大黃酸治療STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的遠(yuǎn)期實(shí)驗(yàn)研究

1、大黃酸治療STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠的遠(yuǎn)期實(shí)驗(yàn)研究摘要目的：觀察長(zhǎng)期應(yīng)用大黃酸對(duì)糖尿病大鼠遠(yuǎn)期病變的療效。方法：采用小劑量STZ腹腔內(nèi)多次注射法建立糖尿病大鼠動(dòng)物模型。動(dòng)物分為糖尿病對(duì)照組，糖尿病大黃酸治療組，和正常對(duì)照組。其中糖尿病治療組分別給不同劑量的大黃酸(25，100mg/kg.d-1)。定期觀察一般情況，血糖及血生化指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定24h尿蛋白排出量。連續(xù)治療12個(gè)月宰殺大鼠，稱取右腎重量，并留光鏡標(biāo)本觀察腎組織病理學(xué)改變。結(jié)果：(1)糖尿病模型建立12月后，糖尿病大鼠體重明顯低于正常對(duì)照大鼠；血壓及心室重量與正常對(duì)照大鼠無(wú)明顯差別；血肌酐，總膽固醇及甘油三酯水平較正常對(duì)照大鼠升高。糖尿病模

2、型建立4周時(shí)出現(xiàn)少量尿蛋白，12月時(shí)尿蛋白水平明顯高于正常對(duì)照大鼠(65.236.4vs8.94.9mg24h，P0.01)，腎臟重量也較正常對(duì)照大鼠增加(0.94040.0999gvs0.81770.0304g，P0.05)。光鏡下可見(jiàn)糖尿病大鼠腎小球，絲球體及系膜區(qū)面積均較正常對(duì)照大鼠增加，但未見(jiàn)明顯的腎小球硬化。(2)治療期間大鼠血糖水平較糖尿病未治組大鼠略低。治療12月后，大黃酸組大鼠血肌酐，總膽固醇及甘油三酯水平較糖尿病對(duì)照組降低，大黃酸100mg組療效較強(qiáng)。大鼠體重，平均動(dòng)脈壓及心室重量與糖尿病未治組大鼠相比無(wú)顯著差別。(3)大黃酸治療12月后，糖尿病大鼠尿蛋白排泄量較糖尿病對(duì)照組

3、大鼠減少，其中高劑量組降低較為明顯。治療組大鼠腎臟重量，腎小球面積及系膜區(qū)面積也較糖尿病對(duì)照大鼠減小。12月時(shí)，糖尿病大鼠腎小球TGF1及GLUT1mRNA表達(dá)升高，大黃酸治療后降低明顯。結(jié)論：(1)STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠12月時(shí)可出現(xiàn)較明顯的腎臟病變，表現(xiàn)為尿蛋白排出量增加，腎臟肥大，腎小球面積及絲球體面積加大，系膜區(qū)增寬；(2)大黃酸可以降低糖尿病大鼠尿蛋白排出量，減輕腎臟肥大，縮小腎小球面積及系膜區(qū)面積，降低腎小球TGF1及GLUT1mRNA的高表達(dá)，并可改善糖尿病大鼠的血脂代謝異常，有輕度降血糖作用；(3)大黃酸治療糖尿病腎病的機(jī)制可能與其糾正機(jī)體及細(xì)胞代謝異常，降低TGF-1產(chǎn)生有關(guān)，

4、其對(duì)腎小球血流動(dòng)力學(xué)是否有影響，尚待進(jìn)一步研究。關(guān)鍵詞大黃酸糖尿病腎病大鼠 EFFECTS OF RHEIN IN INHIBITING T HE PROGR ESSION OF DIABETIC NEPHROPATHY IN STZ-IN DUCED DIABETIC RATSDai Chunsun， Liu Zhihong， Chen Huip ing， Yang Junwei， Zhou Hong， Li LeishiResearch Institute of Nephrology， Jinlin g Hospital，Nanjing University School of Medic

5、ine，Nanjing 210002OBJECTIVE To investigate rhe ins long-term effects on the progression of diabetic nephropathy and the metabo lism disturbance in STZ-induced diabetic ratsMETHODOLOGY Diabetes was ind uced with multi-injection of low-dose STZ in Wistar rats Wistar rats were di vided into three group

