高效液相色譜講義

1、第七章第七章 高效液相色譜法高效液相色譜法第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、史程、專用術(shù)語(yǔ)一、史程、專用術(shù)語(yǔ)二、色譜分離過(guò)程和類型二、色譜分離過(guò)程和類型液固吸附色譜液固吸附色譜液液分配色譜液液分配色譜離子交換色譜離子交換色譜離子對(duì)色譜離子對(duì)色譜空間排阻色譜空間排阻色譜三、色譜流程和儀器三、色譜流程和儀器四、四、HPLCHPLC的特點(diǎn)的特點(diǎn)速度快，分辨率高，靈敏度高、柱子可反復(fù)使用速度快，分辨率高，靈敏度高、柱子可反復(fù)使用第二節(jié)第二節(jié) 基本理論基本理論一、色譜分離過(guò)程一、色譜分離過(guò)程（一）液（一）液- -固吸附色譜固吸附色譜流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑，根據(jù)物質(zhì)吸流動(dòng)相為液體，固定相為固體吸附劑，根

2、據(jù)物質(zhì)吸附作用的不同來(lái)分離物質(zhì)。附作用的不同來(lái)分離物質(zhì)。流動(dòng)相和固定相都是液體的色譜法即為液流動(dòng)相和固定相都是液體的色譜法即為液- -液液色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間色譜，是利用樣品組分在兩種不相溶的液相間的分配來(lái)進(jìn)行分離。一種液相為流動(dòng)相，另一的分配來(lái)進(jìn)行分離。一種液相為流動(dòng)相，另一種是涂漬于載體上的固定相。種是涂漬于載體上的固定相。（二）液（二）液- -液分配色譜液分配色譜流動(dòng)相極性小于固定相極性的液流動(dòng)相極性小于固定相極性的液- -液色譜法稱為正相液色譜法稱為正相分配色譜法分配色譜法流動(dòng)相極性大于固定相極性的液流動(dòng)相極性大于固定相極性的液- -液色譜法稱為反相液色譜法稱為反相

3、分配色譜法分配色譜法（三）離子交換色譜（三）離子交換色譜（四）離子對(duì)色譜法（四）離子對(duì)色譜法（五）分子排阻色譜法（五）分子排阻色譜法二、色譜流出曲線和保留值二、色譜流出曲線和保留值（一）色譜流出曲線及相關(guān)術(shù)語(yǔ)（一）色譜流出曲線及相關(guān)術(shù)語(yǔ)（二）保留值（二）保留值三、分離度三、分離度第三節(jié)第三節(jié) 定性和定量分析定性和定量分析一、定性分析一、定性分析（一）利用已知物對(duì)照法定性（一）利用已知物對(duì)照法定性1 1、利用保留特性、利用保留特性2 2、利用不同柱比較、利用不同柱比較（二）色譜法和其他方法結(jié)合定性（二）色譜法和其他方法結(jié)合定性1 1、利用化學(xué)反應(yīng)定性、利用化學(xué)反應(yīng)定性2 2、利用二極管陳列檢測(cè)器

4、、利用二極管陳列檢測(cè)器3 3、收集峰的流出物、收集峰的流出物4 4、HPLC-MSHPLC-MS二、定量分析二、定量分析（一）峰面積或峰高的測(cè)量方法（一）峰面積或峰高的測(cè)量方法1 1、手測(cè)峰高、手測(cè)峰高2 2、峰高乘半峰寬、峰高乘半峰寬3 3、剪紙稱重、剪紙稱重4 4、積分儀測(cè)定、積分儀測(cè)定5 5、微處理機(jī)測(cè)定、微處理機(jī)測(cè)定（二）定量方法（二）定量方法1 1、峰面積歸一法、峰面積歸一法2 2、外標(biāo)法、外標(biāo)法3 3、內(nèi)標(biāo)法、內(nèi)標(biāo)法4 4、內(nèi)加法（或追加法）、內(nèi)加法（或追加法）第四節(jié)第四節(jié) 高效液相色譜的分離模式高效液相色譜的分離模式一、基本原理一、基本原理二、分類二、分類1 1、吸附色譜、吸附色

