植物快速繁殖技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)

1、植物快速繁殖技術(shù)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)國(guó)平編生態(tài)與資源工程系2014年1月8日目錄前言 III學(xué)生實(shí)驗(yàn)守則 IV實(shí)驗(yàn)一 觀賞植物種子無(wú)菌萌發(fā)與試管開(kāi)花技術(shù) 1實(shí)驗(yàn)二 金線蓮的快速繁殖技術(shù) 3實(shí)驗(yàn)三 鐵皮石斛的快速繁殖技術(shù) 5 實(shí)驗(yàn)四 一種植物的組織培養(yǎng)與快速繁殖 8刖言植物組織培養(yǎng)即植物無(wú)菌培養(yǎng)技術(shù)，又稱離體培養(yǎng)，是根據(jù)植物細(xì)胞具有 全能性的理論，利用植物體離體的器官（如根、莖、葉、莖尖、花、果實(shí)等）、 組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細(xì)胞、胚乳等）或細(xì)胞（如大抱子、小抱子、 體細(xì)胞等）以及原生質(zhì)體，在無(wú)菌和適宜的人工培養(yǎng)基及溫度等人工條件下，能 誘導(dǎo)出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學(xué)科。近

2、40年以來(lái),植物組培技術(shù)已滲透到植物生理學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)、藥學(xué)、育種以及生物化學(xué) 等各個(gè)研究領(lǐng)域，為快速繁育優(yōu)良品種，培育無(wú)毒苗木，進(jìn)行突變篩選培育，藥 用植物工廠化生產(chǎn)，種質(zhì)保存和基因庫(kù)建立等方面開(kāi)辟了新途徑，成為生物學(xué)科 中的重要研究技術(shù)和手段之一?，F(xiàn)如今，植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有保持花卉優(yōu)良性 狀、培育脫毒苗木、保存種質(zhì)資源等優(yōu)勢(shì)，根據(jù)這些優(yōu)勢(shì)，植物栽培技術(shù)也被廣 泛應(yīng)用于花卉的種苗繁殖與生產(chǎn)之中。學(xué)生實(shí)驗(yàn)守則、自覺(jué)遵守紀(jì)律和各項(xiàng)規(guī)章制度，保持室安靜，注意環(huán)境衛(wèi)生，不吸煙、不隨地吐痰、不亂扔紙屑雜物，愛(ài)護(hù)公務(wù)。二、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)肅認(rèn)真，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程。貴重、精密儀器的使用 須在專人指導(dǎo)下

3、進(jìn)行。三、愛(ài)護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備，厲行節(jié)約。儀器若有損壞，應(yīng)如實(shí)報(bào)告，填寫登 記表。凡損壞、丟失的儀器設(shè)備，均應(yīng)查清原因，按儀器設(shè)備損壞、丟失賠償制 度處理。四、實(shí)驗(yàn)物品不得隨意翻動(dòng)，嚴(yán)禁攜出室外。若需借用應(yīng)辦理借物手續(xù)。五、注意實(shí)驗(yàn)室安全，易燃易爆品的操作應(yīng)遠(yuǎn)離火源。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)束，由實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教師和管理人員檢查清點(diǎn)儀器設(shè)備， 學(xué)生應(yīng)辦 好交接手續(xù)，做好清潔衛(wèi)生，及時(shí)關(guān)好水電閥門，保持實(shí)驗(yàn)室和儀器的清潔整齊。實(shí)驗(yàn)一觀賞植物種子無(wú)菌萌發(fā)與試管開(kāi)花技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆绽梅N子作為外植體進(jìn)行快速繁殖的方法；掌握試管花卉的培養(yǎng)技術(shù)； 了解植物開(kāi)花的影響因素。二、實(shí)驗(yàn)原理試管開(kāi)花是指用組織培養(yǎng)的方法，使植物開(kāi)花

