分子克隆技術(shù)--精品課程

1、分子克隆技術(shù)分子克隆技術(shù)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)院華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)院李香花：李香花： 8728204487282044吳昌銀：吳昌銀： 8728188787281887實驗簡介實驗簡介分子克隆是指分子克隆是指DNADNA的無性繁殖技術(shù)。本課程主的無性繁殖技術(shù)。本課程主要是針對生物技術(shù)、生物科學(xué)專業(yè)本科生及分子要是針對生物技術(shù)、生物科學(xué)專業(yè)本科生及分子生物學(xué)專業(yè)研究生而開設(shè)的以實驗為主的必修課，生物學(xué)專業(yè)研究生而開設(shè)的以實驗為主的必修課，共共6060學(xué)時。內(nèi)容涉及分子克隆的一些基本方法及學(xué)時。內(nèi)容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧。實驗包括：分子克隆、分子雜交基本操作技巧。實驗包括

2、：分子克隆、分子雜交和表達(dá)分析和表達(dá)分析分子克隆技術(shù)分子克隆技術(shù)：利用質(zhì)粒載體克隆外源：利用質(zhì)粒載體克隆外源DNADNA片段，片段，通過這個實驗大家可以掌握質(zhì)粒載體的抽提、外源通過這個實驗大家可以掌握質(zhì)粒載體的抽提、外源DNADNA的準(zhǔn)備、酶切、連接及感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接的準(zhǔn)備、酶切、連接及感受態(tài)細(xì)胞的制備、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及陽性克隆子的鑒定和驗證等產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化以及陽性克隆子的鑒定和驗證等 分子雜交技術(shù)分子雜交技術(shù)：主要通過做：主要通過做SouthernSouthern雜交，掌雜交，掌握植物總握植物總DNADNA的抽提、質(zhì)量檢測、限制性內(nèi)切酶操作、的抽提、質(zhì)量檢測、限制性內(nèi)切酶操作、DNADN

3、A的瓊脂糖凝膠電泳、的瓊脂糖凝膠電泳、Southern Southern 轉(zhuǎn)移、探針的制備、轉(zhuǎn)移、探針的制備、同位素操作等方面的操作技術(shù)同位素操作等方面的操作技術(shù) 表達(dá)分析表達(dá)分析: : 通過做通過做RT-PCRRT-PCR掌握掌握RNARNA的抽提，質(zhì)量的抽提，質(zhì)量檢測及檢測及RT-PCRRT-PCR的操作的操作實驗注意事項實驗注意事項v 在整個實驗過程中都應(yīng)嚴(yán)格遵守實驗室的規(guī)章制在整個實驗過程中都應(yīng)嚴(yán)格遵守實驗室的規(guī)章制度，不準(zhǔn)違規(guī)操作儀器。損壞物品的賠償制度度，不準(zhǔn)違規(guī)操作儀器。損壞物品的賠償制度 v 離心機(jī)離心機(jī) ：平衡、離心管配套、轉(zhuǎn)速：平衡、離心管配套、轉(zhuǎn)速v 移液器：不能超量程使

4、用、不能倒置、小心摔壞移液器：不能超量程使用、不能倒置、小心摔壞v 化學(xué)藥品：腐蝕性、誘變劑、放射性物質(zhì)化學(xué)藥品：腐蝕性、誘變劑、放射性物質(zhì)v 實驗過程中和實驗完畢注意水、火、電實驗過程中和實驗完畢注意水、火、電v 保持實驗室安靜、清潔保持實驗室安靜、清潔v 實驗考核：平時成績實驗報告考試成績實驗考核：平時成績實驗報告考試成績用質(zhì)粒載體克隆水稻用質(zhì)粒載體克隆水稻DNADNA片段片段第一部分：分子克隆技術(shù)第一部分：分子克隆技術(shù)實驗內(nèi)容實驗內(nèi)容 質(zhì)粒載體的抽提質(zhì)粒載體的抽提 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 限制性內(nèi)切酶消化：外源片段、載體限制性內(nèi)切酶消化：外源片段、載體 感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)細(xì)胞的

5、制備 外源外源DNADNA片段與質(zhì)粒載體中的克隆片段與質(zhì)粒載體中的克隆 重組子的轉(zhuǎn)化及篩選、鑒定重組子的轉(zhuǎn)化及篩選、鑒定 是一個復(fù)制子：是一個復(fù)制子： 載體在受體細(xì)胞中能大量繁殖，其攜帶的外載體在受體細(xì)胞中能大量繁殖，其攜帶的外源基因才能在受體細(xì)胞中得到大量擴(kuò)增源基因才能在受體細(xì)胞中得到大量擴(kuò)增 有有1 1到多個限制內(nèi)切酶的單一識別與切割位到多個限制內(nèi)切酶的單一識別與切割位點，便于外源基因的插入點，便于外源基因的插入 具有選擇性的遺傳標(biāo)記具有選擇性的遺傳標(biāo)記( (如抗生素抗性標(biāo)記如抗生素抗性標(biāo)記等等) )以此知道它是否已進(jìn)入受體細(xì)胞，并據(jù)以此知道它是否已進(jìn)入受體細(xì)胞，并據(jù)此標(biāo)記將受體細(xì)胞從其他