5、譜2 2、分配色譜、分配色譜3 3、離子交換色譜、離子交換色譜4 4、分子排阻色譜、分子排阻色譜5 5、親和色譜、親和色譜三、三、HPLCHPLC在生物大分子中的應(yīng)用在生物大分子中的應(yīng)用在生物大分子中的在生物大分子中的HPLCHPLC中，中，體積排阻色譜體積排阻色譜，離離子交換子交換、反相液相和親和色譜反相液相和親和色譜是最常用的分離是最常用的分離模式。模式。第五節(jié)第五節(jié) 液液- -固色譜法固色譜法液液- -固色譜法通常稱為吸附色譜固色譜法通常稱為吸附色譜1 1、載體：硅膠、載體：硅膠2 2、吸附劑吸附試樣的能力、吸附劑吸附試樣的能力3 3、原理、原理第六節(jié)第六節(jié) 鍵合相色譜法鍵合相色譜法一、

6、正相色譜法一、正相色譜法1 1、在正相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)、在正相色譜法中共價(jià)結(jié)合到載體上的基團(tuán)都是極性基團(tuán)。都是極性基團(tuán)。2 2、分離機(jī)制屬于分配色譜、分離機(jī)制屬于分配色譜3 3、主要用于分離極性不同的化合物，特別是、主要用于分離極性不同的化合物，特別是用來(lái)分離不同類型的化合物。用來(lái)分離不同類型的化合物。二、反相色譜二、反相色譜1 1、分離機(jī)理、分離機(jī)理2 2、固定相、固定相3 3、流動(dòng)相、流動(dòng)相第七節(jié)第七節(jié) 離子交換色譜離子交換色譜離子交換色譜是以離子交換色譜是以離子交換樹(shù)脂離子交換樹(shù)脂作為固定相，作為固定相，樹(shù)脂上具有樹(shù)脂上具有固定離子基團(tuán)固定離子基團(tuán)及及可交換的離子基團(tuán)可交換

7、的離子基團(tuán)，當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過(guò)固定相時(shí)，當(dāng)流動(dòng)相帶著組分電離生成的離子通過(guò)固定相時(shí)，組分離子與樹(shù)脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交組分離子與樹(shù)脂上可交換的離子基團(tuán)進(jìn)行可逆交換，根據(jù)組分離子對(duì)樹(shù)脂親和力不同而得到分離。換，根據(jù)組分離子對(duì)樹(shù)脂親和力不同而得到分離。按結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹(shù)脂可分為按結(jié)合的基團(tuán)不同，離子交換樹(shù)脂可分為陽(yáng)離子陽(yáng)離子交換樹(shù)脂交換樹(shù)脂和和陰離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂。 種類種類陽(yáng)離子交換樹(shù)脂陽(yáng)離子交換樹(shù)脂強(qiáng)酸性強(qiáng)酸性弱酸性弱酸性陰離子交換樹(shù)脂陰離子交換樹(shù)脂強(qiáng)堿性強(qiáng)堿性弱堿性弱堿性NR2NHRNH2N (CH3)3XNC2H4OH(CH3)2X-SO3HCOO

8、H-PO3H離子交換層析適用性離子交換層析適用性 能在水溶液或含水極性溶劑中產(chǎn)生游能在水溶液或含水極性溶劑中產(chǎn)生游離離子基團(tuán)的酸、堿及兩性成分?？捎糜陔x離子基團(tuán)的酸、堿及兩性成分?？捎糜诎被?、肽類、生物堿、有機(jī)酸、酚類等氨基酸、肽類、生物堿、有機(jī)酸、酚類等水溶性成分的分離。水溶性成分的分離。使用離子交換劑使物質(zhì)分離表使用離子交換劑使物質(zhì)分離表 樣品樣品 強(qiáng)酸型強(qiáng)酸型(磺酸型磺酸型) 稀稀NH4OH洗脫洗脫 通過(guò)液通過(guò)液 酸性、中性化合物酸性、中性化合物 解離型、兩性化合物解離型、兩性化合物 稀稀NaOH洗脫洗脫 強(qiáng)堿型強(qiáng)堿型(季銨型季銨型) 強(qiáng)堿型強(qiáng)堿型 稀稀HCl洗脫洗脫 通過(guò)液通過(guò)液 通

