飲用水中微囊藻毒素化學檢測方法-固相萃取與高效液相層

1、飲用水中微囊藻毒素化學檢測方法固相萃取與高效液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀法NIEA W539.50B一、方法概要本方法使用高效液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀（HPLC/MS-MS）檢測飲用水中的兩種微囊藻毒素（Microcystins，簡稱MCs）MC-LR及MC-RR予以定量。水樣調(diào)整pH至約10.5，經(jīng)固相管柱萃取後，收集沖提液，以氮氣濃縮過濾後，以HPLC/MS-MS分析。二、適用範圍(一)本方法適用於飲用水、淨水廠淨化後出水或清水等水樣中微囊藻毒素之檢測。（單一實驗室所測得MDL：MC-LR為0.009 g/L；MC-RR為0.004 g/L。）(二)本方法所使用之HPLC/MS-MS宜由具高效液相層析

2、串聯(lián)式質(zhì)譜儀分析經(jīng)驗之人員，或經(jīng)由訓練通過認定者擔任。(三)本方法係依效能為基準（Performance-based），可依使用的固相萃取管柱、前處理程序、高效液相層析儀、LC層析管柱及串聯(lián)式質(zhì)譜儀廠牌的不同，分析人員可適當修改本方法之樣品前處理程序，惟修改後之方法其執(zhí)行檢測之所有步驟及程序，應(yīng)符合本方法所述品質(zhì)管制規(guī)範。三、干擾(一)本方法的干擾可能來自於溶劑、試劑、玻璃器皿及樣品處理過程中所使用的硬體設(shè)備之污染，干擾物質(zhì)會導致層析圖基線之上移，須執(zhí)行空白樣品的測試，以證明無干擾情形。 (二)所有使用之實驗器皿（包含玻璃器皿和塑膠器皿）必須謹慎清洗。實驗器皿應(yīng)先用甲醇潤洗，再以去離子水沖洗，

3、存放於乾淨之環(huán)境自然風乾。 (三)干擾物質(zhì)可能是樣品中之其他物質(zhì)，基質(zhì)干擾的程度隨樣品之來源而不同。由於本方法所使用之偵測系統(tǒng)具選擇性，因此本方法所探討之基質(zhì)中並無觀察到干擾物，如果有干擾發(fā)生，可用適當?shù)腟PE淨化去除。 (四)儀器必須將MS-MS的條件調(diào)整至最佳化，以達到要求的解析度及質(zhì)量的準確度。在HPLC/MS-MS中如層析管柱材質(zhì)、管柱的長度、內(nèi)徑、層析的流速、移動相及添加劑的選擇，都足以影響分析效果及儀器感度。而電灑法又跟待測物、溶劑及流速的關(guān)係密切，所以需考量液體本身的電導係數(shù)及介電常數(shù)，以減少離子抑制的情況，以達到MS-MS分析效率的最佳化。 四、設(shè)備(一)採樣瓶：1 L，玻璃、

4、PP或HDPE採樣瓶，並附螺旋瓶蓋。使用前需先清洗並乾燥。(二)定量瓶：棕色硼矽玻璃材質(zhì)，10 mL和25 mL。(三)KD管：硼矽玻璃材質(zhì)，容量15 mL，可定容2.0 mL。(四)分析天平：可精秤至0.1 mg。(五)天平：可精秤至0.01 g。(六)酸鹼度計：能測量pH值至0.1單位。(七)純水裝置：Millipore公司之Milli-Q型純水系統(tǒng)；或同級品。 (八)高效液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀（HPLC/MS-MS）裝置、高效液相層析儀：HPLC（Agilent 1100；1200型）；或同級品。、串聯(lián)式質(zhì)譜儀：串聯(lián)式質(zhì)譜儀（ABI API 2000；API 3000 MS-MS）；或同級