6、細(xì)胞中分離出來此標(biāo)記將受體細(xì)胞從其他細(xì)胞中分離出來載體必備條件載體必備條件v Plasmid v Cosmid, Fosmidv P1v YAC (Yeast Artificial Chromosome)v BAC (Bacterial Artificial Chromosome)v MAC (Mammalian Artificial Chromosome)v PAC (P1-derived Artificial Chromosome)v BIBAC (Binary-BAC)v TAC (Transformation-competent Artificial Chromosome)基因克隆相關(guān)

7、載體基因克隆相關(guān)載體實驗一實驗一 質(zhì)粒的制備質(zhì)粒的制備 質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的質(zhì)粒是攜帶外源基因進(jìn)入細(xì)菌中擴(kuò)增或表達(dá)的主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒主要載體，它在基因操作中具有重要作用。質(zhì)粒的分離與提取是最常用、最基本的實驗技術(shù)。的分離與提取是最常用、最基本的實驗技術(shù)。 質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括質(zhì)粒的提取方法很多，大多包括3 3個主要步個主要步驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒驟：細(xì)菌的培養(yǎng)、細(xì)菌的收集和裂解、質(zhì)粒DNADNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例，介紹質(zhì)的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的制備過程粒的制備過程 質(zhì)粒是染色體之外的一種

8、穩(wěn)定的遺傳因子，質(zhì)粒是染色體之外的一種穩(wěn)定的遺傳因子，大小在大小在1 120kb20kb之間，是雙鏈閉合環(huán)狀之間，是雙鏈閉合環(huán)狀DNADNA分子，分子，具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細(xì)胞保持它具有自主復(fù)制和轉(zhuǎn)錄能力，能使子代細(xì)胞保持它們恒定的拷貝數(shù)可表達(dá)它所攜帶的遺傳信息。它們恒定的拷貝數(shù)可表達(dá)它所攜帶的遺傳信息。它可獨立游離于細(xì)胞質(zhì)中，也可整合到細(xì)菌染色體可獨立游離于細(xì)胞質(zhì)中，也可整合到細(xì)菌染色體上。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制可分為嚴(yán)謹(jǐn)型（只在細(xì)上。質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制可分為嚴(yán)謹(jǐn)型（只在細(xì)胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，一個細(xì)胞內(nèi)只有胞周期的一定階段進(jìn)行復(fù)制，一個細(xì)胞內(nèi)只有1 1至幾個拷貝）和松弛型（細(xì)胞

9、周期中隨時可以復(fù)至幾個拷貝）和松弛型（細(xì)胞周期中隨時可以復(fù)制，拷貝數(shù)較多，一般在細(xì)胞內(nèi)有制，拷貝數(shù)較多，一般在細(xì)胞內(nèi)有2020個以上）個以上）質(zhì)粒的基本特點質(zhì)粒的基本特點Multiple cloning site從平板上挑取單菌落接種于含相應(yīng)從平板上挑取單菌落接種于含相應(yīng)抗生素的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長后抗生素的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數(shù)生長后期即可期即可(松馳型質(zhì)粒松馳型質(zhì)粒)。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒（拷。嚴(yán)謹(jǐn)型質(zhì)粒（拷貝數(shù)較低）可采用氯霉素擴(kuò)增的辦法來貝數(shù)較低）可采用氯霉素擴(kuò)增的辦法來擴(kuò)增質(zhì)粒擴(kuò)增質(zhì)粒細(xì)菌培養(yǎng)物的生長細(xì)菌培養(yǎng)物的生長 通過離心收集菌體；細(xì)菌的裂解可采通過離心收集菌體；細(xì)菌的裂解可采用離子型或

10、非離子型去污劑、有機(jī)溶劑、用離子型或非離子型去污劑、有機(jī)溶劑、堿處理或加熱處理等方法。（具體采用何堿處理或加熱處理等方法。（具體采用何種方法取決于質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株種方法取決于質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株及裂解后純化質(zhì)粒的方法）及裂解后純化質(zhì)粒的方法）細(xì)菌的收集及裂解細(xì)菌的收集及裂解 solution I重懸細(xì)菌后，加入重懸細(xì)菌后，加入solution II，其，其中的中的SDS破壞細(xì)胞壁、膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出破壞細(xì)胞壁、膜，使細(xì)胞內(nèi)容物釋放出來，來，NaOH 使使DNA變性、堿基對打開，使宿主染變性、堿基對打開，使宿主染色體色體DNA雙鏈分開，而閉合環(huán)狀的質(zhì)粒雙鏈分開，而閉合環(huán)狀的質(zhì)粒D

