光分光計(jì)可進(jìn)行線性可變角同步掃描。恒能量同步熒光法特別適于某些多環(huán)芳烴的分析，在掃描過程中保持激發(fā)和發(fā)射單色儀之間恒定的波數(shù)差關(guān)系，PERKIN ELMER 公司的LS50 B和 LUMEX公司的Fluorat02- Panorama等型號(hào)的熒光分光計(jì)己具備該功能。對(duì)于某種待測(cè)物質(zhì)，在實(shí)驗(yàn)條件保持固定的情況下，同步熒光信號(hào)與待測(cè)物質(zhì)的濃度成正比。葉綠素a和葉綠素b的分子結(jié)構(gòu)相

33、似，它們的熒光激發(fā)光譜和發(fā)射光譜重疊嚴(yán)重，用常規(guī)熒光方法難以實(shí)現(xiàn)其同時(shí)測(cè)定。葉綠素a和葉綠素b的發(fā)射峰分別位于667 nm和650 nm；葉綠素a有兩激發(fā)峰，強(qiáng)峰在428 nm，次峰在409 nm，而葉綠素b的激發(fā)峰位于457 nm。本實(shí)驗(yàn)采用同步熒光測(cè)定技術(shù)，用258 nm得到適宜于葉綠素a測(cè)定的同步熒光光譜，葉綠素b不干擾；用193 nm得到適宜于葉綠素b的同步熒光光譜，葉綠素a不干擾。然后根據(jù)各自的同步熒光峰強(qiáng)度與對(duì)應(yīng)濃度的線性關(guān)系進(jìn)行定量測(cè)定。（三）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.儀器1）自動(dòng)掃描式熒光分光光度計(jì)。2）離心機(jī)。2.試劑1）Chla、Chlb 和類胡蘿卜素的標(biāo)準(zhǔn)溶液用購買來的純品試劑配

34、制，或自行用波菜葉經(jīng)紙色譜分離提純后稀釋而得均可。 2）丙酮溶液（90%）。 3）MgCO3 (AR)。（四）實(shí) 驗(yàn) 步 驟1.標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 取葉綠素a和b的儲(chǔ)備液，分別用90 %丙酮稀釋成O ng/mL、40.0 ng/mL、80.0 ng/mL、 120 ng/mL、160 ng/mL和200 ng/mL 的兩個(gè)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。2.熒光激發(fā)和發(fā)射光譜的測(cè)繪 葉綠素a：取葉綠素a 和葉綠素b 標(biāo)準(zhǔn)溶液各一份(以160 ng/mL為例), 定激發(fā)波長(zhǎng)為428 nm，在600800 nm 范圍內(nèi)掃描其熒光發(fā)射光譜；定發(fā)射波長(zhǎng)為667 nm，在350600 nm 范圍內(nèi)掃描其熒光激發(fā)光譜。 葉綠素

35、b：定激發(fā)波長(zhǎng)為457 nm，在600800 nm 范圍內(nèi)掃描其熒光發(fā)射光譜；定發(fā)射波長(zhǎng)為650 nm ，在350600 nm范圍內(nèi)掃描其熒光激發(fā)光譜。3.同步熒光光譜的測(cè)繪 測(cè)葉綠素a，排除葉綠素b的干擾:取葉綠素a和b標(biāo)準(zhǔn)溶液各一份(以160 ng/mL為例)，用258 nm 在激發(fā)波長(zhǎng)350600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行同步掃描，僅得葉綠素a的同步熒光光譜，葉綠素b幾乎無信號(hào)。 測(cè)葉綠素b，排除葉綠素a的干擾:取葉綠素a和b標(biāo)準(zhǔn)溶液各一份，用193 nm在激發(fā)波長(zhǎng)350600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行同步掃描，僅得葉綠素b的同步熒光光譜，葉綠素a幾乎無信號(hào)。4.工作曲線 測(cè)葉綠素a: 以258 nm 對(duì)系

