Q10第十章聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)20161013

1、第十章第十章 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)Chapter 10 Technology of Chapter 10 Technology of Polymerase Chain Reaction, (PCR)Polymerase Chain Reaction, (PCR)內(nèi)容PCR的概念及技術(shù)的創(chuàng)建PCR的基本原理及特點(diǎn)PCR的反應(yīng)體系和條件優(yōu)化PCR產(chǎn)物分析PCR常用技術(shù)和應(yīng)用Kary B Mullis (1944-)l 1983 年年發(fā)明了發(fā)明了PCRPCR技術(shù)技術(shù)l 19931993年度獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)年度獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)DNA的體內(nèi)復(fù)制：的體內(nèi)復(fù)制：原料：原料： template DNA（geno

2、mic DNA ），），RNA primer，dNTPs酶：酶： 解旋酶，引物酶，解旋酶，引物酶， DNA聚合酶，聚合酶，連接酶連接酶反應(yīng)條件：反應(yīng)條件：胞液環(huán)境，胞液環(huán)境，37 反應(yīng)過(guò)程：反應(yīng)過(guò)程： 起始（模板起始（模板DNA解鏈、形成引發(fā)體）、解鏈、形成引發(fā)體）、延長(zhǎng)、終止延長(zhǎng)、終止（三階段）（三階段）產(chǎn)物：產(chǎn)物：模板模板DNA （基因組基因組DNA）拷貝數(shù)增加拷貝數(shù)增加一倍一倍PCR：template DNA（genomic DNA ，cDNA）, a pair of specific oligonucleotide primer，dNTPsDNA polymerasebuffer，三種

3、，三種變化的溫度變化的溫度（94，50-70，72 ），），cycles（25-35）denaturation、 annealing 、extension （三階段，（三階段，多循環(huán)多循環(huán)）目的目的DNA（特異性）（特異性）拷貝數(shù)增加拷貝數(shù)增加 倍倍PCRPCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理屬于無(wú)細(xì)胞的分子克隆，屬于無(wú)細(xì)胞的分子克隆，在微量離心管中在微量離心管中, ,加入適量的加入適量的緩沖液緩沖液, , 微量的微量的模板模板DNA,DNA,四種脫氧單核苷酸四種脫氧單核苷酸, ,耐熱性多聚耐熱性多聚酶酶, , 一對(duì)合成一對(duì)合成DNADNA的的引物引物, ,通過(guò)高溫通過(guò)高溫變性變性、低溫、低溫退火

4、退火和中溫和中溫延伸延伸三個(gè)階段為一三個(gè)階段為一個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán), ,每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一每一次循環(huán)使特異區(qū)段的基因拷貝數(shù)放大一倍倍, ,一般樣品是經(jīng)過(guò)一般樣品是經(jīng)過(guò)3030次循環(huán)次循環(huán), ,最終使基因放大了數(shù)最終使基因放大了數(shù)百萬(wàn)倍百萬(wàn)倍; ; 擴(kuò)增了特異區(qū)段的擴(kuò)增了特異區(qū)段的DNADNA帶。帶。 Denaturing95CAnnealingTm-5CExtension72CPCR的原理的原理PCR的過(guò)程的過(guò)程（1）第一步）第一步 變性（變性（denature）94-95 oC下下5分鐘，模板分鐘，模板DNA雙鏈雙鏈完全變性成單鏈。完全變性成單鏈。（2）第二步）第二步 復(fù)性（復(fù)

5、性（anneal）50-60 oC下下1分鐘，引物與模板復(fù)性。分鐘，引物與模板復(fù)性。 引物的濃度高，引物的濃度高， 引物的鏈短。引物的鏈短。94 oC下下1分鐘，新合成的分鐘，新合成的DNA雙雙鏈又變性成單鏈模板。鏈又變性成單鏈模板。（4）第四步）第四步 變性（變性（denature）72 oC下下1-2分鐘，分鐘，Taq DNA聚合酶聚合酶在引物的在引物的3端上加上核苷酸。端上加上核苷酸。（3）第三步）第三步 延伸（延伸（extend）（5）第五步）第五步 重復(fù)（重復(fù)（repeat）PCR反應(yīng)條件反應(yīng)條件變性變性 95 5min變性變性 95 1min退火退火 55 1min延伸延伸 72

6、1min延伸延伸72 1min35 cycles變性變性95 延伸延伸72 退火退火Tm-5PCRPCR PrinciplePrincipletemplate denaturatationPrimer annealingPrimer extensionPCR反應(yīng)的特點(diǎn)反應(yīng)的特點(diǎn) 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng) 引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性引物與模板結(jié)合的特異性及聚合酶的忠實(shí)性 靈敏度高靈敏度高 指數(shù)增長(zhǎng)指數(shù)增長(zhǎng)，從從pg (10pg (10-12-12) )可擴(kuò)增至可擴(kuò)增至 mg (10mg (10-6-6) )水平水平 簡(jiǎn)便、快速簡(jiǎn)便、快速 2 24 4 小時(shí)完成擴(kuò)增小時(shí)完成擴(kuò)增 對(duì)標(biāo)本的純度要