11、NA處處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)，兩個環(huán)并不分開，當(dāng)加入于拓?fù)淅p繞狀態(tài)，兩個環(huán)并不分開，當(dāng)加入Solution III 中和后宿主中和后宿主DNA由于很大，堿基還由于很大，堿基還未來得及配對就在冰冷的條件下與未來得及配對就在冰冷的條件下與SDS、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)、高分子量的高分子量的RNA等纏繞在一起沉淀下來，而質(zhì)粒等纏繞在一起沉淀下來，而質(zhì)粒DNA由于很小且雙鏈未分開，能夠迅速配對重新由于很小且雙鏈未分開，能夠迅速配對重新形成超螺旋，處于溶解狀態(tài)。形成超螺旋，處于溶解狀態(tài)。堿裂解法堿裂解法質(zhì)粒的沉淀質(zhì)粒的沉淀：加加2/32/3體積的異丙醇，室溫下體積的異丙醇，室溫下放置放置5 5分鐘或兩倍體積分鐘或兩倍

12、體積9595乙乙醇混勻，冰上放置醇混勻，冰上放置1010分鐘分鐘；質(zhì)粒的純化質(zhì)粒的純化：一般采用苯酚一般采用苯酚/ /氯仿純化質(zhì)粒氯仿純化質(zhì)粒; ; 為滿足較高要求，可采用氯為滿足較高要求，可采用氯化銫密度梯度離心化銫密度梯度離心實驗步驟實驗步驟取含有取含有pUC18質(zhì)?；蛸|(zhì)粒或BAC的大腸桿菌菌液于的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)培養(yǎng)基上基上37過夜培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)；用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的抗生素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中，37搖床搖床250 r/min過夜培養(yǎng)；過夜培養(yǎng)；吸取吸取1.5 ml菌液，菌液，12000 g離心離心1分鐘，收集菌體，倒分鐘

13、，收集菌體，倒掉菌液；吸取掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌體，盡量將菌菌液，再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；液倒干凈； 加入加入300 l 溶液溶液 I振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻振蕩打勻，重新懸浮細(xì)胞，震蕩混勻（注意：應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊）；（注意：應(yīng)徹底打勻沉淀或碎塊）； 加入加入300 l 溶液溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過般不超過5分鐘；分鐘； 加入加入300 l 溶液溶液III顛倒混勻，放置于冰上顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；使雜質(zhì)充分沉淀；12000 g離心離心10分鐘；分鐘；吸取吸取800 l 上清液

14、（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一至另一Eppendorf管中，加入管中，加入2/3體積的異丙醇，室體積的異丙醇，室溫下放置溫下放置5分鐘；分鐘；12000 g 常溫離心常溫離心15分鐘；分鐘；倒盡上清，加倒盡上清，加75乙醇浸洗除鹽，（放置片刻后倒乙醇浸洗除鹽，（放置片刻后倒去上清；或離心去上清；或離心5分鐘）分鐘）加加40 l 滅菌超純水或滅菌超純水或TE溶解；溶解；質(zhì)粒的質(zhì)量檢測，于質(zhì)粒的質(zhì)量檢測，于-20保存。保存。 Solution I:Tris.HCl （pH 7.5）50 mMEDTA 10 mMRNase 100 g/mlSolution

15、II: NaOH 0.2 MSDS1 %Solution III: Final concentrationKAc 1.32 MUsing HAc to adjust pH to 4.8TE (pH 8.0) Tris.HCl （pH 8.0） 10 mM EDTA （pH 8.0） 1 mM氨芐青霉素（氨芐青霉素（ampicillin）：）： 能夠殺死正在生長能夠殺死正在生長的大腸桿菌，其主要通過抑制肽聚糖交聯(lián)的大腸桿菌，其主要通過抑制肽聚糖交聯(lián)而抑制細(xì)胞壁的合成。而抑制細(xì)胞壁的合成。氨芐青霉素抗性基因（氨芐青霉素抗性基因（ampr）：）：合成合成-內(nèi)酰內(nèi)酰胺酶，在氨芐青霉素進(jìn)入細(xì)胞之前將其水