5、品。、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)：ABI公司Analyst 1.42版；或其他能顯示分析物的滯留時間及尖峰面積之定性及定量系統(tǒng)。(九)萃取裝置、固相萃取管柱：Oasis HLB Cartridges 200 mg，6 mL；或Supelco填充C18-E 1 g，6 mL；或同級品。、固相萃取裝置：Waters，SPE萃取裝置；或同級品。、蠕動馬達：Gilson Minipuls 3型；或其他類似之蠕動馬達，可調(diào)整流速。、真空幫浦：可調(diào)整真空度，可維持真空壓力至8-10 mmHg。、氮氣吹乾裝置（N2 Evaporator）：可調(diào)整加熱溫度和氮氣吹出量。、過濾膜：0.2 mm孔徑，13 mm直徑，Nylon

6、材質(zhì)；或同級品。、過濾膜：0.45 mm孔徑，47 mm直徑，Nylon材質(zhì)；或同級品。五、試劑(一)試劑水：不含待測物之去離子水，其電阻應(yīng)大於18 M-cm。 (二)甲醇（Methanol）：HPLC級或LC/MS級；或更高純度。(三)甲酸（Formic acid）：GR級；或更高純度。(四)乙酸（Acetic acid）：GR級；或更高純度。(五)氰甲烷（Acetonitrile）：HPLC級或LC/MS級；或更高純度。(六)氨水：33%，ACS試藥級。(七)含0.1%甲酸的試劑水：HPLC級或LC/MS級。(八)液態(tài)氮氣（N2）：純度99.99%以上。 (九)儲備標準溶液、標準品購置來源

7、（註1）：()Microcystin- LR：購自ZEN-U BIOTECHNOLOGY Co., LTD，純質(zhì)，1 mg瓶。()Microcystin- RR：購自ZEN-U BIOTECHNOLOGY Co., LTD，純質(zhì)，1 mg瓶。、儲備標準品溶液配製：()將2.0 mL甲醇加入標準品瓶中完全混合，即為1 mg/2 mL500 mg/L。()取上述溶液20 mL加10 mL甲醇，即為1 mg/L。六、採樣與保存(一)使用乾淨的高密度聚乙烯（HDPE）、聚丙烯（PP）材質(zhì)容器瓶或棕色玻璃瓶進行水樣採集。(二)1L水樣採集後，為避免分析物被微生物降解，須冷藏於42下，並在14天內(nèi)完成萃取

8、，萃取液如置於冷凍櫃中保存，應(yīng)於一個月內(nèi)完成儀器分析。七、步驟(一)檢量線製備（建議配製方式及濃度如下，使用者須依儀器廠牌的感度及線性範圍作適當?shù)男拚?、 檢量線溶液配製：取1 mg/L之MC-LR及 MC-RR配製檢量線，檢量線建議濃度範圍為1500 mg/L。、 分析至少5個不同濃度，可參考由上述所製備的檢量線標準品溶液，最低一點濃度應(yīng)與方法定量極限（約為3倍方法偵測極限）之濃度相當。、 檢量線的濃度範圍，需搭配使用的儀器偵測極限及感度範圍來決定。(二)水樣前處理 水樣中如果含有微?；蚴遣幻骰旌衔飼r，則需經(jīng)過0.45 mm濾膜過濾；或以高轉(zhuǎn)速大體積之冷凍離心機（5000 rpm）離心去除

9、懸浮微粒。(三)固相萃?。⊿PE）步驟：（以下是單一實驗室方法驗證時之操作條件，實驗室得依使用之萃取管柱不同，適當修正之；建議操作流程圖如圖一所示） 、固相萃取管柱必須經(jīng)由5 mL甲醇流洗兩次後，再以5 mL試劑水流洗兩次。 、取200 mL水樣放入250 mL玻璃血清瓶中，以10%氨水調(diào)整水樣pH值至約10.5。 、水樣以6 mL/min的流速流經(jīng)固相萃取管柱後，並抽乾固相萃取管柱。 、固相管柱內(nèi)加入5 mL甲醇（含0.1%乙酸），重複2次，收集合併沖提液於KD管。 、沖提液於60下氮氣（N2）吹至約1 mL後，以甲醇水（含0.1%甲酸；50:50, v/v）溶解振盪均勻，定容至2 mL。