6、s， the untreated diabetic control group， rhein treated dia betic group and the normal control groupOrdinary parameters， urine protein exc re tion and histopathology were investigated for 12months after the induction of di abetesRESULTS At the 12th month af ter induction of diabetes， body weight of d

7、iabetic rats was significantly lower than normal control group，blood pressure and cardiac ventricular weight were sim ilar to those in normal control group，serum creatini ne，cholesterol，and triglyceride were significantly higher in diabetic groupR ats in diabetic group were found to have mild increa

8、se in urine protein excretion at the 4th week after induction of diabetesAt the 12th month，there were significant increases in urine protein excretion （65.236.4 vs 8.94.9mg24hrs，P0.01），kidney weight （0.94040.0999 vs 0.81770.0304g，P0.05），glomerular and mesangial area in diabetic rats as comp ared to

9、those of normal controlsComparing to the untreated diabetic rats，the serum glucose concentration was lower in rhein treated diabetic rats during the 12 months after induction of diabetesBo dy weight，blood pressure and cardiacven tricular weight were not significantly different among these groupsAs c

10、ompared to those in untreated diabetic rats，urine protein excretion ，kidney weight，glomerular and mesangial area were decre a sed significantly in rhein treated diabe tic rats at the 12th month after indu ction of diabetes The mRNA content of T GF 1 and GLUT1 were also decreased in rhein treated dia

11、betic ratsCONCLUSION Rhein can decreas e the urine protein excretion，kidney weight， glomerular area and mesangial ECM deposition in STZ-induced diabetic rats The mechanism for rheins inhibition may be related to its amelioration of the cellular metabolismKey words diabetes nephropat hyrhein rats大黃酸(

12、Rhein,4,5 dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid)是從大黃蒽醌衍生物中分 離出的一種單體組份1。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，大黃酸可以抑制高糖培養(yǎng)條件下腎小球系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)合成的增加，對(duì)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1(transforming growth factor 1，TGF1)所致系膜細(xì)胞I型葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(glucose transport 1,GLUT1)的高表達(dá)以及系膜細(xì)胞糖攝入的增加也有明顯的抑制作用2。作者以往的研究結(jié)果證實(shí)，大黃酸可以抑制STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠初期的腎臟肥大3，但長(zhǎng)期應(yīng)用大黃酸對(duì)糖尿病大 鼠腎臟病變以及機(jī)體代謝水平有何影響，目前并不明

13、確。本研究采用小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)腹腔內(nèi)多次注射法建立糖尿病鼠模型 。模型建立后經(jīng)口給予大黃酸治療一年。觀察一年期間大黃酸對(duì)糖尿病大鼠腎臟病變及代謝紊亂的影響，并在此基礎(chǔ)上對(duì)大黃酸治療糖尿病腎病的可能機(jī)制進(jìn)行了初步的探討。1材料和方法1.1藥物大黃酸均從正品掌葉大黃(甘肅省西寧市藥材公司)中提取，由本院中心儀器科提供，經(jīng)HPLC檢驗(yàn)藥品純度在90%以上。12實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及糖尿病模型建立采用清潔級(jí)三月齡雌性Wistar大鼠40只，購(gòu)自上海動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。大鼠體重在180200g之間。實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物室溫控制在2528，濕度70%，12h交替照明。大鼠自由飲水、進(jìn)食，保

14、持墊料干燥。飼料中蛋白含量為20%，膽固醇含量為3.5%。以小劑量STZ(Sigma公司)腹腔內(nèi)多次注射法建立糖尿病動(dòng)物模型，STZ溶于pH4.0枸櫞酸緩沖液中，每次藥量在10min內(nèi)用完。以20mg/(kg.d)連續(xù)腹腔內(nèi)給藥三次后，減量至10mg/(kg.d)一次，48h后經(jīng)大鼠眶后靜脈叢采血測(cè)血糖，以血糖水平高于13.9mmol/L且尿糖陽(yáng)性作為糖尿病動(dòng)物模型建立標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測(cè)尿酮，個(gè)別血糖水平過(guò)高者采用適量胰島素對(duì)癥處理。1.3實(shí)驗(yàn)分組糖尿病模型建立后，將動(dòng)物隨機(jī)分為兩組，即A組(糖尿病對(duì)照組，n=10)，B組(糖尿病治療組，分別設(shè)大黃酸100mg/(kg.d)及25mg(kg.d

