核酸分子雜交七年制學(xué)習(xí)教案

1、會(huì)計(jì)學(xué)1核酸核酸(h sun)分子雜交七年制分子雜交七年制第一頁(yè)，共50頁(yè)。第1頁(yè)/共49頁(yè)第二頁(yè)，共50頁(yè)。應(yīng)用：克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測(cè)和應(yīng)用：克隆基因的篩選、酶切圖譜的制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測(cè)和疾病的診斷疾病的診斷(zhndun)等方面。目前核酸分子雜交不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)等方面。目前核酸分子雜交不僅在分子生物學(xué)領(lǐng)域中具有廣泛地應(yīng)用用, 而且在臨床基因診斷而且在臨床基因診斷(zhndun)上的應(yīng)用也日趨增多。上的應(yīng)用也日趨增多。 檢測(cè)檢測(cè)(jin c)對(duì)象對(duì)象: 克隆化的基因組克隆化的基因組DNA,、細(xì)胞總、細(xì)胞

2、總DNA、總、總RNA。雜交方法不。雜交方法不同，被檢測(cè)同，被檢測(cè)(jin c)的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交的核酸可以是提純的，也可以在細(xì)胞內(nèi)雜交, 即細(xì)胞原位雜即細(xì)胞原位雜交。交。核酸分子核酸分子(fnz)雜交特點(diǎn)：高度的靈敏性雜交特點(diǎn)：高度的靈敏性(pg) 、高度的特異性、高度的特異性第2頁(yè)/共49頁(yè)第三頁(yè)，共50頁(yè)。第3頁(yè)/共49頁(yè)第四頁(yè)，共50頁(yè)。 基本原理：基本原理：DNADNA變性、復(fù)性與分子變性、復(fù)性與分子(fnz)(fnz)雜交雜交第4頁(yè)/共49頁(yè)第五頁(yè)，共50頁(yè)。第5頁(yè)/共49頁(yè)第六頁(yè)，共50頁(yè)。融解溫度：融解溫度：50雜化核酸雜化核酸分子解鏈溫度稱為寡核苷分子解鏈

3、溫度稱為寡核苷酸探針的酸探針的Tm值。值。寡核苷酸探針的長(zhǎng)度、堿寡核苷酸探針的長(zhǎng)度、堿基的含量和核酸的序列基的含量和核酸的序列(xli)決定了探針的決定了探針的Tm值值。實(shí)際操作中，常選擇低于實(shí)際操作中，常選擇低于Tm值值5-10進(jìn)行雜交。進(jìn)行雜交。 Tm=4 X（G + C）+ 2 X（A + T）第6頁(yè)/共49頁(yè)第七頁(yè)，共50頁(yè)。 例如，一個(gè)長(zhǎng)度為例如，一個(gè)長(zhǎng)度為500bp的探針，（的探針，（G+C）含量為）含量為50%，雜交，雜交(zjio)體體系中含系中含5 X SSC（0.75mol/L Na+）和）和50%甲酰胺，則其甲酰胺，則其Tm值為：值為： Tm=81.5 + (-2.07)

4、 + 20.5 1 30.5=68.4 50%甲酰胺溶液甲酰胺溶液, 溫度一般選擇低于溫度一般選擇低于 Tm值值20-25雜交雜交(zjio)溫度應(yīng)溫度應(yīng):68.4 - 25 =43.2 甲酰胺是一種變性劑，能干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，降低核甲酰胺是一種變性劑，能干擾堿基堆積力和氫鍵的形成，降低核酸雜交的酸雜交的Tm值，值，50%的甲酰胺可以使的甲酰胺可以使Tm降低降低30第7頁(yè)/共49頁(yè)第八頁(yè)，共50頁(yè)。53535353影響核酸分子雜交的因素影響核酸分子雜交的因素探針的濃度、長(zhǎng)度、復(fù)雜性探針的濃度、長(zhǎng)度、復(fù)雜性離子離子(lz)強(qiáng)度強(qiáng)度溫度與變性劑（甲酰胺）溫度與變性劑（甲酰胺）雜交條件的嚴(yán)