16、胺酶，在氨芐青霉素進(jìn)入細(xì)胞之前將其水解解。RNaseA: C或或U的的3P與相鄰的與相鄰的5OH處切開。處切開。 （配制：一般以（配制：一般以10mg/ml溶于溶于TE中，然后中，然后在沸水中煮在沸水中煮1030分鐘之后分成小份儲存分鐘之后分成小份儲存于于20）。）。DNA純度：純度：吸光值檢測：檢測吸光值檢測：檢測260nm、280nm吸光值，吸光值，紫外分光光度計紫外分光光度計A260/A280=1.82.0； 1.8最佳，低于最佳，低于1.8說明有蛋白質(zhì)，大于說明有蛋白質(zhì)，大于1.8說明有說明有RNA。質(zhì)量檢測：質(zhì)量檢測：瓊脂糖凝膠電泳：一般有三條帶（超螺旋、瓊脂糖凝膠電泳：一般有三條帶

17、（超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型），點樣孔附近無開環(huán)、線型三種構(gòu)型），點樣孔附近無DNA帶（無染色帶（無染色體體DNA污染）。污染）。DNA濃度：濃度： 1 OD50 g/ml DS-DNA 或或 1 OD 40 g/ml RNA or SSDNA 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA質(zhì)量檢測質(zhì)量檢測實驗二實驗二 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電帶電荷的物質(zhì)在電場中的趨向運(yùn)動稱為電泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分泳。電泳的種類多，應(yīng)用非常廣泛，它已成為分子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊子生物學(xué)技術(shù)中分離生物大分子的重要手段。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等

18、優(yōu)脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。 實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模赫莆窄傊悄z電泳的原理，學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠掌握瓊脂糖凝膠電泳的原理，學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳的操作。電泳的操作。實驗材料：實驗材料：質(zhì)粒質(zhì)粒DNADNA、植物總、植物總DNADNA或它們的酶切產(chǎn)物或它們的酶切產(chǎn)物。實驗原理：實驗原理：在在pH值為值為8.08.3時，核酸分子堿基幾乎不解離，時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時向磷酸全部解離，核酸分子帶負(fù)電，在電泳時向正極移動。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳正極移動。采用適當(dāng)濃度的凝膠介質(zhì)

19、作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構(gòu)像不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從像不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異，從而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸而達(dá)到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置?？捎^察到核酸片段所在的位置。 實驗步驟：實驗步驟：用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在用膠帶將洗凈、干燥的制膠板的兩端封好，水平放置在工作臺上；工作臺上；調(diào)整好梳子的高度；調(diào)整好梳子的高度；稱取稱取0.24 g0.24 g瓊脂糖于瓊

20、脂糖于30 ml 0.530 ml 0.5TBETBE中，在微波爐中使中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫?zé)釙r倒膠；瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫?zé)釙r倒膠；凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；凝膠凝固后，小心拔去梳子，撕下膠帶；將電泳樣品與溴酚藍(lán)混合后將樣品依次點入加樣孔中；將電泳樣品與溴酚藍(lán)混合后將樣品依次點入加樣孔中；將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開電泳儀，使核酸樣品向正極泳動；核酸樣品向正極泳動；電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5 0.5 g/mlg/ml的溴的溴化乙錠（化乙錠（EBEB）

21、中浸泡）中浸泡101015 min15 min，在紫外透射儀上觀察，在紫外透射儀上觀察電泳結(jié)果并照相記錄。電泳結(jié)果并照相記錄。 影響影響DNA遷移速率的因素遷移速率的因素 DNA分子大小：分子大?。哼w移速率遷移速率U U與與logNlogN成反比（成反比（N N為堿基對為堿基對數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（數(shù)目）。分子大小相等，電荷基本相等（DNADNA結(jié)構(gòu)重復(fù)結(jié)構(gòu)重復(fù)性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電性）。分子越大，遷移越慢。等量的空間結(jié)構(gòu)緊密的電泳快（超螺旋泳快（超螺旋 線性線性DNADNA）瓊脂糖濃度：瓊脂糖濃度：logU=logU0 Kr 膠濃度，膠濃度，U為遷移率

22、，為遷移率，U0 為為DNA的自由電泳遷移率，的自由電泳遷移率， 為膠濃度，為膠濃度，Kr為介質(zhì)阻滯為介質(zhì)阻滯系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的系數(shù)。不同的凝膠濃度，分辨不同范圍的DNA Agarose：0.5%： 1-30 kb；0.7%： 0.8-12 kb1.2%： 0.4-7 kb；1.5%： 0.2-3 kb. DNA構(gòu)象：構(gòu)象：一般遷移速率超螺旋環(huán)狀一般遷移速率超螺旋環(huán)狀 線狀線狀DNADNA單鏈開環(huán)。單鏈開環(huán)。當(dāng)條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、當(dāng)條件變化時，情況會相反，還與瓊脂糖的濃度、電流強(qiáng)度、離子強(qiáng)度及離子強(qiáng)度及EBEB含量有關(guān)。含量有關(guān)。所加電壓：所加