4、的過(guò)程在培養(yǎng)容器中完成。一般情況下，植物必須達(dá)到某種成熟階段時(shí)才能開(kāi)花。自1946年羅士韋在對(duì)菟絲子莖尖培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)了花器官的形成后，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已用于植物離體開(kāi)花 的研究。影響試管開(kāi)花的因素主要有外植體， 外源植物激素，營(yíng)養(yǎng)水平和環(huán)境因 素等4個(gè)方面。通過(guò)改變培養(yǎng)基中外源植物激素、 營(yíng)養(yǎng)水平和培養(yǎng)環(huán)境條件，可 以誘導(dǎo)培養(yǎng)物在試管開(kāi)花。試管花卉作為高新技術(shù)與工藝生產(chǎn)相結(jié)合的新生物，不僅在理論研究上有 重要作用，而且可以利用成花決定因素的研究來(lái)培養(yǎng)能迅速進(jìn)入生殖階段的試 管苗或有觀賞價(jià)值的試管花卉，并將這一技術(shù)直接應(yīng)用于花卉生產(chǎn)。試管花卉有 較大市場(chǎng)前景，目前可以做成試管花卉的植物有石斛蘭、龍

5、角、波露、短葉蘆薈、美麗十 二卷、雞冠花、玫瑰、紅蓮、鳳梨、大花蕙蘭、狼牙掌、燕尾蘆薈、非洲紫羅蘭、 下城蘆薈、金線蓮、迎春、六月雪、紅葉、無(wú)刺火棘、紫薇、情人草、康乃馨、 幸運(yùn)草、草莓、非洲菊、文心蘭等。三、實(shí)驗(yàn)器具與藥品 器材：電子天平、托盤天平、燒杯(50ml, 100ml, 500ml, 1000ml)、量筒 (1000ml,100ml, 25ml)、容量瓶(1000ml,500ml,100ml)、藥勺、稱量紙、玻璃棒、 滴管、電爐、冰箱、移液槍、pH計(jì)、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、鑷子、酒精燈、 棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿。試劑：MS培養(yǎng)基各種母液、PP333 KT、6-BA、NAA、IAA、

6、蔗糖、瓊脂、酒精、升汞以矮生雞冠花品系的種子為試材 四、實(shí)驗(yàn)容與操作步驟1、培養(yǎng)基 的配制 種子萌發(fā)培 養(yǎng)基： MS基本培養(yǎng)基 增殖培養(yǎng)基：MS+NAA.1mg L-1+6-BA I.Omg L-1+ 蔗糖20 g L-1+ 瓊脂 10 g L-1 試管開(kāi)花誘導(dǎo)培養(yǎng)基： MS+PP3330.5mg L-1+NAAO.01mg L-1+ 蔗糖 20 g L-1 + 瓊脂 I0g L-12、種子滅菌先用洗潔精洗凈種子， 用自來(lái)水流水沖洗干凈；再用0.1% HgCb浸泡10 min, 最后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗 5 遍。在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的種子接種到 MS 培養(yǎng)基 上,每三角瓶接種5-10個(gè)外植體。培

7、養(yǎng)室條件為：光照12hd-1、光照強(qiáng)度1500LX、 溫度2526C。14d后統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率和污染率。3、增殖培養(yǎng)當(dāng)無(wú)菌苗長(zhǎng)到約2cm時(shí)，取其中約1cm芽段，接種到增殖培養(yǎng)基上，培 養(yǎng) 26 d 后統(tǒng)計(jì)其增殖倍數(shù)。4、開(kāi)花誘導(dǎo)將高約23cm的試管苗，轉(zhuǎn)到試管開(kāi)花誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件：日 溫（2 5±2）C，夜溫（20±2）C，光照強(qiáng)度 150 03 0 0 0 1 x，光照時(shí)間12h/d，接種30d后觀察統(tǒng)計(jì)試管開(kāi)花情況。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告種子發(fā)芽率和污染率、增殖倍數(shù)和試管開(kāi)花情況。六、思考題：什么是試管花卉？有何開(kāi)發(fā)價(jià)值？影響試管開(kāi)花的主要因素有哪些？實(shí)驗(yàn)二