5、謹(jǐn)性雜交條件的嚴(yán)謹(jǐn)性 第8頁(yè)/共49頁(yè)第九頁(yè)，共50頁(yè)。常用的封閉物：常用的封閉物：（1）變性的非特異性）變性的非特異性DNA:如鮭魚精如鮭魚精DNA、小牛胸腺、小牛胸腺DNA，又稱為覆蓋，又稱為覆蓋(fgi)DNA。（2）高分子化合物：）高分子化合物：Denhardt溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖溶液，包括聚乙烯吡咯酮、小牛血清白蛋白、聚蔗糖400 、脫脂奶、脫脂奶粉粉第9頁(yè)/共49頁(yè)第十頁(yè)，共50頁(yè)?；緦?shí)驗(yàn)基本實(shí)驗(yàn)(shyn)步驟：步驟：electrophoresisTransferBlockblocksubstrateprobeMigrationhybridizatio

6、n第10頁(yè)/共49頁(yè)第十一頁(yè)，共50頁(yè)。 核酸探針的類型核酸探針的類型 核酸探針的標(biāo)記核酸探針的標(biāo)記(bioj)方法方法 核酸探針的檢測(cè)核酸探針的檢測(cè) 第11頁(yè)/共49頁(yè)第十二頁(yè)，共50頁(yè)。按化學(xué)按化學(xué)(huxu)本質(zhì)分：本質(zhì)分：DNA探針探針 RNA探針探針 按標(biāo)記按標(biāo)記(bioj)物分：放射性標(biāo)記物分：放射性標(biāo)記(bioj)探針探針核酸核酸(h sun)探探針的類型針的類型 3H、32P、35S、125I等等優(yōu)點(diǎn)：高特異性，高靈敏度優(yōu)點(diǎn)：高特異性，高靈敏度缺點(diǎn)：存在放射性污染，半衰期短缺點(diǎn)：存在放射性污染，半衰期短非放射性標(biāo)記探針?lè)欠派湫詷?biāo)記探針生物素，地高辛、熒光素等生物素，地高辛、熒光

7、素等第12頁(yè)/共49頁(yè)第十三頁(yè)，共50頁(yè)。（2）酶促標(biāo)記法：）酶促標(biāo)記法： 將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸分子上，然后(rnhu)利用酶學(xué)的方法將標(biāo)記物摻入到探針?lè)掷妹笇W(xué)的方法將標(biāo)記物摻入到探針?lè)肿由?。子上?切刻平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記法等切刻平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記法等第13頁(yè)/共49頁(yè)第十四頁(yè)，共50頁(yè)。光敏生物素標(biāo)記法光敏生物素標(biāo)記法:強(qiáng)光強(qiáng)光10-20分鐘，光敏基團(tuán)分鐘，光敏基團(tuán)(j tun)與核酸探針的磷酸基與核酸探針的磷酸基團(tuán)團(tuán)(j tun)以共價(jià)鍵結(jié)合。以共價(jià)鍵結(jié)合。第14頁(yè)/共49頁(yè)第十五頁(yè)，共50頁(yè)。（2）酶促標(biāo)記）酶促標(biāo)記(bioj

8、)法：法： 將標(biāo)記將標(biāo)記(bioj)物預(yù)先標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記(bioj)在核苷酸分子上，然后利用酶學(xué)的在核苷酸分子上，然后利用酶學(xué)的 方法將標(biāo)記方法將標(biāo)記(bioj)物摻入到探針?lè)肿由?。物摻入到探針?lè)肿由稀?缺口平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記缺口平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記(bioj)法等法等32P或或35S同位素標(biāo)記同位素標(biāo)記的單核苷酸的單核苷酸dig-dUTP的結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)(jigu)第15頁(yè)/共49頁(yè)第十六頁(yè)，共50頁(yè)。（1）缺口平移法）缺口平移法由由DNA酶酶和大腸和大腸(dchng)桿菌桿菌DNA聚合酶聚合酶共同完成。共同完成。DNA酶酶：在雙鏈：在雙鏈DNA上隨機(jī)上隨機(jī)(su j)打開(kāi)打開(kāi)

9、若若干個(gè)單鏈缺口，產(chǎn)干個(gè)單鏈缺口，產(chǎn)生生3-OH端端大腸桿菌大腸桿菌(d chn n jn)DNA聚合聚合酶酶：53DNA聚聚合酶活性；合酶活性； 53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（nicktranslation）“邊切除、邊聚合邊切除、邊聚合”第16頁(yè)/共49頁(yè)第十七頁(yè)，共50頁(yè)。最合適的缺口最合適的缺口(quku)平移片段一般為平移片段一般為50-500個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。DNA酶酶的用量和的用量和E.coli DNA聚合酶聚合酶的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。的質(zhì)量會(huì)影響產(chǎn)物片段的大小。DNA模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性模板中的抑制物如瓊脂糖會(huì)抑制酶的活性, 故應(yīng)使用仔細(xì)純化后的故應(yīng)