7、求低對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定不需要純化，甚至可以直接用細(xì)菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板?；虬竦慕M織切片也可以直接用于作模板。PCR儀儀PCR反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系 10擴(kuò)增緩沖液擴(kuò)增緩沖液 10ul 4種種dNTP混合物混合物 各各200umol/L 引物引物 10100pmol 模板模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul自從自從H.A. Erilish分離出耐高溫的分離出耐高溫的Taq DNA聚合聚合酶，代替大腸桿菌酶，代替大

8、腸桿菌DNA聚合酶聚合酶Klenow片斷片斷（37 oC )，PCR技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。技術(shù)才進(jìn)入實(shí)用階段。（1）Taq DNA聚合酶聚合酶 PCR體系組成體系組成Taq DNA聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高聚合酶的最大特點(diǎn)是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合溫，非常適合PCR過(guò)程的反復(fù)高溫變性要求。過(guò)程的反復(fù)高溫變性要求。 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性最適溫度：最適溫度： 72-78 oC 延伸速度：延伸速度： 約約1000nt/min酶分子酶分子 最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度：最長(zhǎng)延伸長(zhǎng)度：6.7kb 最適溫度高最適溫度高 Taq酶的功能與缺點(diǎn)酶的功能與缺點(diǎn)具有具有53聚合酶活性和聚合酶活性和53外切酶活外切酶活性，但沒(méi)有

9、性，但沒(méi)有3 5外切酶活性。外切酶活性。 合成超過(guò)合成超過(guò)600bp長(zhǎng)度的長(zhǎng)度的DNA就有可能出現(xiàn)就有可能出現(xiàn)錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。錯(cuò)配，用于克隆基因時(shí)必須測(cè)序。金屬離子敏感（尤其是金屬離子敏感（尤其是Mg2+ ）。）。 當(dāng)當(dāng)dNTP（能結(jié)合（能結(jié)合Mg2+）的濃度為）的濃度為0.7-0.8mmol/L時(shí)，時(shí)，MgCl2的最佳濃度應(yīng)是的最佳濃度應(yīng)是2.0mmol/L。 Taq DNA聚合酶的激活劑聚合酶的激活劑 50mmol/L KCl也能激活也能激活Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。與待擴(kuò)增的模板與待擴(kuò)增的模板DNA區(qū)段的兩區(qū)段的兩3端端序列互補(bǔ)（序列互補(bǔ)（ 5端相同）的短端

10、相同）的短DNA。（2）引物（）引物（primer) 位置位置3 3 即即2.75 1011 bp的基因組中有一次的基因組中有一次完全與完全與19個(gè)核苷酸的序列相同的個(gè)核苷酸的序列相同的機(jī)會(huì)（或機(jī)會(huì)是約機(jī)會(huì)（或機(jī)會(huì)是約210- -11）。）。引物的長(zhǎng)度引物的長(zhǎng)度理論計(jì)算：理論計(jì)算：419=2.75 1011。一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)一般引物設(shè)計(jì)為長(zhǎng)15-30bp。引物的堿基序列引物的堿基序列 5端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)端根據(jù)需要可設(shè)計(jì)成某個(gè)內(nèi)切酶的切點(diǎn)順序、順序、RNA聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或聚合酶識(shí)別序列、突變位點(diǎn)或生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。生物素標(biāo)記等，方便與以后操作。5ATGCA

11、GAAACTGATCGATCGATCGAT3 3GCTAGCTACTTAAG5 3端必須與模板正確配對(duì)，端必須與模板正確配對(duì)，5端可以不配對(duì)。端可以不配對(duì)。templateprimer盡可能提高盡可能提高G+C含量，以提高引物含量，以提高引物與模板的結(jié)合力與模板的結(jié)合力引物的堿基組成引物的堿基組成避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列避免連續(xù)相同堿基排列或內(nèi)部回文序列. 5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3 CTGCCAGTCTAC3 GACGG5 T發(fā)卡結(jié)構(gòu)發(fā)卡結(jié)構(gòu)1）2）3）避免形成引物二聚體（避免形成引物二聚體（dimer）兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上的兩個(gè)引物之間不能有兩個(gè)以上的連續(xù)堿基