15、)兩個(gè)劑量組，每組n=10)并設(shè)C組(正常對(duì)照組，n=10)。大黃酸以間隔一月交替灌胃與經(jīng)飼料給藥的方式進(jìn)行。將大黃酸溶于75%酒精后用生理鹽水稀釋10倍，制成藥物濃度為0.5g/L大黃酸灌胃，或根據(jù)大鼠每天的進(jìn)食量，制成含有不同劑量大黃酸的大鼠飼料，每天喂食。對(duì)照組給予等量的生理鹽水或飼料。1.4標(biāo)本留取141普通標(biāo)本實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后，每月稱體重，測(cè)定進(jìn)食量，尿量和血糖一次。血標(biāo)本以玻璃毛細(xì)管(直徑1.0mm)經(jīng)大鼠框后靜脈叢采取，6h內(nèi)離心分離血清，于-20冰箱保存待測(cè)，尿標(biāo)本采用金屬代謝籠(購(gòu)自蘇州動(dòng)物實(shí)驗(yàn)儀器廠)收集，收集時(shí)預(yù)先將大鼠放入洗凈的代謝籠內(nèi)，二天后開(kāi)始收集24h尿標(biāo)本，記錄尿量后

16、取5ml，5000r/min離心5min，去除沉渣并于20冰箱保存待測(cè)。1.4.2腎組織病理標(biāo)本及腎小球分離實(shí)驗(yàn)12月時(shí)，大鼠經(jīng)氯胺酮麻醉后，取腹正中切口暴露雙腎及腹主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈插管，用冷PBS將雙腎充分灌洗后，取左腎經(jīng)腎門(mén)冠狀面取組織，石蠟切片，厚4m，行HE，PAS及PAM染色。并取腎組織于20冰箱保存留做冰凍切片。同時(shí)取右腎，去除腎包膜及腎門(mén)結(jié)締組織并用生理鹽水清洗干凈后用電子天平稱取右腎重量，并參照文獻(xiàn)4取右腎及部分左腎分離腎小球。在顯微鏡下觀察，純度在95%以上。1.5實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測(cè)1.5.1一般指標(biāo)血糖每月檢測(cè)一次；血生化指標(biāo)用HITACH-7150自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)；尿蛋白

17、定量采用考馬斯亮蘭G-250法；尿肌酐采用堿性苦味酸法；外周血糖化血紅蛋白(HbAlC)采用試劑盒(Bio-Rad,USA)。1.5.2大鼠平均動(dòng)脈壓及心室重量測(cè)定實(shí)驗(yàn)12月時(shí)每組隨機(jī)取4只大鼠，用氯氨酮50mg/100g與硫噴妥鈉5mg/100g聯(lián)合腹腔注射麻醉后，經(jīng)右側(cè)股動(dòng)脈插管，靜置1520min，用二道生理記錄儀(上海生理實(shí)驗(yàn)儀器廠)記錄平均動(dòng)脈壓(MAP)；實(shí)驗(yàn)12月宰殺大鼠取大鼠心臟，用生理鹽水充分洗凈心腔內(nèi)積血，去除心包膜及雙側(cè)心房后用電子天平稱取心室重量。1.5.3腎組織病理定量分析取PAS染色切片，用彩色CDD攝像機(jī)，VC32真彩色像處理板，用C語(yǔ)言編制實(shí)現(xiàn)了對(duì)腎組織中腎小球

18、進(jìn)行定量的彩色像處理系統(tǒng)。高倍鏡下(20倍)，每份標(biāo)本測(cè)10個(gè)正切的腎小球，分別測(cè)定腎小球，腎小球血管袢，系膜區(qū)及絲球體面積。154大鼠腎小球TGF-1及GLUT1 mRNA定量取腎小球，采用硫氰酸胍一步法提取RNA，參照文獻(xiàn)5，采用RT-PCR法對(duì)腎小球中TGF-1及GLUT1 mRNA進(jìn)行定量，大鼠TGF-1引物序列為：正引物：5-CGAGGT GAC CTG GGC ACC ATC CAT GAC，負(fù)引物：5-CTG CTC CAC CTT GGG CTT GCG ACC CAC(280bp)。-Actin引物序列為：正引物：5-AAC CCT AAG GCC ACC CGT GAA A