10、使用仔細(xì)純化后的DNA。第17頁(yè)/共49頁(yè)第十八頁(yè)，共50頁(yè)。隨機(jī)引物（隨機(jī)引物（4-6nt）：含有各）：含有各種可能種可能(knng)排列順序的排列順序的寡核苷酸片段的混合物。寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶聚合酶Klenow片段片段(pin dun)： 53DNA聚合酶活性聚合酶活性 弱弱35外切核酸酶活性外切核酸酶活性 無(wú)無(wú)53外切核酸酶活性外切核酸酶活性（2）隨機(jī)）隨機(jī)(su j)引物法（引物法（random priming）第18頁(yè)/共49頁(yè)第十九頁(yè)，共50頁(yè)。產(chǎn)物平均長(zhǎng)度為產(chǎn)物平均長(zhǎng)度為400-600個(gè)核苷酸。個(gè)核苷酸。Klenow片段沒(méi)有片段沒(méi)有5 3外切酶活性外

11、切酶活性, 反應(yīng)穩(wěn)定反應(yīng)穩(wěn)定, 可以獲得可以獲得(hud)大量的有效探針大量的有效探針。反應(yīng)時(shí)對(duì)模板的要求不嚴(yán)格反應(yīng)時(shí)對(duì)模板的要求不嚴(yán)格, 用微量制備的質(zhì)粒用微量制備的質(zhì)粒DNA模板也可進(jìn)行反應(yīng)。模板也可進(jìn)行反應(yīng)。第19頁(yè)/共49頁(yè)第二十頁(yè)，共50頁(yè)。（3）探針）探針(tn zhn)的末端標(biāo)記：在的末端標(biāo)記：在5或或3端通過(guò)酶促反應(yīng)加上標(biāo)記物端通過(guò)酶促反應(yīng)加上標(biāo)記物第20頁(yè)/共49頁(yè)第二十一頁(yè)，共50頁(yè)。核酸探針核酸探針(tn zhn)檢測(cè)方法檢測(cè)方法同位素標(biāo)記探針同位素標(biāo)記探針(tn zhn)：放射自顯影檢測(cè)雜交：放射自顯影檢測(cè)雜交信號(hào)信號(hào) 放射自顯影是指利用放射線在放射自顯影是指利用放射線

12、在x線片的成影作用來(lái)檢測(cè)雜交信號(hào)。線片的成影作用來(lái)檢測(cè)雜交信號(hào)。 取出雜交膜，在取出雜交膜，在Whatman濾紙上晾干，用保鮮膜包好，在暗室中置于濾紙上晾干，用保鮮膜包好，在暗室中置于X線片上，加增感屏，固定于暗盒內(nèi)，線片上，加增感屏，固定于暗盒內(nèi)，-70曝光適當(dāng)時(shí)間曝光適當(dāng)時(shí)間(shjin)（1-7天天），在暗室中取出），在暗室中取出X線片，顯影、定影，即可在線片，顯影、定影，即可在X線片上讀出雜交帶。線片上讀出雜交帶。第21頁(yè)/共49頁(yè)第二十二頁(yè)，共50頁(yè)。非放射性標(biāo)記探針：偶聯(lián)反應(yīng)非放射性標(biāo)記探針：偶聯(lián)反應(yīng)(fnyng)+顯色顯色反應(yīng)反應(yīng)(fnyng)Dig：半抗原，可通過(guò)抗原抗體反應(yīng)：

13、半抗原，可通過(guò)抗原抗體反應(yīng)(fnyng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)Dig-DNA探針探針 + 抗抗Dig抗體抗體(kngt)-堿性磷酸酶堿性磷酸酶（AP） 或辣根過(guò)氧化物酶（或辣根過(guò)氧化物酶（HRP） +底物底物 ：BCIP+NBT 藍(lán)紫色藍(lán)紫色或或 DAB 紅棕色；紅棕色； TMB 藍(lán)色藍(lán)色第22頁(yè)/共49頁(yè)第二十三頁(yè)，共50頁(yè)。核酸分子核酸分子(fnz)雜交的雜交的分類分類第三節(jié)第三節(jié) 核酸分子雜交核酸分子雜交(zjio)技術(shù)技術(shù)第23頁(yè)/共49頁(yè)第二十四頁(yè)，共50頁(yè)。指將待測(cè)核酸序列指將待測(cè)核酸序列(xli)(xli)結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的結(jié)合到一定的支持物

