基因工程的基本操作程序上課用

1、 基因工程的基本操作程序及基因工程的基本操作程序及基基因工程的應用因工程的應用 目的基因的獲取目的基因的獲取 基因表達載體的構建（基因表達載體的構建（核心核心） 將目的基因導入受體細胞將目的基因導入受體細胞 目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定 P8基因工程基本操作的四個步驟基因工程基本操作的四個步驟一、目的基因的獲取一、目的基因的獲取( (一一) )、目的基因、目的基因主要主要是是_編碼蛋白質的基因編碼蛋白質的基因（二）、獲取目的基因的常用方法（二）、獲取目的基因的常用方法從基因文庫中獲取從基因文庫中獲取利用利用PCRPCR技術擴增技術擴增人工合成人工合成未知未知已知已知P81)1)基因

2、文庫？基因文庫？P91. 1. 從基因文庫中獲取目的基因從基因文庫中獲取目的基因將含有將含有某種生物某種生物不同基因的許多不同基因的許多DNADNA片斷，片斷，導入到導入到受體菌受體菌的群體中，各個受體菌分別含的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫有這種生物的不同基因，稱為基因文庫2)2)基因文庫的種類基因文庫的種類: :種種類類基因組基因組DNA文庫：文庫：含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因部分基因文庫：部分基因文庫：只包含了一種生物的只包含了一種生物的部分部分基因，基因， 如：如：cDNA文庫文庫cDNA文庫的構建文庫的構建-反轉錄法：反轉錄法： 以目的基因

3、轉錄成的信使以目的基因轉錄成的信使RNARNA為模板，反轉錄成為模板，反轉錄成互補的單鏈互補的單鏈DNADNA，然后在酶的作用下合成雙鏈，然后在酶的作用下合成雙鏈DNADNA，從而獲得所需的基因。從而獲得所需的基因。 雜交雙鏈雜交雙鏈( (單鏈單鏈RNA/RNA/單鏈單鏈DNA)DNA)單鏈單鏈DNA雙鏈雙鏈DNA(cDNA)目的基因的目的基因的mRNA某種酶某種酶DNADNA聚合酶聚合酶反轉錄酶反轉錄酶3)3)目的基因獲取的依據(jù)目的基因獲取的依據(jù): : P9P9基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的基因的 、 、基因的基因的 、基因的基因的 。基因在染色體上的位置基因在染色體上的位置轉錄產物

4、轉錄產物mRNAmRNA翻譯產物蛋白質翻譯產物蛋白質功能功能概念：概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項在生物，是一項在生物_復制復制_的核酸合成技術。的核酸合成技術。P10第一段第一段 多聚酶鏈式反應多聚酶鏈式反應體外體外特特定定DNA片片段段2.2.利用利用PCR技術技術擴擴增目的基因增目的基因過程過程:前提條件前提條件:有一段已知目的基因的有一段已知目的基因的 序列，序列，以使根據(jù)這一序列合成以使根據(jù)這一序列合成 。P10第二段第二段核苷酸序列核苷酸序列引物引物1. 變性變性（95）雙鏈雙鏈DNA模板在熱作用模板在熱作用下，下，_斷裂，形斷裂，形成成_氫鍵氫鍵單鏈單鏈DNA2.復性復性

5、 (55)溫度降溫度降低，低， 與與DNA模模板結合，形成局部板結合，形成局部_。 雙鏈雙鏈引物引物3.延伸延伸（72）在在 的作用下，的作用下，從引物的從引物的 連連接接 ，合，合 成與模板互補的成與模板互補的DNA鏈。鏈。 3端端脫氧核苷酸脫氧核苷酸Taq酶酶動態(tài)演示具體過程動態(tài)演示具體過程擴增擴增形式及結果：形式及結果：P11P11上上指數(shù)擴增，數(shù)量約為指數(shù)擴增，數(shù)量約為 。 （n n代表代表 ）2 2n n擴增循環(huán)的次數(shù)擴增循環(huán)的次數(shù)PCR技術擴增與技術擴增與DNA復制的比較復制的比較PCR技術技術DNA復制復制相相同同點點原理原理原料原料條件條件不不同同點點解旋解旋方式方式場所場所酶