36、列葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行同步掃描，由同步熒光峰信號(hào)對(duì)濃度繪制成工作曲線。 測(cè)葉綠素b: 采用193 nm, 同上法繪制葉綠素b的工作曲線。5.菜葉中葉綠素a和b的測(cè)定取干凈新鮮菜葉0.5 g，剪碎置于研缽，加入0.1 g MgCO3和23 mL丙酮，研磨至漿狀，用濾紙過濾，以少量90% 丙酮多次洗滌，將丙酮萃取液收集于25 mL棕色容量瓶中，用90% 丙酮稀釋至刻度。取適量溶液再稀釋100倍。用與繪制工作曲線相同的方法分別測(cè)葉綠素a和b的同步熒光峰強(qiáng)度，查對(duì)工作曲線，求出濃度值，計(jì)算出菜葉中葉綠素a和b的含量。（五）注 意 事 項(xiàng)1）葉綠素見光易分解，注意避光操作。2）注意熒光分光光度計(jì)的開關(guān)機(jī)

37、順序。開機(jī)時(shí)主機(jī)電源需在確認(rèn)氙燈亮后才開啟。關(guān)機(jī)時(shí)則相反，主機(jī)電源先關(guān)。（六）思 考 題1）葉綠素同步熒光光譜和常規(guī)熒光光譜相比，有什么不同？2）討論同步熒光光譜分析方法的特點(diǎn)。如何選擇同步掃描波長(zhǎng)（）？3）本實(shí)驗(yàn)采用恒波長(zhǎng)差方式進(jìn)行同步熒光法分析，經(jīng)兩次掃描步驟，直接測(cè)出植物提取液中葉綠素a和b的含量。能否采用一種更簡(jiǎn)便的方式，僅用一次掃描即可得到同步熒光光譜從而完成葉綠素a和b的測(cè)定？請(qǐng)加以解釋。五、高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定葉綠素和類胡蘿卜素（一）實(shí) 驗(yàn) 目 的1）了解高效液相色譜在葉綠體色素全分析的應(yīng)用。2）掌握生物樣品的高效液相色譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)。3）掌握二極管陣列檢測(cè)和串聯(lián)檢測(cè)器原理。4）初

38、步掌握梯度洗脫實(shí)驗(yàn)技術(shù)。（二）實(shí) 驗(yàn) 原 理 從植物提取液分離出來的葉綠素和胡蘿卜素已發(fā)現(xiàn)有多種異構(gòu)體，而且常常是同時(shí)存在的。因此對(duì)葉綠素和胡蘿卜素的深入研究較為困難。高效液相色譜既能對(duì)單一組分進(jìn)行定量，又能對(duì)混合物中的多組分在分離的基礎(chǔ)上進(jìn)行定量。既能用于主要成分的含量測(cè)定，又能用于微量和痕量組分的測(cè)定。高效液相色譜是一種準(zhǔn)確度好和精密度高的分析技術(shù)。因此，盡管難以得到所有的植物色素標(biāo)準(zhǔn)品，但高效液相色譜-光譜、質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)仍被認(rèn)為是研究葉綠素和胡蘿卜素的一種最有效手段。葉綠體色素提取液可以采用正相或反相高效液相色譜法分析，實(shí)驗(yàn)表明，反相高效液相色譜法更加方便。但由于色素提取液各組分的極性差

39、別較大，等度洗脫可能使某些組分的分離不夠完全。因此，對(duì)植物色素提取液的全分析應(yīng)采用梯度洗脫方式以改善分離和縮短分析時(shí)間。 本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法，結(jié)合二極管陣列和熒光檢測(cè)技術(shù)對(duì)綠色植物葉片提取液中的色素進(jìn)行較全面的分離和光譜鑒定，并可直接測(cè)定葉綠素a、葉綠素b和b-胡蘿卜素等植物色素的含量。（三）實(shí)驗(yàn)儀器與試劑1.儀器日本島津公司高效液相色譜儀: LC-10A TVP高壓梯度泵；DGU-12A在線脫氣機(jī)；SPD-M10AVP二極管陣列檢測(cè)器；RF-10A XL熒光檢測(cè)器；CTO-10ASVP柱溫箱；Rheodyne 7725i 進(jìn)樣閥；CLASS-VP色譜工作站。Shim-pack VP-O

