小鼠卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注入單精子受精的實(shí)驗(yàn)研究

1、    小鼠卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注入單精子受精的 實(shí)驗(yàn)研究        摘要為了探討提高小鼠卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注入受精率的方法，選取鼠齡1214周的健康昆明白小鼠作為精子和卵子的供體，采用ICSI技術(shù)，以受精后二細(xì)胞卵裂的形成率為指標(biāo)，了解不同采卵時(shí)間、不同微注射針參數(shù)及不同培養(yǎng)液對細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注入的影響。結(jié)果表明，hCG注射后1819h采卵，用針尖內(nèi)徑為45 m、斜面角度為3540度的微注射針進(jìn)行ICSI操作，受精后卵子置CZB中培養(yǎng)可獲得較多的2細(xì)胞胚，卵裂率明顯高

2、于其余各組(28.10%)，有高度顯著性差異(P0.01)。結(jié)果提示：恰當(dāng)?shù)牟陕褧r(shí)間、微注射針參數(shù)及培養(yǎng)液對ICSI結(jié)果有很大影響。關(guān)鍵詞卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射顯微注射針采卵時(shí)相培養(yǎng)液昆明白小鼠 動(dòng)物的顯微注精始于1962年，到80年代后期取得重大進(jìn)展。顯微注精技術(shù)可分為透明帶下單精子或多精子注射1、透明帶部分切除2、透明帶打扎3、胞質(zhì)內(nèi)精子注射4等。其中卵胞質(zhì)內(nèi)精子注射，精子不需在體外獲能，且對精子形態(tài)的選擇無嚴(yán)格要求5，因此對生殖醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究均有較高的價(jià)值。我們從1994年開始，在湖北省畜牧研究所生物工程室協(xié)助下，對昆明白小鼠卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注入受精時(shí)取卵時(shí)相、微注射針參數(shù)及不同的體外

3、培養(yǎng)系統(tǒng)等影響因素進(jìn)行研究，獲得部分結(jié)果，報(bào)道如下。材料和方法1. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選出生后1214周健康昆明白小鼠，雄性體重3040g，雌性體重2025g。均取自湖北省醫(yī)科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。2. 精子采集和處理將上述小鼠處死，分離附睪，置M2培養(yǎng)液6中，輕壓附睪尾部，精子自然流出。將精子離心洗滌2次，保留0.4ml M2液，置5%CO2培養(yǎng)箱(37)，60min，待用。3. 超排及采卵將上述所選取的雌性小鼠，腹腔注射孕馬血清(PMSG)5IU， 48h后腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(hCG)5IU,第2次注射后1319h處死雌鼠，分離卵巢和輸卵管，用5號針頭劃破輸卵管膨大部，輕輕擠壓，使卵塊排出，置0.

4、1%透明質(zhì)酸酶中5min，使卵細(xì)胞裸化，導(dǎo)入不同培養(yǎng)液中，放入5%CO2培養(yǎng)箱(37)15 min，待用。4. 培養(yǎng)液的配制M166、WM7及CZB83種培養(yǎng)液(均購自華美生化試劑公司)均用五蒸水配制(表1)。5. 操作用針、管的制備5.1固定管制備：取直徑1 mm，長120 mm毛細(xì)玻璃管在酒精燈上加熱，拉制成外徑約0.120.14 mm的細(xì)管，將細(xì)管的端口在修針儀上加溫，修制成內(nèi)徑2030 m、邊緣整齊光滑的固定管。5.2微注射針的制備：取直徑1 mm，長120 mm毛細(xì)玻璃管，在拉針儀上拉制成尖長約0.5 cm的細(xì)針，在磨針儀上加工成內(nèi)徑分別為67 m、45 m及4m、針口斜面為3560