6、酶結果結果堿基互補配對四種脫氧核苷酸模板、能量、酶高溫下變性解旋高溫下變性解旋解旋酶催化解旋酶催化體外復制體外復制(PCR擴增儀內擴增儀內)主要在細胞核內主要在細胞核內熱穩(wěn)定的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶聚合酶（Taq酶）酶）大量的大量的DNA片段片段形成整個形成整個DNA分子分子解旋酶、解旋酶、普通的普通的DNA聚合酶等聚合酶等3.3.人工合成人工合成（無）（無）1)1)反轉錄法：反轉錄法： 雜交雙鏈雜交雙鏈( (單鏈單鏈RNA/RNA/單鏈單鏈DNA)DNA)單鏈單鏈DNADNA雙鏈雙鏈DNADNA( (cDNAcDNA) )目的基因目的基因的的mRNAmRNA某種酶某種酶DNADNA聚合酶聚合酶

7、反轉錄酶反轉錄酶2)根據(jù)已知的氨基酸序列合成根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法法 ：蛋白質的氨基酸序列蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列的核苷酸序列基因的脫氧核苷酸序列基因的脫氧核苷酸序列推測推測推測推測目的基因目的基因化學合成化學合成1. 1.嘗試用一句通俗的語言來嘗試用一句通俗的語言來描述基因文庫？描述基因文庫？ 把生物的全部或部分基因切割分離開，把生物的全部或部分基因切割分離開，逐個分別保存在細菌細胞中，這樣的細胞逐個分別保存在細菌細胞中，這樣的細胞群體即為基因文庫。群體即為基因文庫。 當不知當不知DNADNA堿基序列時，或只知道目的堿基序列時，或只知道目的基因序列的一段，或要得到這種

8、生物的全部基因序列的一段，或要得到這種生物的全部基因，或是想從某種生物中獲得多個基因，基因，或是想從某種生物中獲得多個基因，或是想了解某種生物在不同發(fā)育階段表達的或是想了解某種生物在不同發(fā)育階段表達的基因有什么不同，就要構建基因文庫；基因有什么不同，就要構建基因文庫； 不行。一是限制酶進入生物體可能會失不行。一是限制酶進入生物體可能會失活，二是限制酶可能會影響正常生命，三是活，二是限制酶可能會影響正常生命，三是不知道目的基因在哪里，四是不容易操作。不知道目的基因在哪里，四是不容易操作。 2. 2.為什么要構建基因文庫？直接從含為什么要構建基因文庫？直接從含目的基因的生物體內提取不行嗎？目的基因

9、的生物體內提取不行嗎？3.cDNA反轉錄反轉錄DNA，為什么，為什么不能包括全部基因不能包括全部基因 生物的不同發(fā)育階段，基因并不是都生物的不同發(fā)育階段，基因并不是都能表達，而是能表達，而是選擇性表達選擇性表達，即只表達部分，即只表達部分基因，所以只能得到部分基因的基因，所以只能得到部分基因的mRNA，只能反轉錄成部分基因。只能反轉錄成部分基因。 4. 4.用圖解用圖解( (文字和箭頭文字和箭頭) )表示表示PCRPCR過程。過程。 模板模板DNA(目的基因目的基因) 2個個DNA單鏈單鏈 2個子代個子代DNA(目的基因目的基因) 單鏈與引物互補結合單鏈與引物互補結合9095變性解鏈變性解鏈5

10、560 復性復性 加引物加引物70707575加熱穩(wěn)定加熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶二、基因表達載體的構建（二、基因表達載體的構建（核心核心）使目的基因在受體細胞中使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在穩(wěn)定存在，并且可以，并且可以遺傳遺傳給下一代給下一代使目的基因能夠使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用表達和發(fā)揮作用1 1、基因、基因表達載體表達載體構建的目的構建的目的？（P11中）中）2 2、基因表達載體的組成、基因表達載體的組成啟動子啟動子目的基因目的基因終止子終止子標記基因標記基因位于基因的首端位于基因的首端,它它是是mRNA聚合酶識別聚合酶識別和結合的部位，驅動和結合的部位，驅動基因轉錄?；蜣D錄。