8、金線蓮的快速繁殖技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆绽媒M織培養(yǎng)方法進(jìn)行金線蓮快速繁殖的技術(shù)；了解影響金線蓮快速繁殖的各種因素。二、實(shí)驗(yàn)原理金線蓮為蘭科開(kāi)唇蘭屬花葉開(kāi)唇蘭 (A noectochilus roxburghii (Wall.)Lin dl.)，又名金線蘭、金絲草。主要種植于我國(guó)、等亞熱帶及熱帶地區(qū)，素 有“金草”、“神藥”等美稱。金線蓮喜歡生長(zhǎng)在潮濕、陰涼的環(huán)境中，溫度需 要控制在2028 C之間，喜散射光，最忌直射，對(duì)環(huán)境的要求比較嚴(yán)格。近 年來(lái)，由于其藥用價(jià)值不斷被發(fā)掘，金線蓮人工環(huán)境中的量產(chǎn)也逐步實(shí)現(xiàn)。 特別 是在、等華南地區(qū)，應(yīng)用金線蓮組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)商品金線蓮的模式不斷興起。野生金線蓮

9、自然繁殖是用種子繁殖的， 其人工繁育技術(shù)難度較大。應(yīng)用組培 繁殖可大大縮短金線蓮成苗時(shí)間，顯著提高培養(yǎng)效率，降低育苗成本，是金線蓮 種苗生產(chǎn)的重要方法。三、實(shí)驗(yàn)器具與藥品 器材：電子天平、托盤天平、燒杯(50ml, 100ml, 500ml, 1000ml)、量筒 (1000ml,100ml, 25ml)、容量瓶(1000ml,500ml,100ml)、藥勺、稱量紙、玻璃棒、滴管、電爐、冰箱、移液槍、pH計(jì)、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、鑷子、酒精燈、 棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿。 試劑：MS培養(yǎng)基各種母液、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、瓊脂、酒 精、升汞、香蕉汁、活性炭等。 金線蓮野生種苗或試管

10、苗。四、實(shí)驗(yàn)容與操作步驟1、培養(yǎng)基 的配制 莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS + BA 1.5+ NAA 0. 5 + 香蕉汁100 g/L 繼代增殖培養(yǎng)基：1 2MS+ BA 2.0 + NAA0.3 +香蕉汁100 g/L + AC0.2%; 生根培養(yǎng)基:1 2MS + IBA + NAA 0.3 + AC 0.2% 2、莖段誘導(dǎo)將帶芽的金線蓮莖段剪成23cm長(zhǎng)的莖段用自來(lái)水沖洗，置飽和漂白粉 上清液中浸泡15 min，并用軟毛刷輕輕刷洗，沖洗干凈；在自來(lái)水下滴沖12 h,雙蒸水沖洗23次，置超凈工作臺(tái)用75%酒精消毒30 s, 0. 1%氯化汞溶 液消毒 10 13 min ，無(wú)菌水沖洗 3 5 次

11、； 取出要接種的材料放在滅過(guò)菌的 培養(yǎng)皿上， 用手術(shù)刀切掉與氯化汞接觸的切口， 然后將材料平放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基面 上進(jìn)行誘導(dǎo)。每瓶接種帶側(cè)芽的莖段數(shù) 5個(gè)，每隔一周觀察污染情況和記錄側(cè)芽 發(fā)芽狀況， 30 d 后記錄發(fā)芽個(gè)數(shù)，并算出側(cè)芽的出芽率。3、叢生芽的增殖培養(yǎng)將誘導(dǎo)產(chǎn)生的高 1. 01. 5 cm 的叢生芽從瓶中取出，切去葉片和基部褐化部分，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，每瓶接種 3-5個(gè)不定芽，每隔一周觀察其污染情 況及記錄增殖培養(yǎng)過(guò)程中叢生芽的增殖狀況， 50 d 后記錄增加的不定芽的個(gè)數(shù)， 計(jì)算增殖倍數(shù)。4、生根培養(yǎng)當(dāng)叢生芽長(zhǎng)至 1. 5 3. 0 cm 高， 2 3 片葉時(shí)，將其分成單個(gè)植株，