23、電壓：低電壓時，線狀低電壓時，線狀DNADNA片段的遷移速率與所加電壓片段的遷移速率與所加電壓成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過成正比。使分辨效果好，凝膠上所加電壓不應(yīng)超過5V/cm5V/cm堿基組成與溫度堿基組成與溫度：一般影響不大一般影響不大4 -30 4 -30 嵌入染料的存在：嵌入染料的存在：降低線性降低線性DNADNA遷移率，遷移率，( (不提倡加在電泳液不提倡加在電泳液中中) )電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響影響DNA的遷移率，無離的遷移率，無離子存在時，核酸基本不泳動，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害，熔化子存在時，核酸基本不泳動，離子強(qiáng)度過大產(chǎn)熱厲害

24、，熔化凝膠并導(dǎo)致凝膠并導(dǎo)致DNA變性，一般采用變性，一般采用1TAE，1TBE，1TPE（均含（均含EDTA pH8.0） 電泳指示劑：電泳指示劑：核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴核酸電泳常用的指示劑有兩種，溴酚藍(lán)（酚藍(lán)（bromophenol blue, Bb）呈藍(lán)紫色；二）呈藍(lán)紫色；二甲苯晴（甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈藍(lán)色，它攜帶）呈藍(lán)色，它攜帶的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率的電荷量比溴酚藍(lán)少，在凝膠中的的遷移率比溴酚藍(lán)慢。比溴酚藍(lán)慢。 EB：溴化乙錠，可嵌入溴化乙錠，可嵌入DNA分子中，受紫外光分子中，受紫外光激發(fā)而發(fā)出熒光，利用它可檢測激發(fā)而發(fā)出熒光，利用它可

25、檢測DNA。是誘。是誘變劑，可引起插入突變，并有中度毒性，操變劑，可引起插入突變，并有中度毒性，操作時應(yīng)注意防護(hù)。操作時應(yīng)戴手套，盡量減作時應(yīng)注意防護(hù)。操作時應(yīng)戴手套，盡量減少臺面污染。少臺面污染。 質(zhì)粒電泳檢測：質(zhì)粒電泳檢測：一般有三條帶（超螺旋、開環(huán)、一般有三條帶（超螺旋、開環(huán)、線型三種構(gòu)型）線型三種構(gòu)型）質(zhì)粒電泳檢測質(zhì)粒電泳檢測實驗三實驗三 感受態(tài)細(xì)胞的制備感受態(tài)細(xì)胞的制備體外連接的體外連接的DNA重組分子導(dǎo)入合適的重組分子導(dǎo)入合適的受體細(xì)胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝受體細(xì)胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝取外源取外源DNA的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更的能力，提高轉(zhuǎn)化效率以獲得更多的轉(zhuǎn)

26、化子，人們摸索出了不同的方法處理多的轉(zhuǎn)化子，人們摸索出了不同的方法處理細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)細(xì)菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉(zhuǎn)化法和化法和CaCl2法將外源法將外源DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞中，導(dǎo)入受體細(xì)胞中，因此需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和因此需要相應(yīng)地制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞和CaCl2感受態(tài)細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞。 將外源將外源DNA導(dǎo)入大腸桿菌主要有兩種方法：導(dǎo)入大腸桿菌主要有兩種方法：CaCl2法：法：利用冰冷的利用冰冷的CaClCaCl2 2處理對處理對數(shù)生長期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生數(shù)生長期的細(xì)胞，可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生短暫的短暫的“感受態(tài)感受態(tài)”，易于攝取外源，易于攝取外源DNAD

27、NA。10106 6 10107 7轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/ / g DNAg DNA。電轉(zhuǎn)化法：電轉(zhuǎn)化法：利用瞬間高壓在細(xì)胞上利用瞬間高壓在細(xì)胞上打孔。因而需用冰冷的超純水多次打孔。因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對數(shù)生長前期的細(xì)胞，以洗滌處于對數(shù)生長前期的細(xì)胞，以使細(xì)胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)使細(xì)胞懸浮液中應(yīng)含有盡量少的導(dǎo)電離子。電離子。10109 9101010 10 轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化子/ / g DNAg DNA；前夜接種受體菌（前夜接種受體菌（DH5DH5 或或DH10DH10B B），挑取單菌落于），挑取單菌落于LBLB培培養(yǎng)基中養(yǎng)基中3737搖床培養(yǎng)過夜（約搖床培養(yǎng)過夜（約1616小時）；小時）