9、過(guò)液通過(guò)液 酸性化合物酸性化合物 中性化合物中性化合物 解離型物質(zhì)解離型物質(zhì) 兩性化合物兩性化合物 (鹽、生物堿鹽、生物堿)一、離子交換色譜的分離機(jī)理一、離子交換色譜的分離機(jī)理1、qxyP + L PL不足之處不足之處：忽略了在填料表面上形成復(fù)合物時(shí)：忽略了在填料表面上形成復(fù)合物時(shí)溶質(zhì)被流動(dòng)相中小分子飽和并不斷進(jìn)行計(jì)量置溶質(zhì)被流動(dòng)相中小分子飽和并不斷進(jìn)行計(jì)量置換反應(yīng)的重要因素。換反應(yīng)的重要因素。2 2、P0 + ZD0 Pb + ZDbP P0 0：流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度：流動(dòng)相中溶質(zhì)的濃度P Pb b：填料表面上被吸附的溶質(zhì)濃度：填料表面上被吸附的溶質(zhì)濃度D D0 0：流動(dòng)相中洗脫劑的濃度：流動(dòng)

10、相中洗脫劑的濃度D Db b：填料表面上洗脫劑的濃度：填料表面上洗脫劑的濃度Z Z：是蛋白質(zhì)在吸附過(guò)程中從填料表面上被置換的：是蛋白質(zhì)在吸附過(guò)程中從填料表面上被置換的洗脫劑的數(shù)目洗脫劑的數(shù)目。K=Pb X (Db)zP0 X (D0)z Z可以小到忽略不計(jì)，反應(yīng)常數(shù)變?yōu)榉峙湎禂?shù)可以小到忽略不計(jì)，反應(yīng)常數(shù)變?yōu)榉峙湎禂?shù)Kd=Pb P0 在Z值不能忽略時(shí)值不能忽略時(shí)K= (Db)z (D0)zKdx在等度洗脫蛋白質(zhì)的過(guò)程中，容量因子在等度洗脫蛋白質(zhì)的過(guò)程中，容量因子KK與保與保留留體積成比例，同時(shí)洗脫過(guò)程中，體積成比例，同時(shí)洗脫過(guò)程中，K Kd d， D Db b是常數(shù)，是常數(shù)，用用K Kz z表示

11、。表示。K= 1 (D0)zKzx 1 D0lgK = lg Kz + Zlg3 3 結(jié)論結(jié)論二、離子交換色譜的固定相二、離子交換色譜的固定相1 1、高分子類型填料、高分子類型填料 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)a填料的使用壽命長(zhǎng)填料的使用壽命長(zhǎng)b具有較高的色譜容量具有較高的色譜容量c 很少有非特異性吸附，對(duì)于保持樣品生物活性很少有非特異性吸附，對(duì)于保持樣品生物活性有利。有利。 結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)以交聯(lián)共聚的苯乙烯以交聯(lián)共聚的苯乙烯- -二乙烯苯為基質(zhì)，同時(shí)二乙烯苯為基質(zhì)，同時(shí)也出現(xiàn)了許多其他交聯(lián)高聚物基質(zhì)的固定相。也出現(xiàn)了許多其他交聯(lián)高聚物基質(zhì)的固定相。 類型類型Mono BeadsTSK-gel DEAE-5PW SP-