10、、最後經(jīng)由0.2 mm孔徑，Nylon過濾膜過濾之。 、取適量樣品以高效液相層析串聯(lián)式質(zhì)譜儀分析。 (四)儀器分析條件（註2）：、高效液相層析建議條件：()層析管柱：Phenomenex公司之Gemini 3m C18 110 （100 2.0 mm）；或同級品。 ()移動相A組成：水（含0.1%甲酸）。 ()移動相B組成：甲醇含0.1%甲酸；亦可使用氰甲烷（ACN）。 ()清洗溶劑：100%甲醇（Methanol）。 ()流速：0.25 mL/min。 ()樣品注入量：10 mL。 ()管柱溫度：40。 ()分析時間：25 min。 ()層析條件：HPLC層析條件如下： 步驟時間（分）A（%

11、）B（%）10.19010219010362080416208051790106259010 、串聯(lián)式質(zhì)譜儀建議條件：()Ionization mode: 正離子電灑游離法模式（ESI+） ()Ion Spray Voltage (IS): 5.0 kV ()Curtain Gas (CUR): 10 psi ()Gas1 (GS1): 60 psi ()Gas2 (GS2): 50 psi ()Temperature (TEM): 420 ()Interface Heater: ON ()Collisionally Activated Dissociation (CAD): 4 ()MRM離

12、子對及其質(zhì)譜參數(shù)如表一及表二（註3）所示 (五)鑑定與分析（母子離子對層析圖如圖二所示）：、使用液相層析串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)之多重反應(yīng)監(jiān)測模式（Multiple Reaction Monitoring mode，MRM）時，對每一種化合物監(jiān)測其母離子子離子之離子對兩對，以其中感度較高的母子離子對作為定量，另一母子離子對則作為定性的依據(jù)。MC-LR的分子量為994.548，其【MH】為996，MC-RR的分子量為1037.565，其【M2H】2為520，而其結(jié)構(gòu)代表性的子離子分別為135PhCH2CH(OMe)及213Glu-Mdha+H 。 、初步篩選與定量準則： ()待測物之滯留時間須落在當天檢量線

13、標準品平均滯留時間 2.5%範圍之內(nèi)。 ()以待測物感度較高的監(jiān)測母子離子對之面積來定量該待測物的含量。 ()當樣品中藻毒濃度初步篩選定量結(jié)果未超過法規(guī)管制標準二分之一時，即可出具報告；若超過法規(guī)管制標準二分之一時，須完整進行下節(jié)確認動作。、定性與定量準則： ()待測物之兩監(jiān)測母子離子對須同時出現(xiàn)，且兩母子離子對的訊噪比（S/N）必須大於3。 ()待測物之滯留時間須落在當天檢量線標準品（各點平均）或標準添加樣品之標準品之滯留時間 2.5%範圍之內(nèi)。 ()以待測物感度較高的監(jiān)測母子離子對之面積來定量該待測物的含量。 ()待測物之兩監(jiān)測母子離子對（積分面積或高度）的相對比率（Ion Ratio）須

14、落在可接受的離子比例範圍之內(nèi)（母子離子對比值的最大相對誤差表，如表三所示。），其相對比率須以當天檢量線中點或標準添加樣品的母子離子對的比例為基準計算之。()當樣品待測物濃度超過檢量線時，應(yīng)以甲醇稀釋後，重新上機分析。 八、結(jié)果處理(一)線性回歸校正法 C水樣濃度，g/LCa由檢量線所求得之樣品濃度，g/LVf水樣濃縮後（沖提液）的體積，mLVi水樣的體積，mL(二)報告濃度單位為g/L。樣品濃度1 g/L（含）以上取3位有效位數(shù)；樣品濃度1 g/L以下，則取2位有效位數(shù)。 九、品質(zhì)管制(一)依本方法執(zhí)行藻毒檢測之實驗室，必須有完整之品保品管程序，包括空白樣品分析、查核樣品分析、添加樣品分析及重