28、；取取1ml1ml過夜培養(yǎng)物于過夜培養(yǎng)物于100ml100ml添加有添加有20mM MgCl20mM MgCl2 2的的LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基中，在中，在3737搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-32.5-3小時（小時（300rpm300rpm）；）；將將0.1M CaCl0.1M CaCl2 2溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工溶液置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作作臺和冰上操作吸取吸取1.5ml1.5ml培養(yǎng)好的菌液至培養(yǎng)好的菌液至1.5ml1.5ml離心管中，在冰上冷卻離心管中，在冰上冷卻1010分鐘；分鐘；CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備（一）感受態(tài)細(xì)胞的制備（一）

29、44下下4000rpm4000rpm冷凍離心冷凍離心1010分鐘；分鐘；棄去上清，加入棄去上清，加入100100 l l預(yù)冷預(yù)冷0.1M CaCl0.1M CaCl2 2溶液，溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮，在冰放置在冰放置2020分鐘；分鐘；44下下4000 rpm4000 rpm冷凍離心冷凍離心1010分鐘；分鐘；棄去上清，加入棄去上清，加入100100 l l預(yù)冷預(yù)冷0.1M CaCl0.1M CaCl2 2溶液，溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮；用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸?。?細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實

30、驗或添加冷凍保細(xì)胞懸浮液可立即用于轉(zhuǎn)化實驗或添加冷凍保護(hù)劑（護(hù)劑（15%15%20%20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆酶视停┖蟪蜏乩鋬鲑A存?zhèn)溆茫?070）。）。CaCl2感受態(tài)細(xì)胞的制備（二）感受態(tài)細(xì)胞的制備（二）密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對密切注視細(xì)菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數(shù)生長期的細(xì)胞（一般通過檢測數(shù)生長期的細(xì)胞（一般通過檢測OD600來控制。來控制。DH5 菌株菌株OD600為為0.5時細(xì)胞密度是時細(xì)胞密度是5107/ml）；）；所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑

31、或其它化學(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率?；瘜W(xué)物質(zhì)的存在可能大大降低細(xì)菌的轉(zhuǎn)化效率。操作注意事項操作注意事項電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備（一）電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備（一）前夜接種受體菌（前夜接種受體菌（DH5DH5 或或DH10DH10B B），挑取單菌落于），挑取單菌落于LBLB培培養(yǎng)基中養(yǎng)基中3737搖床培養(yǎng)過夜（約搖床培養(yǎng)過夜（約1616小時）；小時）；取取1ml1ml過夜培養(yǎng)物于過夜培養(yǎng)物于100ml LB100ml LB培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中，在3737搖床上搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約劇烈振蕩培養(yǎng)約2.5-32.5-3小時（小時（300rpm300rpm）；）；將菌液迅速置于冰上，同時將菌液

32、迅速置于冰上，同時10%10%的甘油置于冰上預(yù)冷；的甘油置于冰上預(yù)冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作吸取吸取1.5ml1.5ml培養(yǎng)好的菌液至培養(yǎng)好的菌液至1.5ml1.5ml離心管中，在冰上冷卻離心管中，在冰上冷卻1010分鐘；分鐘；44下下3000g3000g低溫離心低溫離心5-105-10分鐘；分鐘；電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備（二）電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞的制備（二）棄去上清，加入棄去上清，加入15001500 l l預(yù)冷的預(yù)冷的1010的甘油，用移液器輕的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；44下下3000g3000g低

33、溫離心低溫離心5-105-10分鐘；分鐘；棄去上清，加入棄去上清，加入750750 l l預(yù)冷預(yù)冷的預(yù)冷預(yù)冷的1010的甘油，用移液的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮；器輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸??；44下下3000g3000g低溫離心低溫離心5-105-10分鐘；分鐘；棄去上清，加入棄去上清，加入2020 l l預(yù)冷的預(yù)冷的1010的甘油，用移液槍輕輕的甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮上下吸動打勻，使細(xì)胞重新懸浮超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǔ蜏乩鋬鲑A存?zhèn)溆茫?070）。使用的培養(yǎng)基一般用使用的培養(yǎng)基一般用NaClNaCl減半的減半的LBLB培養(yǎng)基；培養(yǎng)基；細(xì)菌的生長