40、DS( 4.6mm150 mm)色譜柱，附加一Shim-pack GVP-ODS（4.6mm10 mm)保護(hù)柱。2.試劑葉綠素a、葉綠素b和b-胡蘿卜素純品為Sigma公司產(chǎn)品，甲醇和乙腈為液相色譜淋洗劑，二氯甲烷為AR試劑，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。（四）實(shí) 驗(yàn) 步 驟1.色素的提取取0.5 g左右干凈的新鮮的去脈菜葉，準(zhǔn)確稱重。剪碎，置于研缽中，加少許MgCO3固體和 5 mL 90% 丙酮，研磨至漿狀，分次加入5 mL 丙酮，瀝出提取液。高速離心后，移出上清液。重復(fù)提取直至植物組織無色。合并上清液，轉(zhuǎn)入 25 mL容量瓶中，以90% 丙酮定容。試液經(jīng)過0.2 m 有機(jī)相針筒式微孔濾膜過濾器直接注

41、入色譜儀分析。 另取一菜葉在沸水中煮5 min，然后放入水中冷卻，用紙吸干后按上述方法提取色素，用于對(duì)照菜葉加熱后色素成分有否變化。2.流動(dòng)相的配制實(shí)驗(yàn)前，配制二氯甲烷-乙腈-甲醇（20:20:60，體積比）流動(dòng)相。流動(dòng)相需用0.45 mm微孔膜過濾和超聲波除氣后使用。3.色譜條件試驗(yàn)色譜柱為Shim-pack VP-ODS，另加一Shim-pack GVP-ODS（4.6mm10 mm)保護(hù)柱。流動(dòng)相為二氯甲烷-乙腈-甲醇（20:20:60，體積比），流速為1.5 mL/min，二極管陣列檢測(cè)范圍為370800nm（其他檢測(cè)器選擇440 nm和660 nm為檢測(cè)波長(zhǎng))，熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為4

42、40 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為660 nm。進(jìn)樣體積為20 mL。如儀器正常，可進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)化合物試液分析得到正確的色譜圖。標(biāo)準(zhǔn)試液組分的出峰順序依次為葉黃素、葉綠素b、葉綠素a和b-胡蘿卜素。如分離不理想，可適當(dāng)調(diào)節(jié)試驗(yàn)條件，使之得到良好的分離度和重現(xiàn)性的色譜圖為止。可通過不同吸收波長(zhǎng)的色譜圖、二極管陣列光譜圖和熒光色譜圖討論葉黃素、葉綠素b、葉綠素a和b-胡蘿卜素的光譜特征和色譜定性技術(shù)。4.標(biāo)準(zhǔn)或參考色素混合樣測(cè)定本實(shí)驗(yàn)采用單點(diǎn)校正法測(cè)定樣品含量。對(duì)一已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)色素混合液或參考植物色素樣品液進(jìn)行2次平行分析，平均計(jì)算對(duì)應(yīng)于已知濃度的葉綠素b、葉綠素a和b-胡蘿卜素的峰面積。5.實(shí)際樣品測(cè)定油菜、小

43、白菜和生菜等的色素提取物經(jīng)0.2m針頭式過濾器直接進(jìn)樣分析。根據(jù)保留值定性，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣計(jì)算各組分含量。6.植物色素提取液的全分析參考文獻(xiàn)25,26，設(shè)計(jì)一梯度洗脫程序，如流動(dòng)相A為甲醇-水（9:1，體積比），流動(dòng)相B為乙酸乙酯或二氯甲烷-乙腈-甲醇（20: 20 : 60，體積比），探索植物色素提取液的全分析。梯度洗脫條件應(yīng)包括流動(dòng)相A和B的溶劑組成、梯度曲線和平衡時(shí)間等。觀察并討論色譜圖變化和梯度洗脫原理。(五)注 意 事 項(xiàng)1)在所有的提取過程中，應(yīng)盡可能防止色素發(fā)生分解、氧化。操作過程中均應(yīng)在避免高溫、強(qiáng)光照射、高濕度、低pH值條件下迅速完成。2)色素提取液可能含有不溶物（如植物組織），