12、5PWCM-5PW2 2、無(wú)機(jī)基質(zhì)型、無(wú)機(jī)基質(zhì)型三、離子交換色譜的流動(dòng)相離子交換色譜的流動(dòng)相1 1、流動(dòng)相的、流動(dòng)相的PHPH值值 離子交換容量受離子交換容量受流動(dòng)相的流動(dòng)相的PHPH值影響值影響 改變流動(dòng)相改變流動(dòng)相PHPH值，也會(huì)影響弱電離的酸值，也會(huì)影響弱電離的酸性或堿性組分的電離情況，因而改變組分的性或堿性組分的電離情況，因而改變組分的保留值。保留值。流動(dòng)相流動(dòng)相PHPH值的變化也能改變分離的選擇性值的變化也能改變分離的選擇性 對(duì)流動(dòng)相對(duì)流動(dòng)相PHPH值的控制，通常采用緩沖溶液值的控制，通常采用緩沖溶液來(lái)實(shí)現(xiàn)。來(lái)實(shí)現(xiàn)。2 2、流動(dòng)相的離子強(qiáng)度、流動(dòng)相的離子強(qiáng)度四、離子交換色譜的影響因素

13、四、離子交換色譜的影響因素1 1、填料孔徑的影響、填料孔徑的影響2 2、柱長(zhǎng)的影響、柱長(zhǎng)的影響3 3、流速的影響、流速的影響4 4、PHPH值的影響值的影響無(wú)論在強(qiáng)的還是弱的陰離子交換柱上，蛋白質(zhì)無(wú)論在強(qiáng)的還是弱的陰離子交換柱上，蛋白質(zhì)均顯示不同均顯示不同PHPH值影響結(jié)果，因此決定了它的保值影響結(jié)果，因此決定了它的保留選擇性、分離度和回收率等因素。留選擇性、分離度和回收率等因素。5 5、離子強(qiáng)度的影響、離子強(qiáng)度的影響第八節(jié)第八節(jié) 體積排阻色譜法體積排阻色譜法一、分離機(jī)理一、分離機(jī)理1、體積排阻色譜法（體積排阻色譜法（SECSEC） 或空間排阻色譜法（或空間排阻色譜法（SECSEC） 或凝膠色

14、譜法或凝膠色譜法2、凝膠過(guò)濾色譜法（凝膠過(guò)濾色譜法（GFCGFC）Sephadex 葡聚糖凝膠3、凝膠滲透色譜法（凝膠滲透色譜法（GPCGPC）4 4、空間排斥理論、空間排斥理論Xm Xsk = Xs/XmVR =V0 + K VSV V0 0 死體積，相當(dāng)于凝膠的粒間體積死體積，相當(dāng)于凝膠的粒間體積V Vs s 色譜柱中凝膠的孔穴總體積色譜柱中凝膠的孔穴總體積二、體積排阻色譜法的特點(diǎn)二、體積排阻色譜法的特點(diǎn)三、體積排阻色譜法的固定相三、體積排阻色譜法的固定相（一）（一）固定相的分類固定相的分類1 1、按固定相基質(zhì)分類、按固定相基質(zhì)分類2 2、按固定相機(jī)械強(qiáng)度分類、按固定相機(jī)械強(qiáng)度分類（二）凝

15、膠固定相的特性參數(shù)（二）凝膠固定相的特性參數(shù)1 1、滲透極限、滲透極限2 2、分離范圍、分離范圍3 3、固流相比、固流相比在在SECSEC中常將柱中中常將柱中凝膠孔體積凝膠孔體積中的溶劑稱為中的溶劑稱為固定相固定相，而將柱中，而將柱中凝膠顆粒間空隙體積凝膠顆粒間空隙體積中稱為中稱為流動(dòng)相流動(dòng)相，而凝膠孔體積與凝膠顆粒間空隙體積，而凝膠孔體積與凝膠顆粒間空隙體積的比值稱作固流相比。的比值稱作固流相比。4 4、柱效、柱效（三）凝膠色譜柱的制備及譜圖的特點(diǎn)（三）凝膠色譜柱的制備及譜圖的特點(diǎn)物理因素物理因素影響凝膠色譜柱的性能影響凝膠色譜柱的性能 擴(kuò)大分離范圍擴(kuò)大分離范圍使用兩根以上的串聯(lián)色譜使用兩根