5、度的微注射針。上述制備的針、管均經(jīng)清洗、消毒待用。表1培養(yǎng)液的主要成分Table 1 Main components of media培養(yǎng)液成分(10g/L)(component of mdeia)M16培養(yǎng)液WM培養(yǎng)液CZB培養(yǎng)液氯化鈉NaCl0.5530.5140.477氯化鉀KCl0.0350.0360.036磷酸二氫鉀KH2PO40.0160.0160.016硫酸鎂MgSO4.7H2O0.0290.0290.029碳酸氫鈉NaHCO30.2100.1900.211氯化鈣CaCl2.2H2O0.0250.025葡萄糖D-Glucose0.1000.100乳酸鈉Sodium lactate

6、0.35ml?0.37ml0.45ml乳酸鈣Calcium lactate0.053丙酮酸鈉Sodium pyruvate0.0030.0030.003乙二胺四乙酸鈉EDTA-Na20.004谷氨酰胺Glutamine0.014牛血清白蛋白BSA(mg/ml)435     ?60%的乳酸鈉糖汁(sodium lactate of 60% syrup) 6. 實(shí)驗(yàn)設(shè)組根據(jù)觀察內(nèi)容的不同分為以下幾個(gè)部分6.1采卵時(shí)間：按設(shè)計(jì)要求，分為13 h、15 h、19h 3種不同采卵時(shí)間組。微注射針斜面角度為3540度，內(nèi)徑為45 m。顯微注射后置M16液中培養(yǎng)。6

7、.2微注射針不同參數(shù)觀察：按設(shè)計(jì)要求，分為2組，均于hCG注射后19h取卵。第1組針口斜面角度為4560度，內(nèi)徑分別為67m、45m及4 m。第2組針口斜面為3540度，各內(nèi)徑同上。顯微注射后置M16液中培養(yǎng)。6.3不同體外培養(yǎng)系統(tǒng)的觀察：按設(shè)計(jì)要求，分為M16組、WM組、CZB組。均于hCG注射后19h取卵，微注射針斜面角度為3540度，內(nèi)徑為45 m。以上各部分均設(shè)實(shí)驗(yàn)對照組和空白對照組。前者除微注射針未吸入精子外，操作同前，旨在排除機(jī)械刺激誘發(fā)卵細(xì)胞激活的假陽性。后者在取出卵細(xì)胞后，置入上述各培養(yǎng)液中，不作任何處理，以排除卵細(xì)胞自發(fā)激活分裂因素的干擾。7. 顯微注射受精在凹形載玻片中央滴

8、約5l的M2微滴，內(nèi)置卵細(xì)胞58枚，旁邊置經(jīng)10%PVP稀釋的精子懸液，上覆石蠟油，用固定針固定卵細(xì)胞，如見第一極體，則應(yīng)使之位于12點(diǎn)或6點(diǎn)處，微注射針將精子從尾部吸入，使精子頭部位于管口，從3點(diǎn)處進(jìn)針，避開核區(qū)，盡量少帶入培養(yǎng)液(1)。注射卵放入M16液中，上覆石蠟油，置5%CO2培養(yǎng)箱37，培養(yǎng)8h，觀察結(jié)果。8. 卵細(xì)胞受精的判斷以卵細(xì)胞出現(xiàn)卵裂為標(biāo)準(zhǔn)(2)。本實(shí)驗(yàn)全部數(shù)據(jù)用2檢驗(yàn)(chi-square text)，直接計(jì)算概率法等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。    1將精子注入小鼠卵細(xì)胞×4002顯微注精卵細(xì)胞發(fā)育到2-4細(xì)胞×400F

9、ig.1The oocyte was microinjected into a sperm.×400Fig.2The oocyte microinjected cleaved to 2-4 cell in vitro×400結(jié)果不同采卵時(shí)間的觀察顯示，hCG注射后19h采卵出現(xiàn)的卵裂為二細(xì)胞的形成率，均明顯高于其他4組，呈顯著差異(P0.01)。其他4組間卵裂為二細(xì)胞的形成率均極低，差異不顯著，P0.05。不同微注射針參數(shù)觀察顯示，針尖斜面為3540度、內(nèi)徑為45m時(shí)，卵裂率明顯高于其余各組，差異高度顯著(P0.01)。而空白對照組形態(tài)正常率明顯高于其余各組，這提示微注射針