14、上，然后與存在于液相中的核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。核酸探針進(jìn)行雜交的過(guò)程。第24頁(yè)/共49頁(yè)第二十五頁(yè)，共50頁(yè)。特點(diǎn)：特點(diǎn)： 較強(qiáng)的結(jié)合核酸的能力（較強(qiáng)的結(jié)合核酸的能力（10g/cm2）; 與核酸分子結(jié)合后，不影響核酸與探針的雜交反應(yīng)與核酸分子結(jié)合后，不影響核酸與探針的雜交反應(yīng)(fnyng); 與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定、牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等；與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定、牢固，能經(jīng)受雜交、洗膜等； 非特異性吸附少，經(jīng)洗膜能將非特異性吸附的探針洗脫掉非特異性吸附少，經(jīng)洗膜能將非特異性吸附的探針洗脫掉; 具有良好的機(jī)械性能，柔軟性好、韌性強(qiáng)，便于操作。具有良好的機(jī)械性能，柔軟性好、韌性強(qiáng)，便于操作。常用的

15、固相支持物：常用的固相支持物： 硝酸纖維膜（硝酸纖維膜（NC）、尼龍）、尼龍(nlng)膜、膜、PVDF膜（聚二氟乙烯膜）等膜（聚二氟乙烯膜）等第25頁(yè)/共49頁(yè)第二十六頁(yè)，共50頁(yè)。常用常用(chn(chn yn yn) )的固相支持物的固相支持物 硝酸纖維膜、尼龍膜、硝酸纖維膜、尼龍膜、PVDFPVDF膜等膜等第26頁(yè)/共49頁(yè)第二十七頁(yè)，共50頁(yè)。易破碎易破碎第27頁(yè)/共49頁(yè)第二十八頁(yè)，共50頁(yè)。第28頁(yè)/共49頁(yè)第二十九頁(yè)，共50頁(yè)。第29頁(yè)/共49頁(yè)第三十頁(yè)，共50頁(yè)。2印跡印跡(yn j)方法方法 Mechanics of transfer虹吸印跡虹吸印跡(yn j)法（法（Ca

16、pillary）真空轉(zhuǎn)移法（真空轉(zhuǎn)移法（Vacuum）電轉(zhuǎn)移法（電轉(zhuǎn)移法（Electrophoretic）Blot DNA to membrane第30頁(yè)/共49頁(yè)第三十一頁(yè)，共50頁(yè)。 1975年年 E. Southern Southern DNA 印跡印跡(yn j)轉(zhuǎn)移技術(shù)轉(zhuǎn)移技術(shù)DNA片段片段(pin dun)15kb，18小時(shí)小時(shí)第31頁(yè)/共49頁(yè)第三十二頁(yè)，共50頁(yè)。Electrophoretic blotting不宜不宜(by)用硝酸用硝酸纖維素膜纖維素膜一般一般(ybn)23小時(shí)，小時(shí)，最多最多6 8小時(shí)小時(shí)especially good for small fragments

17、 resolved by PAGE第32頁(yè)/共49頁(yè)第三十三頁(yè)，共50頁(yè)。3060分鐘分鐘more efficient and quantitative than capillarymust apply vacuum evenly and not too strongly第33頁(yè)/共49頁(yè)第三十四頁(yè)，共50頁(yè)。3印跡印跡(yn j)類型類型 Southern印跡雜交印跡雜交 Northern印跡雜交印跡雜交 斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交斑點(diǎn)及狹縫印跡雜交 反向反向(fn xin)斑點(diǎn)雜交斑點(diǎn)雜交 菌落或噬菌斑雜交菌落或噬菌斑雜交第34頁(yè)/共49頁(yè)第三十五頁(yè)，共50頁(yè)。提取提取(tq)DNA限制性內(nèi)切酶消