11、位于基因的末端位于基因的末端, ,終終止轉錄。止轉錄。鑒別受體細胞中是否含有目的基因鑒別受體細胞中是否含有目的基因1. 1.構建基因表達載體需要哪些工具？構建基因表達載體需要哪些工具？ 限制酶、限制酶、DNADNA連接酶、運載體。（其連接酶、運載體。（其中有兩種工具酶）中有兩種工具酶）2. 2.為什么要構建基因表達載體？為為什么要構建基因表達載體？為什么不能將目的基因直接導入受體什么不能將目的基因直接導入受體細胞？細胞？ 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并 且可以遺傳給下一代。且可以遺傳給下一代。 使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。

12、目的基因一定是經(jīng)過限制酶切割過的基目的基因一定是經(jīng)過限制酶切割過的基因，那么其結構已經(jīng)不完整，缺少啟動子因，那么其結構已經(jīng)不完整，缺少啟動子等調控序列，不可能在受體細胞中表達和等調控序列，不可能在受體細胞中表達和發(fā)揮作用，會作為異物被分解或派出。發(fā)揮作用，會作為異物被分解或派出。 3. 3.作為基因工程表達載體，只需含有目作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？為什么？的基因就可以完成任務嗎？為什么？ 不可以。因為目的基因在表達載體中不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。元件，

13、如啟動子、終止子和標記基因等。 4. 4.兩種不同生物的兩種不同生物的DNADNA能拼接的遺傳學能拼接的遺傳學理論基礎是什么？理論基礎是什么？ 都以都以DNA為遺傳物質；為遺傳物質； 都有四種脫氧核苷酸；都有四種脫氧核苷酸； 都具有規(guī)則的雙螺旋結構；都具有規(guī)則的雙螺旋結構； 都遵循堿基互補配對原則；都遵循堿基互補配對原則； 共用一套密碼子。共用一套密碼子。 三三. .將目的基因導入將目的基因導入受體細胞受體細胞（一）轉化：（一）轉化： （二）方法（二）方法將目的基因導入將目的基因導入植物細胞植物細胞將目的基因導入將目的基因導入動物細胞動物細胞將目的基因導入將目的基因導入微生物細胞微生物細胞農桿

14、菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注射法顯微注射法Ca2+處理法處理法 （感受態(tài)細胞）（感受態(tài)細胞）_進入受體細胞內，并且在進入受體細胞內，并且在 受體細胞內維持受體細胞內維持_和和_的過程的過程目的基因目的基因穩(wěn)定穩(wěn)定表達表達1、將目的基因導入植物細胞將目的基因導入植物細胞(1)(1)農桿菌轉農桿菌轉化法化法特點特點:能感染能感染雙子葉植物雙子葉植物和和祼子植物祼子植物, ,對對單子葉植物無感染能力單子葉植物無感染能力Ti質粒質粒的的TDNA可轉移至受體細可轉移至受體細胞并胞并整合整合到其到其染色體染色體上上轉化過程轉化過程:Ti質粒質粒目的基因目的基因構建構建

15、表表達達載載體體導入導入植植物物細細胞胞插入插入 植物細胞染植物細胞染色體色體DNA表達表達新新性性狀狀轉入轉入農農桿桿菌菌（2 2）基因槍法）基因槍法 基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNADNA打入受體細胞中，使打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。目的基因與其整合并表達的方法。（3 3）花粉通道法）花粉通道法 植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還

16、未囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNADNA（含目的基因），使目的（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。基因借助花粉管通道進入受體細胞。 顯微注射技術（最常用，最有效）顯微注射技術（最常用，最有效）2.2.將目的基因導入動物細胞將目的基因導入動物細胞方法方法受體細胞受體細胞 常用受精卵常用受精卵目的基因的表達載體提純目的基因的表達載體提純取卵（受精卵）取卵（受精卵）顯微注射顯微注射受精卵發(fā)育受精卵發(fā)育新性狀動物新性狀動物過程：過程：3.3.將目的基因導入微生物細胞將目的基因導入微生物細胞過程：過程：