12、序列互補(bǔ)。連續(xù)堿基序列互補(bǔ)。5GGTCTGCCAGTCTAC3 3CAGGACTTAGTCACT5 primer1primer2Upstream primer vs Downstream primerSense primer vs Antisense primerPrimer1 vs Primer2Forward primer vs Reverse primer引物的引物的Tm值值Tm=（G+C) 4 + (A+T) 2當(dāng)引物中的（當(dāng)引物中的（G+C）含量低于）含量低于50%時(shí)，復(fù)性溫度低于時(shí)，復(fù)性溫度低于55 oC。適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)適當(dāng)提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的

13、特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。實(shí)際復(fù)性溫度選擇實(shí)際復(fù)性溫度選擇低于低于Tm值值5 oC。手工計(jì)算：手工計(jì)算：一般估計(jì)：一般估計(jì)：引物的濃度引物的濃度一般使用終濃度各一般使用終濃度各0.2 mol/L。簡(jiǎn)并引物簡(jiǎn)并引物如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸氨基酸序列反推序列反推出來(lái)的，就必須考慮密碼的簡(jiǎn)并性。出來(lái)的，就必須考慮密碼的簡(jiǎn)并性。 需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個(gè)或需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個(gè)或幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱簡(jiǎn)并引物。幾個(gè)堿基差異。這樣的混合引物稱簡(jiǎn)并引物。設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位

14、于前一組設(shè)計(jì)多組引物，結(jié)合位點(diǎn)依次位于前一組引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物之間。增加擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用專業(yè)軟件引物設(shè)計(jì)現(xiàn)在多用專業(yè)軟件 套嵌引物（套嵌引物（nested primers)1324如如Primer6.0等等dNTP呈顆粒狀， 保存不當(dāng)易變性分解dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)小量分裝，-20冰凍保存，多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50200umol/L，濃度過(guò)低會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性（3） dNTP（4）模模板板DNA但不能有蛋白質(zhì)變性劑、但不能有蛋白質(zhì)變性劑、DNA

15、酶、酶、Mg2+的的螯合劑等影響螯合劑等影響DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 模板的量：模板的量： 不能太多，不能太多，100 l反應(yīng)體系中反應(yīng)體系中100ng足夠。足夠。 純度：純度：PCR對(duì)模板對(duì)模板DNA的純度要求不高。的純度要求不高。（5） PCRPCR反應(yīng)條件優(yōu)化反應(yīng)條件優(yōu)化 反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)溫度（變性、退火、延伸）反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）反應(yīng)時(shí)間（變性、退火、延伸）循環(huán)次數(shù)（循環(huán)次數(shù)（PCRPCR效率及產(chǎn)物量）效率及產(chǎn)物量）1 1、溫度、溫度 變性溫度：變性溫度：9494- -97 97 退火溫度：低于引物退火溫度：低于引物TmTm 5 5 左右，一般左右，一

16、般55-60 溫度過(guò)高：降低擴(kuò)增效率；溫度過(guò)高：降低擴(kuò)增效率； 溫度過(guò)低：增加非特異性擴(kuò)增溫度過(guò)低：增加非特異性擴(kuò)增延伸溫度：延伸溫度：72 72 ，此時(shí)，此時(shí)TaqTaq酶具有較高的酶促活性酶具有較高的酶促活性2 2、時(shí)間、時(shí)間 第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（第一次變性應(yīng)給予足夠時(shí)間（5 5- -7 7分鐘）分鐘） 每一個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，一般為每一個(gè)步驟所需時(shí)間取決于擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度，一般為復(fù)性時(shí)間：復(fù)性時(shí)間：303060sec60sec 延伸時(shí)間：延伸時(shí)間：1Kb1Kb以內(nèi)的以內(nèi)的DNADNA片段，延伸時(shí)間片段，延伸時(shí)間1min1min 3-4Kb 3-4Kb的的DNADNA片

17、段，延伸時(shí)間片段，延伸時(shí)間3-4min3-4min 10Kb 10Kb的的DNADNA片段，延伸時(shí)間片段，延伸時(shí)間15min15min3 3、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù) 重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為重復(fù)次數(shù)一般設(shè)為25253535個(gè)循環(huán)個(gè)循環(huán) 擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)：擴(kuò)增反應(yīng)的平臺(tái)效應(yīng)： 理論上，理論上，PCRPCR反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)反應(yīng)產(chǎn)物呈指數(shù)性增長(zhǎng)，但這種增長(zhǎng)形式在擴(kuò)增形式在擴(kuò)增25-2525-25個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到個(gè)循環(huán)以后便放慢直至停止，達(dá)到反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而反應(yīng)平臺(tái)，此時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物量不再隨循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長(zhǎng)呈指數(shù)增長(zhǎng)PCR反應(yīng)曲線PCR 產(chǎn)物分析