44、必須除去，否則將縮短柱壽命。實(shí)驗(yàn)過程采用保護(hù)柱和針頭過濾器保護(hù)色譜柱。3)開啟儀器應(yīng)按操作規(guī)程，觀察儀器參數(shù)是否在設(shè)定范圍內(nèi)。待儀器穩(wěn)定后，方可進(jìn)樣分析。4)每完成一種試液分析，應(yīng)用丙酮等溶劑將進(jìn)樣注射針徹底洗干凈。否則會(huì)引起樣品殘留，影響下一個(gè)樣品分析。5)實(shí)驗(yàn)結(jié)束，應(yīng)按規(guī)定清洗儀器，方能關(guān)機(jī)。(六)思 考 題1)在HPLC中，采用二極管陣列檢測(cè)有什么好處？如何確定色譜峰的純度？2)為什么要進(jìn)行梯度洗脫？在梯度洗脫過程中要注意哪些問題？3)對(duì)生物樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，應(yīng)對(duì)進(jìn)樣溶液做那些預(yù)處理？4)如何確定待測(cè)組成的色譜峰及含量？5)為什么熒光檢測(cè)器要接在二極管陣列檢測(cè)器之后？6)在相同的

45、紫外或熒光波長(zhǎng)檢測(cè)條件下，為什么高效液相色譜法的濃度檢測(cè)靈敏度不如紫外吸收光譜法或熒光光譜法？7)對(duì)比同一份植物葉片試液的三種分析結(jié)果，簡(jiǎn)述導(dǎo)數(shù)分光光度法、同步熒光法和高效液相色譜法的分析原理和方法特點(diǎn)。8)在葉綠體色素含量測(cè)定過程中，應(yīng)如何保證導(dǎo)數(shù)分光光度法、同步熒光法和高效液相色譜法三種方法分析結(jié)果的可比性？參 考 文 獻(xiàn)1 . 列別捷夫.植物生理學(xué)，楊漢金，衛(wèi)新中譯.廈門：廈門大學(xué)出版社，1991，77 2 Goodwin T W. Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments, Vol.2, New York ：Academic Press,

46、 1976, 1 and 383 Diehl-Jones S.Chlorophyll Separation and Spectral Identification.J of Chem Educ, 1984, 61(5)：4544564 李國剛，高小霞. 葉綠素的伏安行為和測(cè)定，分析化學(xué)， 1992，20（9）：9899925 秦浩然,馬魁英.淺談葉綠素色素的提取、分離實(shí)驗(yàn)的基本原理.生物學(xué)通報(bào)，1989，（9），696 朱廣廉，鐘海文，張愛琴.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)，北京：北京大學(xué)出版社，1990，467 蘭州大學(xué)等，有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn)，北京：高等教育出版社，1994，2728 赤堀四郎,木村健二郎.基礎(chǔ)化

47、學(xué)實(shí)驗(yàn)大全有機(jī)化學(xué)實(shí)驗(yàn).吳琪，王文紅.北京：科學(xué)普及出版社，1988，2359 Drexlor D. Ballschmiter K.,Separation of Chlorophyll a and Metalloporphyrins by HPLC in Normal-Phase Mode Using Adiol-Phase.Fresenius J Anal Chem. 1994, 348(8-9), 59059410 張志良，生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)，北京：高等教育出版社，1990，7811 薛應(yīng)龍，植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)，北京：高等教育出版社，1985，5912 Fried B, Sherma J，Thin Layer Chromatography, New