19、AG-3，負(fù)引物：5-TGG ACT GTC TGA TGG AGT ACT-3(240bp)。PCR反應(yīng)條件為：943min；94變性1min、60退火1min、72延伸2min，共35個(gè)循環(huán)；72再延伸10min。GLUT1 mRNA采用增強(qiáng)PCR法進(jìn)行檢測(cè)6，7，GLUT1引物序列為：正引物：5-CAT GTG CTT CCA ATA TGT GG-3，負(fù)引物：5-GTC AGT TTG GAA GAG GTC TC-3(312bp)。-Actin引物序列為：正引物：5-CTA CAA TGA GCT GCG TGT GG-3(cDNA192-211)，負(fù)引物：5-TAG CTC TTC

20、 TCC AGG GAG GA-3(450bp)。PCR反應(yīng)分兩步：第一步為：943min；94變性1min，55退火2min，72延伸2min，共20個(gè)循環(huán)；第一步反應(yīng)結(jié)束后，在反應(yīng)體系中再加入Mg2，10buffer，dNTP，GLUT1primer1及primer2,-Actinprimer1及primer2，-Actin，Taq酶，反應(yīng)條件為941min，55變性1min，72退火1min共25個(gè)循環(huán)，最后72延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。用四新象分析儀及其軟件對(duì)電泳條帶亮度及其面積相對(duì)百分比進(jìn)行分析。1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理計(jì)量資料均以s表示，多組間比較采用方差分

21、析，F(xiàn)檢驗(yàn)；兩組間均值比較采用t檢驗(yàn)。P0.05為差異顯著，P0.01為差異極顯著。2結(jié)果2.1一般情況實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)正常對(duì)照大鼠體重平均增加40.52.5%(279.313.2gvs198.67.2g,P0.01)。糖尿病大鼠模型建立后三個(gè)月內(nèi)大鼠體重有降低趨勢(shì)，其后體重有輕度增加，但12月時(shí)體重仍明顯低于正常對(duì)照大鼠(216.520.8gvs279.313.2，P0.01)。兩組大黃酸治療組大鼠的體重變化與糖尿病對(duì)照大鼠相似，12月時(shí)三組糖尿病大鼠的體重?zé)o明顯差別(216.520.8gvs222.521.0gvs224.415.7g,P0.05)。觀察期間糖尿病大鼠進(jìn)食量較正常大鼠明顯增加，而

22、大黃酸治療后大鼠每天的進(jìn)食量與糖尿病對(duì)照組大鼠相比并無(wú)明顯差別。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，三組糖尿病大鼠的血壓及心室重量相近，較正常對(duì)照也并無(wú)明顯升高(見(jiàn)表1)。表1糖尿病模型建成12月時(shí)大鼠一 般情況的變化 體重(g)進(jìn)食(g/24h)血糖(mmol/L)糖化血紅蛋白(%)平均動(dòng)脈壓 (Pa)心室重量(10-1g)糖尿病對(duì)照216.520.8 20.52.40.316.11.486.9 980.614大黃酸100mg222.521.019.72.620.0*16.80.876.7290.540大黃酸25mg224.415.721.04.00.716

23、.50.847.0120.620正常對(duì)照279.313.217.02.13.01.03.70.516 .50.336.9290.419與糖尿病對(duì)照組相比*P0.05；與正常對(duì)照組相比P0.05； P0.01 糖尿病模型建立后三組糖尿病大鼠血糖水平相近，明顯高于正常對(duì)照大鼠(21.71.5，22.61.3，22.41.1mmol/Lvs3.00.4mmol/L，P0.05)。模型建成后6個(gè)月以內(nèi)，糖尿病大鼠血糖水平呈緩慢增長(zhǎng)的趨勢(shì)，6月時(shí)最高，其后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)血糖水平略有回落，但其水平一直保持在13.9mmol/L以上。大黃酸治療后大鼠血糖水平較糖尿病對(duì)照組大鼠略低，其中大黃酸100mg組6個(gè)月