17、Ca2+處理受體細胞處理受體細胞感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞重組表達載體與感受態(tài)細胞混合重組表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收感受態(tài)細胞吸收DNA分子分子思考：早期的基因工程用什么做受體細胞？為什么？思考：早期的基因工程用什么做受體細胞？為什么？常用原核生物，因為原核生物常用原核生物，因為原核生物繁殖快繁殖快、多為、多為單細胞單細胞、遺遺傳物質傳物質相對較少等。相對較少等。方法方法CaCa2+2+處理法處理法用用CaCa2 2處理，處理，增加細菌細增加細菌細胞壁的通透胞壁的通透性性思考：思考：為什么為什么要用要用Ca2+處理處理受體細胞？受體細胞？受體生物受體生物 植物植物 動物動物 微生物微生物

18、受體細胞受體細胞導入方法導入方法受精卵受精卵體細胞體細胞受精卵受精卵細胞細胞/ /個體個體農桿菌轉化法農桿菌轉化法基因槍法基因槍法花粉管通道法花粉管通道法顯微注顯微注射技術射技術用用CaCa2+2+處理成處理成感受態(tài)細胞感受態(tài)細胞1. 1.為什么要有為什么要有“目的基因導入受體細胞目的基因導入受體細胞”這一步？將目的基因導入受體細胞的原理？這一步？將目的基因導入受體細胞的原理？ 含有目的基因的表達載體只有進含有目的基因的表達載體只有進入受體細胞，并且維持穩(wěn)定和表達，入受體細胞，并且維持穩(wěn)定和表達，才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉化。原理是：借鑒病毒生物中的

19、轉化。原理是：借鑒病毒或細菌侵染細胞的途徑?；蚣毦秩炯毎耐緩?。4. 4.顯微注射技術的基本操作程序是？顯微注射技術的基本操作程序是？ 首先將含有目的基因的表達載體提純，首先將含有目的基因的表達載體提純，并使并使DNA濃度保持在濃度保持在1-3g/ml,然后，雌性然后，雌性動物體內取出卵（卵可以在體內受精，也可動物體內取出卵（卵可以在體內受精，也可以在體外受精），采用顯微注射儀進行顯微以在體外受精），采用顯微注射儀進行顯微注射，再將注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚注射，再將注射了目的基因的受精卵，經(jīng)胚胎早期培養(yǎng)一段時間后，使其發(fā)育成為具有胎早期培養(yǎng)一段時間后，使其發(fā)育成為具有新性狀的動物。新性狀

20、的動物。 P13檢測轉基因生物染色體的檢測轉基因生物染色體的DNA上是上是否插入了目的基因否插入了目的基因1 1、導入檢測、導入檢測目的：目的：方法：方法：DNA分子雜交技術分子雜交技術四四. .目的基因的檢測與鑒定目的基因的檢測與鑒定從轉基因生物中提取的基因組從轉基因生物中提取的基因組DNADNA探針？探針？雜交的對象？雜交的對象？用放射性同位素標記的用放射性同位素標記的含目的基因的含目的基因的DNADNA片段片段過過程程.首先取出首先取出轉基因生物的基因組轉基因生物的基因組DNA.用含目的基因的用含目的基因的DNA片段用片段用放射性同位素等作標記放射性同位素等作標記, 以此做以此做探針探針

21、。使探針和轉基因生物的基因組雜交使探針和轉基因生物的基因組雜交,若顯示出若顯示出雜交帶雜交帶, 表明目的基因已插入染色體表明目的基因已插入染色體DNA中中1 1、導入檢測、導入檢測DNADNA分子雜交示意圖分子雜交示意圖 采用一定的技術手段，將兩種生物的采用一定的技術手段，將兩種生物的DNADNA分分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。 2 2、轉錄檢測、轉錄檢測目的：目的：檢測目的基因是否轉錄出了檢測目的基因是否轉錄出了mRNA