10、對卵細(xì)胞的機(jī)械損傷，是影響受精率的重要因素，不同體外培養(yǎng)系統(tǒng)的觀察顯示，CZB組卵裂率明顯高于其余各組，差異高度顯著(P0.01)。以上結(jié)果提示，hCG注射后19h取卵，用針尖斜面為3540度、針尖內(nèi)徑為45m微注射針操作卵細(xì)胞，用CZB液進(jìn)行體外培養(yǎng)，可獲較多形態(tài)正常的操作后卵細(xì)胞及較高受精率(表25)。表2不同采卵時(shí)間對小鼠卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注入受精的影響Table 2 Effect of different time of collecting mouse eggs on ICSI組別group卵數(shù)amount of eggs二細(xì)胞形成率2-cell formed(%)13h1151.731

11、5h1403.5719h71018.03實(shí)驗(yàn)對照 exper-iment control1801.66空白對照control2000     表3斜面為4560度時(shí)，不同針尖內(nèi)徑的顯微注入受精結(jié)果Table 3 Effect of different internal diameterof injection pipette with incline plane angleof 45-60 on ICSI組別group卵數(shù)amount of eggs形態(tài)正常率(%)normal shape二細(xì)胞形成率(%)2-cell formed67 m6217.74

12、045 m7851.283.854 m7321.912.74實(shí)驗(yàn)對照 exper-iment control6546.150空白對照control7996.200     表4斜面為3540度時(shí)，不同針尖內(nèi)徑的顯微注入受精結(jié)果Table 4Effect of different internal diameterof injection pipette with incline plane angleof 35-40 on ICSI組別group卵數(shù)amount of eggs形態(tài)正常率(%)normal shape二細(xì)胞形成率(%)2-cell for

13、med67 m6722.39045 m7672.3713.164 m6134.433.28實(shí)驗(yàn)對照 exper-iment control6061.670空白對照control6495.530     表5不同培養(yǎng)液對顯微注入受精的影響Table 5 Effect of differentmedium on ICSI組別group卵數(shù)amount of eggs二細(xì)胞形成率2-cell formed(%)M1671018.03WM3667.92CZB71028.10實(shí)驗(yàn)對照 exper-iment control5021.19空白對照control553

14、0.54     討論在哺乳動(dòng)物的卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注入(intracytoplasmic sperm injection)受精中，小鼠卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注精是較困難的。小鼠卵細(xì)胞較小，抗損傷能力弱，自我修復(fù)能力差，輕微的機(jī)械損傷就會造成不可逆的損害，使之很快溶解，而且對外界環(huán)境的變化也較敏感。因此，小鼠卵胞質(zhì)內(nèi)顯微注精的受精率往往較低3，9，近年來，一些非常規(guī)操作設(shè)備(如具有近距離高速穿刺功能的顯微操作系統(tǒng))的應(yīng)用提高了小鼠卵胞質(zhì)內(nèi)顯微注精的受精率9，但對這一技術(shù)各個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)的改進(jìn)仍是十分重要的。本實(shí)驗(yàn)使用常規(guī)顯微操作設(shè)備，對顯微受精過程中的一些環(huán)節(jié)進(jìn)行觀察