34、狀態(tài)；細(xì)菌的生長狀態(tài)；制備感受態(tài)細(xì)胞及配制試劑所用的水應(yīng)達(dá)到制備感受態(tài)細(xì)胞及配制試劑所用的水應(yīng)達(dá)到18 18 M,M,即使用即使用MilliQMilliQ級的超純水；化學(xué)試劑應(yīng)是分級的超純水；化學(xué)試劑應(yīng)是分子生物學(xué)級；子生物學(xué)級；所使用的槍頭和器皿都應(yīng)是新的，干凈的。所使用的槍頭和器皿都應(yīng)是新的，干凈的。所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；所有操作均應(yīng)在無菌條件和冰上進(jìn)行；操作注意事項操作注意事項 (基本同基本同CaCl2，但應(yīng)特別控制鹽離子的殘留但應(yīng)特別控制鹽離子的殘留)利用質(zhì)粒載體利用質(zhì)粒載體克隆水稻克隆水稻DNA片段片段限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切CIAP去除去除5磷酸磷酸外源外源DN

35、ADNA限制性內(nèi)切酶酶切限制性內(nèi)切酶酶切5P5P3OH3OH5P5P3OH3OH5P5P5P5P3OH3OH3OH3OHT4T4連接酶連接連接酶連接5OH5OH5OH5OH3OH3OH轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化E.ColiE.Coli多克隆位點多克隆位點3OH3OH篩選鑒定篩選鑒定載體及外源片段的限制酶消化載體及外源片段的限制酶消化: : 限制性內(nèi)切酶切出限制性內(nèi)切酶切出相互匹配的粘性末端（一種酶）或不相匹配的粘性相互匹配的粘性末端（一種酶）或不相匹配的粘性末端（不同酶消化）或平端；末端（不同酶消化）或平端；載體的去磷酸化載體的去磷酸化: : 堿性磷酸酶去除載體的堿性磷酸酶去除載體的55P P基基團(tuán)，以防載體自

36、連；團(tuán)，以防載體自連；線狀載體與外源片段的連接線狀載體與外源片段的連接: : 連接酶使雙鏈連接酶使雙鏈DNA 5DNA 5P P與相鄰的與相鄰的33OHOH之間形成新的共價鍵，若質(zhì)粒之間形成新的共價鍵，若質(zhì)粒載體的兩條鏈都帶有載體的兩條鏈都帶有55磷酸基團(tuán)，磷酸基團(tuán)， 則可形成則可形成4 4個新個新的磷酸二酯鍵，但如質(zhì)粒已去磷酸化，則只能形成的磷酸二酯鍵，但如質(zhì)粒已去磷酸化，則只能形成2 2個新的磷酸二酯鍵，且產(chǎn)生的兩個雜交分子帶有個新的磷酸二酯鍵，且產(chǎn)生的兩個雜交分子帶有2 2個個單鏈切口，當(dāng)雜合體導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。單鏈切口，當(dāng)雜合體導(dǎo)入到感受態(tài)細(xì)胞后可被修復(fù)。在質(zhì)粒中克隆外源片段

37、的主要步驟在質(zhì)粒中克隆外源片段的主要步驟4. 4. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞: : 注意：利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時，用注意：利用氨芐青霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子時，用轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞 鋪平板的密度要低（鋪平板的密度要低（90mm平平板上不得超過板上不得超過105個菌落），同時個菌落），同時37 培培養(yǎng)不應(yīng)超過養(yǎng)不應(yīng)超過20小時，具氨芐青霉素抗性小時，具氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化體可將的轉(zhuǎn)化體可將 內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基內(nèi)酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導(dǎo)致對氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出導(dǎo)致對氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出現(xiàn)?，F(xiàn)。 互

38、補(bǔ)互補(bǔ) 雜交篩選雜交篩選 插入失活（一些老質(zhì)粒如插入失活（一些老質(zhì)粒如pBR322等）等） 小量提取質(zhì)粒酶切檢測小量提取質(zhì)粒酶切檢測5.5.轉(zhuǎn)化子的鑒定：轉(zhuǎn)化子的鑒定：鑒定轉(zhuǎn)化子中是否含有外源鑒定轉(zhuǎn)化子中是否含有外源DNA片片段常用的方法有段常用的方法有轉(zhuǎn)化子的鑒定（轉(zhuǎn)化子的鑒定（ 互補(bǔ)）互補(bǔ)）:許多常用載體（許多常用載體（pUC系列）都帶有一個大腸桿菌系列）都帶有一個大腸桿菌DNA的短片段，其中的短片段，其中含有含有 -半乳糖苷酶（半乳糖苷酶（LacZ）的調(diào)控序列和頭）的調(diào)控序列和頭146個氨基酸的編碼序列，該編個氨基酸的編碼序列，該編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾

39、個氨基酸插碼區(qū)中插入了一個多克隆位點，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個氨基酸插入到入到 -半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。這種載體適用于可編碼半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能。這種載體適用于可編碼 -半乳糖半乳糖苷酶苷酶C端部分序列的宿主細(xì)胞。雖然宿主和質(zhì)粒編碼的片段都沒有活性，但端部分序列的宿主細(xì)胞。雖然宿主和質(zhì)粒編碼的片段都沒有活性，但它們可以融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，它們可以融為一體，形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，LacZ基因缺失近基因缺失近操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的操縱基因區(qū)段的突變體與帶有完整的近操縱基因區(qū)段的 -半乳糖苷酶陰性的半乳糖苷酶陰性的突