24、時(shí)血糖水平降低差異明顯(1)。12月時(shí)糖尿病大鼠的糖化血紅蛋白(HbA1C)水平明顯高于正常對(duì)照大鼠，大黃酸治療后大鼠HbA1C水平低于糖尿病對(duì)照大鼠，其中100mg劑量組差異顯著(表1)。糖尿病模型建成12月時(shí)大鼠血清總蛋白及白蛋白水平明顯低于正常對(duì)照大鼠，血尿素氮，肌酐，血清總膽固醇及甘油三酯水平較正常對(duì)照大鼠明顯升高。大黃酸治療12月后大鼠血清肌酐，總膽固醇及甘油三酯水平均低于糖尿病對(duì)照組大鼠，血清總蛋白及白蛋白水平高于糖尿病對(duì)照組大鼠。大黃酸100mg治療組大鼠血清總膽固醇，甘油三酯，及血清肌酐水平改善較25mg治療組大鼠明顯(見(jiàn)表2)。1糖尿病模型建成12月內(nèi)各組大鼠血糖水平變化表2

25、糖尿病模型建成12月時(shí)各組大 鼠血生化指標(biāo)變化大黃酸組糖尿病對(duì)照組(n=7)正常對(duì)照組(n=10)100mg/kg(n=8)25mg/kg(n=9)TP5.561.83.265.42.4ALB30.11.7*31.13.2*2.2BUN6.20.2SCr64.03.0*70.85.369.03.663.83.1Ch2.390.24*2.420.232.64TG1.180.55*1.530.411.660.301.040.22 與糖尿病對(duì)照組相比*P0.05；與正常對(duì)照組相比P0.01TP：血

26、清總蛋白；ALB：白蛋白；Ch：膽固醇；TG：甘油三酯。 2.2尿蛋白排泄量的變化 正常對(duì)照大鼠實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)每天尿液中排出少量蛋白，一年后尿蛋白水平有輕度增加(8.94.9vs1.90.8mg/24h,P0.05)。糖尿病模型建成4周時(shí)大鼠尿蛋白排泄量即明顯增加(11.44.7vs1.90.8mg/24h，P0.05)，其后尿蛋白排泄量逐漸增多，12月時(shí)尿蛋白排泄量達(dá)65.236.4mg/24h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對(duì)照大鼠。大黃酸治療組大鼠一個(gè)月時(shí)，尿蛋白水平與糖尿病對(duì)照大 鼠無(wú)明顯差別，3個(gè)月時(shí)尿蛋白排泄量即低于糖尿病對(duì)照大鼠(11.74.1，15.25.6vs20.36.1mg/24h)，其中大黃

27、酸100 mg組療效明顯。12月后大黃酸治療組大鼠尿蛋白水平有所增加，但仍低于糖尿病對(duì)照大鼠(30.714.0，48.823.3vs 65.236.4 mg/24h,P 0.05)(2)。2糖尿病模型建成12月內(nèi)各組大鼠24小時(shí)尿蛋白排泄量的變化2.3腎肌酐清除率（Ccr）的變化 12月時(shí)糖尿病對(duì)照大鼠Ccr明顯高于正常對(duì)照(1.840.43 vs 0.790.13ml/mim.100g，P0.05)，大黃酸100mg治療組Ccr明顯低于糖尿病對(duì)照(大黃酸25mg治療組對(duì)Ccr無(wú)明顯影響)(3)。3糖尿病模型建成12月時(shí)各組大鼠的肌酐清除率2.4腎組織病理學(xué)改變及定量分析糖尿病模型建成12月時(shí)

28、大鼠右腎重量及右腎/體重比均明顯高于正常對(duì)照大鼠，其右腎的代償肥大率為48.513.2%，大黃酸100mg及25mg兩種劑量治療后大鼠右腎肥大均減輕，右腎代償肥大率分別為28.08.4%及38.911.6%，大黃酸高劑量組療效顯著。12月后，正常對(duì)照大鼠腎小球及小管間質(zhì)未見(jiàn)明顯的病理改變。糖尿病大鼠腎組織光鏡檢查可見(jiàn)腎小球面積明顯增大，系膜區(qū)增寬，但未見(jiàn)明顯的腎小球硬化及小管萎縮與間質(zhì)纖維化(4)。病理定量分析結(jié)果表明，糖尿病大鼠腎小球，絲球體及系膜區(qū)面積均較正常對(duì)照大鼠明顯增加，大黃酸治療后仍大于正常對(duì)照大鼠，但明顯低于糖尿病未治療組大鼠，其中高劑量大黃酸治療組病變改善最為顯著(表3)。4大