18、化限制性內(nèi)切酶消化(xiohu)瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳堿變性堿變性(binxng)轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC膜，高溫烘烤膜，高溫烘烤與與DNA或或RNA探針探針雜交雜交放射自顯影放射自顯影Southern blotting hybridization 檢測(cè)靶分子為檢測(cè)靶分子為DNA, 檢測(cè)靶分子是檢測(cè)靶分子是否含有目的基因。否含有目的基因。 可用于可用于基因組基因的定性及定量分析、基因組基因的定性及定量分析、克隆基因的酶切圖譜分析、克隆基因的酶切圖譜分析、基因突變分析等。基因突變分析等。預(yù)雜交預(yù)雜交第35頁(yè)/共49頁(yè)第三十六頁(yè)，共50頁(yè)。Paper TowelsSouthern Blotting

19、hybridizationtissueSDSProt KPhenolChloroSpin提取提取(tq)DNA限制性內(nèi)切酶消化限制性內(nèi)切酶消化(xiohu)瓊瓊脂脂糖糖凝凝膠膠電電泳泳堿變性堿變性(binxng)、轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移到到NC膜膜與與DNA或或RNA探針探針雜交雜交放射自顯影放射自顯影第36頁(yè)/共49頁(yè)第三十七頁(yè)，共50頁(yè)。第37頁(yè)/共49頁(yè)第三十八頁(yè)，共50頁(yè)。 檢測(cè)靶分子為檢測(cè)靶分子為DNA, 檢測(cè)靶分子是否檢測(cè)靶分子是否(sh fu) 含有目的基因。含有目的基因。DNA指紋圖譜指紋圖譜Southern印跡雜交的應(yīng)用印跡雜交的應(yīng)用(yngyng)： 第38頁(yè)/共49頁(yè)第三十九頁(yè)，共5

20、0頁(yè)。Northern blotting hybridization檢測(cè)檢測(cè)(jin c)靶分子為靶分子為RNARNA極易被極易被RNase 降解降解(jin ji)RNA酶抑制劑酶抑制劑0.1%DEPC處理水處理水(焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯)第39頁(yè)/共49頁(yè)第四十頁(yè)，共50頁(yè)。與與Southern blotting hybridization不同之處：不同之處：不需要限制性核酸內(nèi)切酶酶切。不需要限制性核酸內(nèi)切酶酶切。變性變性(binxng)方法不是堿變性方法不是堿變性(binxng)，而是采用聚乙二醛和二，而是采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等方法。甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞

21、等方法。應(yīng)用：應(yīng)用：檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異檢測(cè)某一組織或細(xì)胞中已知的特異mRNA的表達(dá)水平。的表達(dá)水平。比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。比較不同組織或細(xì)胞的同一基因的表達(dá)情況。Northern blotting hybridization第40頁(yè)/共49頁(yè)第四十一頁(yè)，共50頁(yè)。 pancreas kidney skeletal liver lung placenta brain heartmuscleGEF mRNASouthern blotting hybridization第41頁(yè)/共49頁(yè)第四十二頁(yè)，共50頁(yè)。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、迅速（直接點(diǎn)樣）；優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單、迅速（直接點(diǎn)樣）；

22、可在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；可在同一張膜上進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè)；應(yīng)用：同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋應(yīng)用：同一種樣品經(jīng)不同倍數(shù)的稀釋, 可以可以(ky)得到半定量的結(jié)果；得到半定量的結(jié)果； 核酸粗提樣品的檢測(cè)效果也較好。核酸粗提樣品的檢測(cè)效果也較好。Dot and slot blotting hybridization將變性將變性(binxng)后的后的DNA或或RNA直接點(diǎn)樣與直接點(diǎn)樣與膜上膜上第42頁(yè)/共49頁(yè)第四十三頁(yè)，共50頁(yè)。Reverse dot hybridization 直接將不同直接將不同(b tn)的探針點(diǎn)印并固定在膜上，再將待測(cè)的的探針點(diǎn)印并固定在膜上，再將待測(cè)的DNA樣品與探針樣品與探針雜交，這樣一次雜交反應(yīng)就可以判斷雜交，這樣一次雜交反應(yīng)就可以判斷DNA是否含有這些探針的同源序列。是否含有這些探針的同源序列。DNA chip第43頁(yè)/共49頁(yè)第四十四頁(yè)，共50頁(yè)。第44頁(yè)/共49頁(yè)第四十五頁(yè)，共50頁(yè)。第45頁(yè)/共49頁(yè)第四十六頁(yè)，共50頁(yè)。 探針與分裂中期染色體探針與分裂中期染色體DNA雜交，研究