12、接 入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。 每瓶培養(yǎng)基接種 5 株，每隔一周觀察其污染情況及記 錄叢生芽的生根狀況， 30 d 后記錄生根株數(shù)及每株的生根數(shù)，并計(jì)算生根培養(yǎng) 基下幼苗的生根率及平均生根數(shù)。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告?zhèn)妊空T導(dǎo)率和污染率、叢生芽增殖倍數(shù)、試管苗生根率 及平均生根數(shù)；總結(jié)金線蓮的工廠化育苗技術(shù)。六、思考題：闡述金線蓮的生物學(xué)特性、價(jià)值和育苗技術(shù)。實(shí)驗(yàn)三鐵皮石斛的快速繁殖技術(shù)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆绽媒M織培養(yǎng)方法進(jìn)行鐵皮石斛快速繁殖的技術(shù)；了解影響鐵皮石斛快速繁殖的各種因素。二、實(shí)驗(yàn)原理鐵皮石斛(Dendrobium officinale)是一種生長(zhǎng)緩慢、自然繁殖率很低的蘭科附生植物，

13、具有很高的藥用價(jià)值，為傳統(tǒng)名貴中藥，有“救命仙草”、“藥 中黃金”之美稱。自然資源將近枯竭，已列入瀕危保護(hù)植物。鐵皮石斛種質(zhì)資源 的保護(hù)和開(kāi)發(fā)離不開(kāi)植物組織培養(yǎng)技術(shù)，組培工廠化生產(chǎn)是鐵皮石斛種植規(guī)?；?的基礎(chǔ)。鐵皮石斛目前關(guān)于其組織培養(yǎng)及快速繁殖的研究頗多，用于外植體的有 種子、無(wú)菌苗幼苗莖段、原球莖及人工種子等；再生植株的獲得途徑主要有種子 一原球莖一小植株,種子一原球莖-無(wú)菌苗莖段一小植株,種子一愈傷組織一原 球莖一小植株等。由于鐵皮石斛組培周期長(zhǎng)，如何有效解決快繁中存在的組培苗 生產(chǎn)成本高、移栽苗成活率低、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)程度低等問(wèn)題是維持鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)健 康發(fā)展的基石，是開(kāi)發(fā)利用鐵皮石斛資源的

14、一個(gè)重要方面。三、實(shí)驗(yàn)器具與藥品 器材：電子天平、托盤天平、燒杯(50ml, 100ml, 500ml, 1000ml)、量筒 (1000ml,100ml, 25ml)、容量瓶(1000ml,500ml,100ml)、藥勺、稱量紙、玻璃棒、滴管、電爐、冰箱、移液槍、pH計(jì)、高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、鑷子、酒精燈、 棉球、三角瓶、培養(yǎng)皿。 試劑：MS培養(yǎng)基各種母液、KT、6-BA、NAA、IAA、蔗糖、瓊脂、酒 精、升汞、香蕉汁、活性炭等。 鐵皮石斛野生種苗或試管苗。四、實(shí)驗(yàn)容與操作步驟1、培養(yǎng)基 的配制 莖段啟動(dòng)誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：(1) MS+ 6 BA 0.5mg/ L，單位下同)+ NAA 0.

15、05+2g/ L 活性碳； MS+ 6 BA1.0+ NAA 0. 1+ 2g/ L活性碳。 石斛繼代增殖培養(yǎng)基為：(3) 3g/ L 花寶3號(hào)+ 6-BA 1.0+ NAA 0.25+ 2g/ L 生根培養(yǎng)基為 : ( 5) 1/ 2MS+ IBA 0. 5+ 2g/ L 活性碳。以上培養(yǎng)基均加2.0%蔗糖,0.6%瓊脂，pH5.2 5. 4,培養(yǎng)溫度(25 ± 2C ),光照 度1500 2000 lx, 光照時(shí)間 12h/ d 。2、無(wú)菌材料的處理從植株上切下長(zhǎng) 2 5cm 的幼嫩莖段 , 在流水下沖洗 , 用刷子蘸少許洗衣粉 水輕輕刷洗 , 并經(jīng)自來(lái)水充分洗凈。 在超凈工作臺(tái)