15、、比較、篩選，得到了較好的結(jié)果。1. 采卵時(shí)間的選擇目前的研究大多表明，小鼠卵細(xì)胞顯微注精的采卵時(shí)間和經(jīng)典的體外受精一樣，在hCG注射后1415h進(jìn)行10。但顯微注精的過程畢竟與經(jīng)典體外受精不同，它不經(jīng)過精子獲能，卵膜融合等過程，因而顯微注精的集卵時(shí)間是否須和經(jīng)典體外受精一致，還須進(jìn)一步研究。我們在hCG注射后19h采卵，進(jìn)行胞質(zhì)內(nèi)單精注射，獲得比其他時(shí)相大的受精率，是否因?yàn)檫@一時(shí)期的卵細(xì)胞更易被激活而促進(jìn)注入精子解聚形成原核，還有待研究。2. 不同參數(shù)的微注射針選擇選擇恰當(dāng)?shù)奈⒆⑸溽樇獾膬?nèi)徑及斜面的角度，對將顯微注射時(shí)卵細(xì)胞的損傷降低到最低限度非常重要。關(guān)于微注射針尖斜面的角度，報(bào)道不等9，

16、10，根據(jù)操作設(shè)備的不同，有所變化，但多在3560度之間。由于小鼠卵細(xì)胞透明帶及卵膜有一定的韌性，根據(jù)我們的觀察，斜面大于40度，進(jìn)針時(shí)會遇到較大的抵抗，難以一次穿透透明帶及卵膜，破壞了細(xì)胞質(zhì)的穩(wěn)定狀態(tài)，使受精后的卵細(xì)胞不能正常發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)表明，針尖斜面角度在3540度之間較為恰當(dāng)，可在顯微操作后獲得較多形態(tài)正常的卵細(xì)胞及較高的受精率。關(guān)于微注射針尖的內(nèi)徑，報(bào)道多在47m之間9，10。根據(jù)我們的觀察，內(nèi)徑大于6m，會造成卵細(xì)胞較大的損傷，使卵胞質(zhì)較多外流，并使隨精子進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的操作液過多，導(dǎo)致卵細(xì)胞溶解。內(nèi)徑小于4m時(shí)，整個(gè)精子頭部完全卡在注射針口外，進(jìn)針時(shí)易使精子頭和尾部分離，不能進(jìn)入卵細(xì)胞

17、質(zhì)內(nèi)，給操作帶來一定困難。本實(shí)驗(yàn)表明，針尖內(nèi)徑在45 m之間、斜面在3540度較為合適，此時(shí)，整個(gè)精子頭部正位于管口，進(jìn)針容易，且?guī)氩僮饕狠^少，對卵細(xì)胞機(jī)械損傷小，可獲得較高的受精率。3.不同體外培養(yǎng)液的選擇M16、WM及CZB培養(yǎng)液為小鼠體外受精常用培養(yǎng)液，3者組成成分的最大差別在于：WM含乳酸鈣，CZB液含谷氨酰胺及EDTA，其余成分類似。本實(shí)驗(yàn)CBZ組卵裂率明顯高于其他各組，WM組卵裂最低，提示培養(yǎng)液組成成分的不同對小鼠卵胞質(zhì)內(nèi)顯微注精的結(jié)果有很大影響。CZB液提高小鼠卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注精卵裂率的機(jī)理可能是以下幾個(gè)方面：(1) 谷氨酰胺的作用：研究提示，體外受精的早期小鼠胚胎，不能有效利

18、用葡萄糖提供能量，而谷氨酰胺可補(bǔ)充其能量的供給8，11。12細(xì)胞小鼠胚胎中，谷氨酰胺的聚集超過其他氨基酸。此外，谷氨酰胺在核苷酸的合成方面也起著重要作用。這些對小鼠胚胎的早期發(fā)育都是有利的。(2) EDTA的作用：報(bào)告表明12，具有細(xì)胞毒性的重金屬離子，對早期胚胎是極為不利的，可導(dǎo)致胚胎發(fā)育完全停止。而EDTA可與重金屬離子形成螯合物，起到清除及中和重金屬離子的作用，有利于胚胎的體外發(fā)育。(3) 培養(yǎng)液中其他成分在量方面的平衡，也會對胚胎的發(fā)育產(chǎn)生影響13。CZB液中NaCl濃度明顯低于其他兩種培養(yǎng)液，而WM中含乳酸鈣，其顯微注精后培養(yǎng)結(jié)果明顯低于其他兩組，可能和培養(yǎng)液中各成分間量的不同組合有