29、黃酸治療12月后各組大鼠腎組織病理改變(PAS， 400)正常對(duì)照組大鼠(A)，糖尿病對(duì)照組大鼠(B)，大黃酸10 0mg治療組大鼠(C)。表3各組大鼠腎小球病理定量分析 腎小球面積(m2)絲 球體面積(m2)系膜區(qū)面積(m2)系膜區(qū)/絲球體(%)大黃酸10011128958.6*7309631.51357241.418.43.1大黃酸2511175674.3*7644671.61742545.622.76.6糖尿病對(duì)照127531536.89002639.23315719.431.97.8正常對(duì)照9642396.55460318.78666 與糖尿病對(duì)照組相比*P0.05

30、，P001；與正常對(duì)照組相比 P0.01 2.5腎小球TGF-1及GLUT1 mRNA的表達(dá)糖尿病模型建立12月后，大鼠腎皮質(zhì)腎小球中TGF-1及GLUT1 mRNA表達(dá)較正常對(duì)照大鼠明顯升高(TGF-1：19.29.5%vs9.54.3%，P0.05；GLUT1：48.918.0% vs 22.42.6%，P0.05)，大黃酸100 mg組TGF-1及GLUT1 mRNA表達(dá)量明顯降低(TGF-1：9.16.8%vs19.29.5%，P0.05；GLUT1：28.56.2%vs48.918.0%， P0.05)。3討論本研究采用STZ小劑量多次腹腔內(nèi)注射法建立糖尿病大鼠動(dòng)物模型，大鼠表現(xiàn)為血

31、糖及糖化血紅蛋白水平明顯升高，出現(xiàn)多飲多尿，體重不增或增加較少。模型建立一個(gè)月時(shí)大鼠即出現(xiàn)尿蛋白排泄量增加，其后尿蛋白水平逐漸上升。實(shí)驗(yàn)期間糖尿病大鼠血清肌酐，尿素氮水平有輕度升高，甘油三酯及血總膽固醇水平明顯升高。一年后糖尿病大鼠腎臟重量及肌酐清除率較正常對(duì)照大鼠明顯增加。腎組織病理檢查提示腎小球面積，絲球體面積及系膜區(qū)面積明顯高于正常對(duì)照大鼠。12月后，糖尿病大鼠腎小球TGF-及GLUT1mRNA水平明顯高于正常大鼠。本研究建立的糖尿病大鼠模型腎臟病變與臨床IDDM及文獻(xiàn)報(bào)道大鼠糖尿病腎病的表現(xiàn)較為吻合8，9，可以作為觀察治療糖尿病腎病藥物療效的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。以往的研究表明，大黃可以減輕單

32、側(cè)腎切除大鼠對(duì)側(cè)腎臟的代償性肥大，降低腎組織氧耗，并可延緩慢性腎功能不全的進(jìn)展10。糖尿病腎病早期的病理生理改變與單側(cè)腎切除大鼠相似，也可以表現(xiàn)為腎臟肥大，腎組織氧耗量增加，以及腎小球高濾過(guò)等病理生理改變11。因此解放軍腎臟病研究所近年來(lái)對(duì)大黃在治療糖尿病腎病中的作用進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)研究和觀察。研究發(fā)現(xiàn)，大黃醇提取物可以抑制實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型早期的腎臟肥大及腎小球內(nèi)多肽生長(zhǎng)因子的表達(dá)，減輕糖尿病大鼠的尿蛋白排泄1214。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，大黃素可以減少系膜細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)的表達(dá)與產(chǎn)生15。臨床觀察也表明中藥大黃可以減輕糖尿病患者的尿白蛋白排出量，降低空腹血糖，延緩患者腎功能的減退16。以往的研究