16、以上的串聯(lián)色譜柱柱。更換流動(dòng)相更換流動(dòng)相譜圖的特點(diǎn)：在凝膠滲透色譜中，對(duì)不同分子量譜圖的特點(diǎn)：在凝膠滲透色譜中，對(duì)不同分子量聚合物色譜峰的譜帶展寬不同于其它液相色譜。聚合物色譜峰的譜帶展寬不同于其它液相色譜。 在低效排租色譜法，樣品分子大小隨在低效排租色譜法，樣品分子大小隨V的增加的增加而急劇減小，而柱效卻隨樣品分子量的增加而增而急劇減小，而柱效卻隨樣品分子量的增加而增大因此在色譜圖上，不同分子量組分的譜帶寬度大因此在色譜圖上，不同分子量組分的譜帶寬度保持不變。保持不變。 在高效排租色譜法，峰寬卻是個(gè)變量。在高效排租色譜法，峰寬卻是個(gè)變量。四、體積排租色譜法的流動(dòng)相四、體積排租色譜法的流動(dòng)相在

17、體積排租色譜法中，流動(dòng)相的性質(zhì)對(duì)保留值在體積排租色譜法中，流動(dòng)相的性質(zhì)對(duì)保留值和分離選擇性無(wú)影響。和分離選擇性無(wú)影響。 溶解樣品的良溶劑溶解樣品的良溶劑 低黏度溶劑低黏度溶劑 柱填料不能在溶劑作用下收縮或溶脹柱填料不能在溶劑作用下收縮或溶脹 控制流動(dòng)相的控制流動(dòng)相的PH值和離子強(qiáng)度值和離子強(qiáng)度 凝膠滲透色譜凝膠滲透色譜示差折光檢測(cè)器示差折光檢測(cè)器流動(dòng)相的折射率必須盡可能與樣品的折射率流動(dòng)相的折射率必須盡可能與樣品的折射率有較大的差別。有較大的差別。凝膠過(guò)濾色譜凝膠過(guò)濾色譜紫外吸收檢測(cè)器紫外吸收檢測(cè)器使用在檢測(cè)波長(zhǎng)無(wú)紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相。使用在檢測(cè)波長(zhǎng)無(wú)紫外吸收的溶劑作流動(dòng)相。（一）凝膠滲透色

18、譜的流動(dòng)相（一）凝膠滲透色譜的流動(dòng)相凝膠滲透色譜常采用凝膠滲透色譜常采用甲苯，四氫呋喃和氯仿甲苯，四氫呋喃和氯仿等等有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。有機(jī)溶劑作流動(dòng)相。在用于高聚物分子量測(cè)定的凝膠滲透色譜中，在用于高聚物分子量測(cè)定的凝膠滲透色譜中，四氫呋喃四氫呋喃是最常用的流動(dòng)相，它對(duì)樣品有良好是最常用的流動(dòng)相，它對(duì)樣品有良好的溶解性能和低的黏度，并可使小孔徑聚苯乙的溶解性能和低的黏度，并可使小孔徑聚苯乙烯凝膠溶脹，因此被優(yōu)先推薦使用。烯凝膠溶脹，因此被優(yōu)先推薦使用。（二）凝膠過(guò)濾色譜的流動(dòng)相（二）凝膠過(guò)濾色譜的流動(dòng)相在凝膠過(guò)濾色譜中，使用以水作基體具有不同在凝膠過(guò)濾色譜中，使用以水作基體具有不同PH值的多種