18、產(chǎn)物分析Analysis of PCR productsGel analysis (瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳/聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 ) : PCR 產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物電泳，EB（溴乙錠）染色，（溴乙錠）染色， 紫外儀下觀察，紫外儀下觀察，初步判斷產(chǎn)物的特異性。初步判斷產(chǎn)物的特異性。Restriction-endonuclease digestion analysis：酶切、電泳分離。酶切、電泳分離。產(chǎn)物的鑒定，基因分型，研究變異性。產(chǎn)物的鑒定，基因分型，研究變異性。Hybridization ： (Southern blot/dot blot )Sequence analysi

19、s：是檢測(cè)是檢測(cè)PCR產(chǎn)物特異性的產(chǎn)物特異性的 最可靠方法。最可靠方法。常用常用PCR技術(shù)技術(shù)原位原位PCR (in situ PCR)多重多重PCR（multiplex PCR）長(zhǎng)距離長(zhǎng)距離PCR (Long-range PCR)逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）熒光定量熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）巢式巢式PCR（nesting PCR）-4條引物條引物 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In situIn situ PCR PCR）是由）是由HaaseHaase等于等于19901990年

20、首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作年首創(chuàng)。它是利用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段, ,在不破壞細(xì)胞的前提下在不破壞細(xì)胞的前提下, ,利用一些特定的檢測(cè)手利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增?？蛇M(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列 12341234RT-PCRRT-PCR（reverse transcription-PCR）T

21、emin,H.發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶，發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶， 1975諾貝爾獎(jiǎng)諾貝爾獎(jiǎng)技術(shù)關(guān)鍵：技術(shù)關(guān)鍵：利用利用逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶，把，把mRNAmRNA反轉(zhuǎn)錄成反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以再以cDNA為模板進(jìn)行為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增。RNA template3 5 下游引物下游引物cDNA first strand3 5 上游引物上游引物cDNA first strandcDNA second strand3 5 3 5 反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄酶Taq酶酶PCRReverse transcription (RT)下游引物下游引物上游引物上游引物Taq酶酶PCR-RFLP(Restriction Fragment Len

22、gth Polymorphism，RFLP)限制性限制性 片段長(zhǎng)度多態(tài)性片段長(zhǎng)度多態(tài)性 1. 分析已知突變分析已知突變 。 2. 突變堿基涉及酶切位點(diǎn)的變化。突變堿基涉及酶切位點(diǎn)的變化。 PCR- 酶切酶切- 電泳電泳PCR-RFLP5 CCACGG 33 GGTGCC 5*5 CCATGG 33 GGTACC 5*Resistance to NcoI DigestionSusceptible to NcoI DigestionHomozygous Homozygous MutantMutantHomozygous Homozygous Wild-typeWild-typeHeterozygo

23、teHeterozygoteDirection of ElectrophoresisPCR-RFLPSSCPPCRPCRATCGWildWildAmplify region of interestedDenature samples in Formamide or HeatATCGMutantMutantDenature samples in Formamide and HeatATCGATCGDNA molecules conformation depends on their sequenceRun on a Non-denaturing gel and look for mobility

24、 differencesWildWildMutanMutantSSCP點(diǎn)突變點(diǎn)突變 位于酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變：位于酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變：限制性酶切片段分析法限制性酶切片段分析法 不在酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變：不在酶切位點(diǎn)上的點(diǎn)突變：?jiǎn)捂湗?gòu)象多態(tài)性分析法單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析法(PCR-SSCP) 致病基因上的未知點(diǎn)突變：致病基因上的未知點(diǎn)突變： PCR-SSCP （單核苷酸多態(tài)性，（單核苷酸多態(tài)性，SNP）實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR)常規(guī)定量PCR技術(shù)： 對(duì)PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行定量 重復(fù)性差 半定量實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)： 對(duì)PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)的產(chǎn)物進(jìn)行 定量 實(shí)

25、時(shí)熒光定量PCR原理l在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。Ct 值是熒光定量PCR技術(shù)的一個(gè)很重要的概念 C代表Cycle，t代表threshold(熒光域值)。含義是：每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。 熒光化學(xué) 熒光定量熒光定量PCRPCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：所使用的熒光化學(xué)可分為兩種： 熒光探針熒光探針 熒光染料熒光染料TaqMan熒光探針l與目標(biāo)序列互補(bǔ)的與目標(biāo)序列互補(bǔ)的寡核苷酸探針寡核苷酸探針l兩端分別標(biāo)記一個(gè)兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)報(bào)告熒光基團(tuán)( (熒光素?zé)晒馑? )和一個(gè)和一個(gè)淬滅熒光淬滅熒光基團(tuán)基團(tuán)( (淬滅劑淬滅劑) )。l探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；lPCRPCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增時(shí)，TaqTaq酶的酶的5 53 3外切酶外切酶活性將探針酶切降解，活