33、結(jié)果初步認(rèn)定大黃蒽醌衍生物是大黃治療糖尿病腎病的主要有效成份。大黃酸是從大黃蒽醌衍生物中分離出的一種主要的單體組份。大黃酸可以抑制TGF-1介導(dǎo)的小鼠腎小球系膜細(xì)胞GLUT1表達(dá)及細(xì)胞糖攝入的增加，抑制高糖刺激系膜細(xì)胞的肥大及細(xì)胞外基質(zhì)合成的增加2。大黃酸在抑制單側(cè)腎切除及STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠初期的腎臟肥大中也有明確的療效，其作用效果強(qiáng)于大黃素3。本文研究結(jié)果證實(shí)，大黃酸治療一年期間，治療組大鼠尿蛋白排泄量明顯降低，大鼠的腎功能有所改善；大黃酸治療一年后，大鼠腎臟肥大減輕，腎小球，絲球體及系膜區(qū)面積明顯縮小。此外本研究還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)劑量的大黃酸對(duì)大鼠血糖及糖化血紅蛋白水平，血清甘油三酯及總膽固醇水

34、平均有一定程度的影響。大黃酸治療期間，大鼠進(jìn)食量與糖尿病未治療組相比無(wú)明顯差別，也未出現(xiàn)體重減輕及腹瀉等現(xiàn)象，表明本研究中所選大黃酸的劑量可以改善糖尿病大鼠的腎臟病變，同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠也是較為安全的。造成糖尿病腎病發(fā)生與發(fā)展的因素較為復(fù)雜。主要分為遺傳因素以及非遺傳因素。目前均從糾正非遺傳性因素著手來(lái)開(kāi)展針對(duì)糖尿病腎病的治療。非遺傳因素主要包括三個(gè)方面，即代謝，血流動(dòng)力學(xué)以及相關(guān)的生長(zhǎng)因子的變化17。下面就這三個(gè)方面，對(duì)大黃酸治療糖尿病腎病的可能機(jī)制進(jìn)行討論。3.1對(duì)代謝的影響糖尿病狀態(tài)下，飲食蛋白質(zhì)攝入量的多少與糖尿病腎臟病變的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)18，19，降低飲食中蛋白質(zhì)的攝入量可以延緩糖尿

35、病腎病的進(jìn)展20。本研究中糖尿病大鼠每天進(jìn)食量明顯高于正常對(duì)照，大黃酸治療后，大鼠每天的進(jìn)食量并未減少，因此排除了進(jìn)食蛋白質(zhì)量的多少對(duì)腎臟病變可能產(chǎn)生的影響。糖尿病時(shí)血糖水平的高低是糖尿病腎病產(chǎn)生的最重要原因。高血糖可以使細(xì)胞糖攝入增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多元醇通路及PKC的激活，增加糖基化終末產(chǎn)物的生成21。以往一些研究結(jié)果表明，大黃對(duì)糖尿病大鼠以及早期糖尿病患者的血糖水平有降低作用12，22。本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠模型建成后，使用大黃酸治療3個(gè)月時(shí)血糖水平即較未治療組有所降低，6個(gè)月時(shí)高劑量大黃酸治療組的血糖降低幅度達(dá)最大。因此對(duì)血糖的影響很可能是大黃酸產(chǎn)生療效的很重要的一個(gè)方面。近年來(lái)，對(duì)于細(xì)胞

36、攝糖機(jī)制的研究結(jié)果表明，細(xì)胞攝糖能力除了取決于微環(huán)境中的糖濃度外，細(xì)胞表面葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的多少及功能的強(qiáng)弱也是影響細(xì)胞糖攝入的重要因素。這也就解釋了為什么有些血糖控制良好的患者最后仍然會(huì)發(fā)生糖尿病腎病23，24。在體外實(shí)驗(yàn)中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大黃酸可以抑制TGF-1誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞GLUT1mRNA的表達(dá)以及細(xì)胞糖攝入量的增加2。本研究中，大黃酸治療一年后大鼠腎小球中GLUT1的mRNA水平較糖尿病對(duì)照明顯降低。因此在體內(nèi)，大黃酸很可能通過(guò)對(duì)血糖以及細(xì)胞表面糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的影響來(lái)減少腎固有細(xì)胞的糖攝入量，進(jìn)而阻止或降低后續(xù)途徑的激活，并最終延緩糖尿病腎病的進(jìn)展。大黃酸降低血糖水平的確切機(jī)制目前并不清