19、緩沖溶液作流動(dòng)相。值的多種緩沖溶液作流動(dòng)相。五五、體積排租色譜的影響因素體積排租色譜的影響因素1、填料、填料 化學(xué)鍵合的硅膠化學(xué)鍵合的硅膠 親水樹(shù)脂凝膠親水樹(shù)脂凝膠2、柱長(zhǎng)、柱長(zhǎng)體積排租色譜的分離度與柱長(zhǎng)的平方根成正比。體積排租色譜的分離度與柱長(zhǎng)的平方根成正比。3、洗脫液、洗脫液 以硅膠為基質(zhì)的填料，以硅膠為基質(zhì)的填料，PH值范圍在值范圍在2.0-8.0。 鍵合硅膠如鍵合硅膠如TSK系列凝膠柱在分離蛋白質(zhì)時(shí)系列凝膠柱在分離蛋白質(zhì)時(shí)保留時(shí)間主要取決于填料表面上的硅醇基與離保留時(shí)間主要取決于填料表面上的硅醇基與離子的反應(yīng)。子的反應(yīng)。a) 洗脫液離子強(qiáng)度低時(shí)洗脫液離子強(qiáng)度低時(shí)b) 洗脫液離子強(qiáng)度低增

20、加到洗脫液離子強(qiáng)度低增加到0.3-0.5mol/Lc) 常用磷酸鹽和硫酸鹽進(jìn)行離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)常用磷酸鹽和硫酸鹽進(jìn)行離子強(qiáng)度的調(diào)節(jié)d) 用氯化鈉作離子劑，疏水作用最小用氯化鈉作離子劑，疏水作用最小e) PH值不能太低，因?yàn)橹挡荒芴?，因?yàn)镠+會(huì)腐蝕不銹鋼柱會(huì)腐蝕不銹鋼柱4、流速、流速蛋白質(zhì)分離時(shí)，流速對(duì)分離度的影響是一個(gè)很蛋白質(zhì)分離時(shí)，流速對(duì)分離度的影響是一個(gè)很重要的因素，一般在低流速下蛋白質(zhì)分離是比重要的因素，一般在低流速下蛋白質(zhì)分離是比較理想。較理想。5、樣品容量、樣品容量進(jìn)樣體積和樣品的濃度將明顯地影響蛋白質(zhì)的進(jìn)樣體積和樣品的濃度將明顯地影響蛋白質(zhì)的分離度。分離度。樣品的濃度范圍一般在樣品

21、的濃度范圍一般在0.01%-0.5%.最好是高濃度、小體積、在一般范圍內(nèi)可以得最好是高濃度、小體積、在一般范圍內(nèi)可以得到好的分離效果。蛋白質(zhì)的樣品體積為柱體積到好的分離效果。蛋白質(zhì)的樣品體積為柱體積的的1%-3%比較合適。比較合適。6、蛋白質(zhì)在變性條件下的分離、蛋白質(zhì)在變性條件下的分離 變性溶劑如變性溶劑如6mol/L鹽酸胍鹽酸胍、8mol/L脲脲、0.1%十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉(SDS)等有助于精確地確定蛋白等有助于精確地確定蛋白質(zhì)的分子量。質(zhì)的分子量。 在變性溶劑中，柱的分離范圍因此而移到在變性溶劑中，柱的分離范圍因此而移到低分子量范圍內(nèi)。低分子量范圍內(nèi)。示例：用高效凝膠過(guò)濾色譜法示

22、例：用高效凝膠過(guò)濾色譜法(HPGFC)測(cè)定重組測(cè)定重組人腫瘤壞死因子人腫瘤壞死因子(rh-TNF)衍生物的相對(duì)分子量衍生物的相對(duì)分子量rh-TNF屬基因工程藥物，其相對(duì)分子量的測(cè)定屬基因工程藥物，其相對(duì)分子量的測(cè)定是該藥質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一。是該藥質(zhì)量控制的主要指標(biāo)之一。儀器與色譜條件：島津儀器與色譜條件：島津LC-10A HPLC色譜柱：色譜柱：Beckman Ultraspherogel SEC 3000(30cm7.5cm)流動(dòng)相流動(dòng)相 0.1mmol/L KH2PO4 :0.1mmol/L Na2SO4(1 : 1) + 0.05% NaN3流速流速: 1mL/min 檢測(cè)波長(zhǎng)檢測(cè)波