15、複樣品分析等實驗室能力建立資料，據(jù)以持續(xù)評估實驗室之效能，以期執(zhí)行樣品分析時能確實符合各項品管指標之規(guī)範。 (二)每批次分析樣品前，須確認試劑及儀器並無污染情形。 (三)檢量線應(yīng)每日製作，檢量線以線性回歸校正法，其線性相關(guān)係數(shù)（R）應(yīng)0.995，使用1/x加權(quán)。 (四)空白樣品分析：每20個樣品或每批次樣品，應(yīng)執(zhí)行空白樣品分析，空白樣品分析值應(yīng)小於方法偵測極限值之2倍。 (五)查核樣品分析：每20個樣品或每批次樣品，應(yīng)執(zhí)行查核樣品樣品分析，其回收率應(yīng)在70至130%範圍內(nèi)。 (六)添加樣品分析：每20個樣品或每批次樣品，應(yīng)執(zhí)行基質(zhì)添加樣品分析，其回收率應(yīng)在60至130%範圍內(nèi)。 (七)重複樣品

16、分析：每20個或每批樣品至少執(zhí)行一次重複樣品分析，其相對差異百分比應(yīng)在30%內(nèi)。十、準確度與精密度 表四及表五為單一實驗室查核樣品與添加樣品分析之準確度與精密度的結(jié)果。十一、參考資料(一)潘復華、賴千豐、蕭美琪、莊士群等，飲用水水源及水質(zhì)中微囊藻毒以HPLC/MS-MS 之分析技術(shù)研究，環(huán)境檢驗所調(diào)查研究年報，第13號：p.177192，2006。(二)潘復華、黃壬瑰、蕭美琪、莊士群等，行政院環(huán)境保護署環(huán)境檢驗所，國內(nèi)水庫水源水質(zhì)中微囊藻及其藻毒調(diào)查與預警模式之建立（1/2），中華民國九十五年三月.(三)潘復華、黃壬瑰、蕭美琪、莊士群等，行政院環(huán)境保護署環(huán)境檢驗所，國內(nèi)水庫水源水質(zhì)中微囊藻及其

17、藻毒調(diào)查與預警模式之建立（2/2），中華民國九十六年三月.(四)潘復華、黃壬瑰、趙春美、翁英明等，行政院環(huán)境保護署環(huán)境檢驗所，水源水質(zhì)中藻類及其毒性調(diào)查研究，中華民國九十七年三月.(五)European Commission Decision of 13 March 2003 amending Decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required performance limits (MRPLs) for certain residues in food animal origin (2003/18/EC), Off.

18、 Eur. Commun. L71 (2003)註：由於微囊藻毒素被視為化學武器，受聯(lián)合國管制列為管制物質(zhì)，目前國內(nèi)可買到的只有MC-LR及MC-RR兩種標準品，且無法取得可追溯一級標準品及第二來源標準品。 註：本方法建議之前處理條件、儀器最佳化及分析條件是以HPLC（Agilent 1100型）和串聯(lián)式質(zhì)譜儀（ABI API 2000 HPLC/MS-MS）所開發(fā)完成。 註： ABI API 2000及API 3000微囊藻毒之相對應(yīng)母子離子對離子表及質(zhì)譜參數(shù)，如表一及表二所示。 表一目標化合物其MRM離子對及其質(zhì)譜參數(shù)（API 2000）CompoundRetention time (mi

19、n)Precursor ion (m/z)Productions (m/z)Dwell time(msec)MS/MS parameters (volts)DPCEPCECXPMC-LR 16.53996135 213 100 115381051115381051MC-RR 14.38520135 213 100 25294522529452DP：Declustering Potential (volts), EP：Entrance Potential (volts), CE：Collision Energy Potential (volts), CXP：Collision Cell Exit Potential (volts) 表二目標化合物其MRM離子對及其質(zhì)譜參數(shù)（API 3000）CompoundRetention time (min)Precursor