37、楚，有文獻(xiàn)報(bào)道，抑制骨骼肌細(xì)胞表面GLUT1的功能可以使機(jī)體對(duì)胰島素的敏感性增加，大黃酸是否通過(guò)此途徑來(lái)達(dá)到其降血糖的作用，抑或還存在其他的降血糖的機(jī)制尚待研究。此外，脂代謝紊亂對(duì)糖尿病腎病的發(fā)展也起到了一定的促進(jìn)作用25，糖尿病大鼠經(jīng)大黃酸治療后血脂代謝紊亂得到了一定程度的糾正，并且以往在應(yīng)用大黃治療慢性腎功能不全患者中，也發(fā)現(xiàn)大黃可以改善患者的脂代謝紊亂26。因此大黃酸降低糖尿病時(shí)血脂水平對(duì)延緩糖尿病腎病的進(jìn)展也有一定的積極作用。3.2對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響可能造成糖尿病腎臟損害的血流動(dòng)力學(xué)因素主要有體循環(huán)血壓，腎小球灌注壓以及一些血管活性細(xì)胞因子(如Ang-II，ET-1等)的產(chǎn)生等17。大

38、黃酸對(duì)糖尿病狀態(tài)下機(jī)體及腎組織微環(huán)境的血流動(dòng)力學(xué)是否有影響，目前尚無(wú)直接的證據(jù)，本研究中大黃酸對(duì)大鼠平均動(dòng)脈壓并無(wú)影響，大黃酸治療組大鼠一年時(shí)腎臟肌酐清除率明顯降低，但要明確大黃酸在腎血流動(dòng)力學(xué)中的作用，尚需要進(jìn)一步的研究。3.3對(duì)相關(guān)生長(zhǎng)因子的影響生長(zhǎng)因子在糖尿病腎病發(fā)病中的作用已得到充分的證實(shí)。IGF-1，PDGF，TGF1及HGF的mRNA和蛋白質(zhì)水平在糖尿病動(dòng)物模型中均有變化，其中TGF1的表達(dá)與功能在糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展中具重要作用。TGF1可以促使腎臟細(xì)胞肥大，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積，并最終造成腎小球硬化及間質(zhì)纖維化27。本研究中大黃酸治療組大鼠12月時(shí)腎小球中TGF1mRNA

39、表達(dá)量明顯降低。但大黃酸對(duì)體內(nèi)TGF1mRNA表達(dá)的影響是直接作用的結(jié)果還是因糾正機(jī)體及細(xì)胞代謝紊亂而產(chǎn)生的間接效果尚不明確。綜合本文以及以往的研究結(jié)果，我們認(rèn)為糾正糖尿病狀態(tài)下機(jī)體以及細(xì)胞代謝的紊亂可能是大黃酸延緩糖尿病腎病進(jìn)展的主要機(jī)制。大黃以及其單體大黃酸因其較為特殊的作用方式很可能為糖尿病腎病的治療開(kāi)辟一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。這里必須強(qiáng)調(diào)的是，由于糖尿病腎病致病機(jī)制非常復(fù)雜，單用大黃酸也僅僅對(duì)糖尿病腎病的發(fā)展有一定程度的延緩作用，并不能完全阻斷糖尿病腎病的發(fā)展。近來(lái)有研究表明，聯(lián)合應(yīng)用鈣離子通道阻斷劑及ACEI可以使糖尿病腎病的治療效果大大提高28。結(jié)合大黃酸與其他藥物不同的作用方式，大黃酸與

40、ACEI兩藥聯(lián)用或與ACEI及鈣離子通道阻斷劑三藥聯(lián)用可能會(huì)對(duì)延緩糖尿病腎病的進(jìn)展產(chǎn)生更加顯著的療效。作者簡(jiǎn)介：戴春筍南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院博士研究生作者單位：南京軍區(qū)南京總醫(yī)院解放軍腎臟病研究所（南 京，210002）參考文獻(xiàn)1 陳瓊?cè)A.大黃的實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用.新醫(yī)藥學(xué)雜志，1974，8：2262章精，劉志紅，李穎健等大黃酸對(duì)系膜細(xì)胞糖攝入的影響及其機(jī)制腎臟病與透析腎移植雜志，1999，8(4)：3073戴春筍，劉志紅，楊俊偉等大黃蒽醌衍生物及其單體大黃酸，大黃素抑制STZ誘導(dǎo)糖尿病大鼠初期腎臟肥大的療效觀察(待發(fā)表)4Chomczynski P,Sacchi N.Single-step meth

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