19、關(guān)。最后，大部分品系的小鼠體外受精胚胎發(fā)育阻滯發(fā)生在較早時(shí)期，即受精卵發(fā)育停止在2細(xì)胞期。而小鼠卵細(xì)胞質(zhì)內(nèi)顯微注精的卵裂率一般較低(15%左右)這一事實(shí)是否提示，胞質(zhì)內(nèi)顯微注精更多地干擾了卵細(xì)胞的正常受精過程，從而可能使胚胎發(fā)育的阻滯期提前到2細(xì)胞前。而CZB液是否由于上述原因，可能突破胚胎發(fā)育2細(xì)胞期前的阻滯，使卵裂率提高，還有待進(jìn)一步研究。本研究得到湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物生物工程實(shí)驗(yàn)室魏慶信研究員、樊俊華副研究員、鄭新民副研究員、趙浩斌博士協(xié)助，特此感謝。參考文獻(xiàn)1Wolf JP Ducot B, Aymar C, et al. Absence of block to polysperm a

20、t the human oolemma. Fertil Steril, 1997,67(6):10952Cohen J, Alikani M, Malter HE, et al. Partial zona dissection or subzonal sperm insertion: micro-surgical fertilization alternatives based on evaluation of sperm and embryo morphology. Fertil Steril, 1991, 56(2):6963Gordon JW. Use of micromanipulat

21、ion for increasing the efficiency of mammalian fertilization in vitro. Ann N Y Acad Sci, 1988, 541:6014Barro A, Sousa M, Oliveira C, et al. Pregnancy and birth after intracytoplasmic sperm injection with totally immotile sperm recovered from the ejeculate. Fertil Steril, 1997, 67(6):10915Burruel VR,

22、 yanagimach R, Whitten WK. Normal mice develope from oocytes injected with spermatozoa with grossly misshapen heads. Biol Reprod, 1996, 55(3):7096Hogan BF. Manipulating the Mouse Embryo. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1986:2507日本哺乳動(dòng)物胚胎學(xué)新技術(shù)學(xué)會.哺乳動(dòng)物的發(fā)育工程.謝厚祥譯.長沙：湖南科技技術(shù)出版社，1986：10158Chatot CL,

23、 Ziomek CA, Bavister BD, et al. An improved culture medium supports development of random-bred 1-cell mouse embryos in vitro. J Reprop Fert, 1989, 86(2):6799Yasuyuki K, Yanagimachi R. Intracytoplasmic sperm injection in mouse. Bio Reprod, 1995, 52(4):70910Iritani A, Utsumi K, Miyake M, et al. In vit

24、ro fertilization by a routine method and by micromanipulation. Ann N Y Acad Sci, 1988, 541:58311Chatot CL, Lewis JL, Torres I, et al. Development of 1-cell embryos from different strains of mice in CZB medium. Biol Reprod, 1990, 42(3):43212Mehta TS, Kiessling AA. The development potential of mouse e

25、mbryos conceived in Ham's F-10 medium containing ethylenediaminetetraacetic acid. Fertil Steril, 1993,60(6):108813Lawitts JA, Biggers JD. Overcoming the 2-cell block by modifying standard components in a mouse embryo culture medium. Biol Reprod, 1991, 45(2):245EXPERIMENTAL STUDY ON INTRACYTOPLAS

26、MIC SPERMINJECTION IN THE MOUSE EGGYang Yishou, Xiong Shufang, Long Wen, Li Ming,Xia Mingzhu Wang Changje(First Affiliated Hospital, Hubei Medical University, Wuhan)To study methods raising average percentage of fertilization by intracytoplasmic sperm injection (ICSI) in muose eggs. Methods: Kunming white mice (12-14 weeks of age) were use as donors of sperms or eggs. The presentation of 2-