16、上將莖段放置在 75% 的酒精中 消毒30s后，再用0. 1%的升汞水溶液浸泡810min,無(wú)菌水沖洗5 6次。3、原球莖的誘導(dǎo)用解剖刀將鐵皮石斛的幼嫩莖段切下 , 接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基 (1) 中培養(yǎng)，每瓶 接種帶側(cè)芽的莖段數(shù) 5個(gè)，每隔一周觀察污染情況和記錄原球莖誘導(dǎo)狀況。1520d 后, 外植體開(kāi)始萌動(dòng) , 莖段膨大 , 切面及頂部組織形成疏松組織。繼續(xù)培養(yǎng) 20d 后, 轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基 (2) 中, 切面及頂部膨大組織的表面形成凹凸不平的顆粒 物，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，顆粒物長(zhǎng)大形成直徑約12mm的原球莖顆粒物，30 d 后記錄原球莖個(gè)數(shù)，并算出原球莖誘導(dǎo)率。4、原球莖的增殖將培養(yǎng)基 ( 2)

17、中形成的原球莖轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基 (3) 、(4) 中, 30 d 后記錄原 球莖個(gè)數(shù)，并算出原球莖增殖率。原球莖在培養(yǎng)基 (3) 、(4) 中都有增殖 , 培養(yǎng)基 (4) 增殖速度很快 , 增殖倍 數(shù)可達(dá)34 倍, 同時(shí), 部分原球莖開(kāi)始分化出芽點(diǎn)并長(zhǎng)出 1 2 片小葉, 原球莖 的增殖與芽分化同時(shí)進(jìn)行 , 表明高濃度的激素組合可促進(jìn)原球莖的增殖與分化。 待芽數(shù)量較多時(shí)，將高1 2cm、帶有23片葉的小芽切下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(5)上 進(jìn)行生根培養(yǎng)。5、生根與移栽小苗在生根培養(yǎng)基 進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)。培養(yǎng)30d左右，基部開(kāi)始出現(xiàn)2 3條約1cm長(zhǎng)的白色根，隨后逐漸伸長(zhǎng)，45d統(tǒng)計(jì)生根率？當(dāng)苗高3cm以上

18、、具3 4 片葉時(shí) , 便可出瓶移栽。移栽前 , 將生根瓶苗打開(kāi)瓶蓋 , 移至常溫下煉苗 7d, 然后, 將瓶苗取出 , 洗去附著在根部的培養(yǎng)基 , 用0. 01%的高錳酸鉀溶液浸泡 8 10 min, 栽種于已滅菌的碎樹(shù)皮基質(zhì)中 ( 移栽前澆透水 ) , 放置在遮光度 50% 60%、濕度達(dá) 80% 以上的溫室中 , 2 個(gè)月后統(tǒng)計(jì)成活率？ 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告原球莖誘導(dǎo)率和污染率、原球莖增殖倍數(shù)、試管苗生根率及平均生根數(shù)；總結(jié)鐵皮石斛的工廠化育苗技術(shù)。六、思考題：闡述鐵皮石斛的生物學(xué)特性、價(jià)值和育苗技術(shù)。實(shí)驗(yàn)四一種植物的組織培養(yǎng)與快速繁殖本實(shí)驗(yàn)要求選擇一種植物作為培養(yǎng)的對(duì)象，設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)方案，以獲得再生 植株為目標(biāo)開(kāi)展離體培養(yǎng)研究，并報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)方案需要說(shuō)明以下容：（1） 選擇的是什么植物？選擇該種植物的理由是什么？（ 2）植株再生的途徑是什么？（3）各階段培養(yǎng)基配方是什么？ （4）外植體如何消毒？ （ 5）接種過(guò)程是怎樣的？ （6）培養(yǎng)條件是怎樣的？ （ 7）預(yù)期結(jié)果是怎樣的？一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊罁?jù)已掌握的植物組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)一種有開(kāi)發(fā)價(jià)值的植物進(jìn)行離體培養(yǎng)，獲得其試管苗，形成該種植物的組織培養(yǎng)