23、長(zhǎng):280nm標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子量曲線的制備標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子量曲線的制備：選用四種蛋白：選用四種蛋白：醛縮酶醛縮酶、血清白蛋白血清白蛋白、碳酸酐碳酸酐酶酶及及抑蛋白酶肽抑蛋白酶肽制成的混合標(biāo)樣?？紤]流速等制成的混合標(biāo)樣?？紤]流速等因素對(duì)保留時(shí)間因素對(duì)保留時(shí)間T的影響而選用了的影響而選用了內(nèi)標(biāo)法內(nèi)標(biāo)法、既、既在混合標(biāo)樣中加入在混合標(biāo)樣中加入右旋糖酐藍(lán)右旋糖酐藍(lán)和和酪氨酸酪氨酸作為內(nèi)作為內(nèi)標(biāo)，進(jìn)樣后可同時(shí)測(cè)的完全排阻和完全進(jìn)入填標(biāo)，進(jìn)樣后可同時(shí)測(cè)的完全排阻和完全進(jìn)入填料孔的兩種內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間料孔的兩種內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間T0和和Tt，用分配系，用分配系數(shù)數(shù)Kd對(duì)相對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，從而保證結(jié)果有對(duì)相對(duì)分子

24、量對(duì)數(shù)作圖，從而保證結(jié)果有良好的重現(xiàn)性。良好的重現(xiàn)性。Kd=T-T0/(Tt-T0)樣品測(cè)定樣品測(cè)定:根據(jù)樣品的保留時(shí)間根據(jù)樣品的保留時(shí)間T求出其分配系數(shù)求出其分配系數(shù)Kd，由，由Kd從標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量曲線上查出相應(yīng)的從標(biāo)準(zhǔn)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量曲線上查出相應(yīng)的lgMr，計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量。計(jì)算相對(duì)分子質(zhì)量。第九節(jié)第九節(jié) 親合色譜法親合色譜法親合色譜法是利用或模擬生物分子之間的專親合色譜法是利用或模擬生物分子之間的專一性作用，從復(fù)雜生物樣品中分離和分析特一性作用，從復(fù)雜生物樣品中分離和分析特殊物質(zhì)的一種色譜方法。殊物質(zhì)的一種色譜方法。親合色譜的概念可以理解為配位體以共價(jià)鍵親合色譜的概念可以理解為配

25、位體以共價(jià)鍵形式與不溶性載體連接作為色譜介質(zhì)，高選擇形式與不溶性載體連接作為色譜介質(zhì)，高選擇性地吸附分離具有生物活性的物質(zhì)，它將傳統(tǒng)性地吸附分離具有生物活性的物質(zhì)，它將傳統(tǒng)親合色譜的親合色譜的專一性專一性與與HPLC的的快速快速，穩(wěn)定穩(wěn)定，檢測(cè)檢測(cè)方便方便等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)。等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)。一、親合色譜分離機(jī)理一、親合色譜分離機(jī)理親合色譜是基于樣品中各種物質(zhì)與固定在載體親合色譜是基于樣品中各種物質(zhì)與固定在載體的配基之間的親合作用的差別而實(shí)現(xiàn)分離的。的配基之間的親合作用的差別而實(shí)現(xiàn)分離的。親合色譜的過(guò)程是待分離物質(zhì)與配基間的親合親合色譜的過(guò)程是待分離物質(zhì)與配基間的親合復(fù)合物形成及其解離的過(guò)程。復(fù)合物

26、形成及其解離的過(guò)程。載體載體LX配基配基待分離物質(zhì)待分離物質(zhì)通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相將結(jié)合在配基固定相的通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)相將結(jié)合在配基固定相的組分洗脫下來(lái)：組分洗脫下來(lái)：a) 如果親合復(fù)合物的親合力不強(qiáng)如果親合復(fù)合物的親合力不強(qiáng)b) 當(dāng)配基與被分離組分的親合力較強(qiáng)當(dāng)配基與被分離組分的親合力較強(qiáng)c) 非常緊密地結(jié)合在固定相配基上的物質(zhì)洗脫非常緊密地結(jié)合在固定相配基上的物質(zhì)洗脫配基與待分離物質(zhì)的親合作用的強(qiáng)弱可以用親合配基與待分離物質(zhì)的親合作用的強(qiáng)弱可以用親合復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來(lái)表示。這一常數(shù)不宜太低，復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)來(lái)表示。這一常數(shù)不宜太低，也不宜太高。太低專一性太差，太高則洗脫困難。也不宜太高。太

27、低專一性太差，太高則洗脫困難。R = LKR R：結(jié)合在親合色譜固定相上的生物分子的活力：結(jié)合在親合色譜固定相上的生物分子的活力K K：復(fù)合物的離解常數(shù)：復(fù)合物的離解常數(shù) L L：固定化配基的濃度：固定化配基的濃度二、親合色譜的固定相二、親合色譜的固定相親合色譜作為液相色譜的一個(gè)重要分支，對(duì)于生親合色譜作為液相色譜的一個(gè)重要分支，對(duì)于生物大分子的分離具有特殊的意義。原則上講，如物大分子的分離具有特殊的意義。原則上講，如果在固相載體上連接一種具有生物特異性的配基，果在固相載體上連接一種具有生物特異性的配基，就可以建立一種親合色譜方法，用于分離與配基就可以建立一種親合色譜方法，用于分離與配基相對(duì)應(yīng)

28、的物質(zhì)。相對(duì)應(yīng)的物質(zhì)。1 1、有機(jī)高分子類：多孔的硬質(zhì)凝膠、有機(jī)高分子類：多孔的硬質(zhì)凝膠交聯(lián)聚交聯(lián)聚苯乙烯，交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯，親水性高聚性苯乙烯，交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯，親水性高聚性等樹(shù)脂。等樹(shù)脂。優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)具有均勻的粒度、較大的孔徑、良好的剛性，具有均勻的粒度、較大的孔徑、良好的剛性，廣泛的廣泛的PH值的適應(yīng)性值的適應(yīng)性對(duì)于生物大分子樣品都有較好的相溶性。對(duì)于生物大分子樣品都有較好的相溶性。填料容易合成填料容易合成2、無(wú)機(jī)基質(zhì)、無(wú)機(jī)基質(zhì)多孔硅膠多孔硅膠可控孔徑玻璃可控孔徑玻璃3、高效親合色譜兼具親合色譜和高效液相色譜、高效親合色譜兼具親合色譜和高效液相色譜的特點(diǎn)的特點(diǎn)可以提高效率，還可以改善回收

29、產(chǎn)物純度和可以提高效率，還可以改善回收產(chǎn)物純度和濃度濃度檢測(cè)靈敏度得以大幅度提高檢測(cè)靈敏度得以大幅度提高具有更高的選擇性具有更高的選擇性配基結(jié)合的牢固性也可以延長(zhǎng)填料的壽命并配基結(jié)合的牢固性也可以延長(zhǎng)填料的壽命并提高產(chǎn)物的質(zhì)量，這對(duì)生物工程的分離、純化提高產(chǎn)物的質(zhì)量，這對(duì)生物工程的分離、純化工作是非常有利。工作是非常有利。三、親合色譜影響因素三、親合色譜影響因素1、平衡和平衡緩沖溶液、平衡和平衡緩沖溶液選擇平衡緩沖溶液所具有的選擇平衡緩沖溶液所具有的PH值值，離子強(qiáng)度離子強(qiáng)度，溫度溫度和和化學(xué)組成化學(xué)組成都應(yīng)使配體與蛋白質(zhì)之間能發(fā)都應(yīng)使配體與蛋白質(zhì)之間能發(fā)生比較強(qiáng)的相互作用。生比較強(qiáng)的相互作用。2、蛋白質(zhì)的濃度和溫度效應(yīng)、蛋白質(zhì)的濃度和溫度效應(yīng)對(duì)親合力一般或較高的蛋白質(zhì)，其互補(bǔ)酶的濃對(duì)親合力一般或較高的蛋白質(zhì)，其互