40、變體之間實現(xiàn)互補(bǔ)，這種現(xiàn)象叫突變體之間實現(xiàn)互補(bǔ)，這種現(xiàn)象叫 互補(bǔ)互補(bǔ)。由。由 互補(bǔ)而產(chǎn)生的互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ細(xì)菌易細(xì)菌易于識別，因為它們在于識別，因為它們在生色底物生色底物x-gal (5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚- -D-半乳糖苷半乳糖苷)存在下，存在下，形成藍(lán)色菌落，而外源片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點以后幾乎不可避免地導(dǎo)形成藍(lán)色菌落，而外源片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點以后幾乎不可避免地導(dǎo)致產(chǎn)生無致產(chǎn)生無 互補(bǔ)能力的氨基端片段，因此，帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落?；パa(bǔ)能力的氨基端片段，因此，帶重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。這一顏色反應(yīng)大大簡化了質(zhì)粒重組體的鑒定。這一顏色反應(yīng)大大簡化了質(zhì)粒重組

41、體的鑒定。IPTG（異丙基硫代（異丙基硫代- -半乳糖苷）：是半乳糖苷）：是 -半乳糖苷酶活性的誘導(dǎo)物，也可作為半乳糖苷酶活性的誘導(dǎo)物，也可作為具有具有Lac或或Tac啟動子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物來使用。啟動子的表達(dá)載體的表達(dá)誘導(dǎo)物來使用。X-galX-gal -peptide when combined with the carboxyl terminus of -galactosiase can make a functional -galactosiase -peptideC-terminus of -galactosiase +藍(lán)色菌落：載體自連藍(lán)色菌落：載體自連白色菌落：含外源片段白

42、色菌落：含外源片段外源外源DNA克隆的要求克隆的要求說說 明明末端為平端末端為平端要求較高的要求較高的DNA及及連接酶連接酶非重組克隆的背景高非重組克隆的背景高不同酶切的平頭可連接不同酶切的平頭可連接質(zhì)粒及外源質(zhì)粒及外源DNA連接處的酶切連接處的酶切位點消失（不同平端酶）位點消失（不同平端酶）重組質(zhì)粒可能帶有外源重組質(zhì)?？赡軒в型庠碊NA的的串聯(lián)拷貝串聯(lián)拷貝不同的突出端不同的突出端用兩種限制酶消化用兩種限制酶消化后需純化質(zhì)粒以提后需純化質(zhì)粒以提高連接效率高連接效率一般酶切位點可保留一般酶切位點可保留非重組克隆背景低非重組克隆背景低不需不需CIP處理處理外源外源DNA只以一個方向插入重只以一個方

43、向插入重組質(zhì)粒中組質(zhì)粒中相同的突出端相同的突出端線狀質(zhì)粒線狀質(zhì)粒DNA常需常需用磷酸酶（用磷酸酶（CIP）處）處理理一般酶切位點?？杀Ａ粢话忝盖形稽c常可保留外源外源DNA會以兩個方向插入會以兩個方向插入重組質(zhì)?？蓭в型庠粗亟M質(zhì)?？蓭в型庠碊NA的串的串聯(lián)拷貝聯(lián)拷貝Molecular Cloning限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶堿性磷酸酶堿性磷酸酶連接酶連接酶克隆中用到的幾種工具酶克隆中用到的幾種工具酶 About 400 different restriction enzymes. RE were discovered in 1970s by Hamilton Smith and Daniel Na

44、thans. They shared the 1986 Nobel prize in physiology or medicine with Werner Arber.限制性內(nèi)切酶：限制性內(nèi)切酶：有特定的識別序列有特定的識別序列 ，通常為，通常為4 46 6堿基的回文堿基的回文對稱序列。對稱序列。切割位點位于識別序列內(nèi)的固定位置上，切切割位點位于識別序列內(nèi)的固定位置上，切割后在割后在55末端有磷酸基團(tuán)，末端有磷酸基團(tuán)，33末端有羥基。末端有羥基。切割后形成粘性末端或平末端，前者又分為切割后形成粘性末端或平末端，前者又分為33突出端（如突出端（如PstPstI I）和）和55突出端突出端( (如

45、如EcoEcoRI)RI)兩兩種種其活性發(fā)揮只需其活性發(fā)揮只需MgMg2 2作輔酶。作輔酶。II類限制性內(nèi)切酶的特點類限制性內(nèi)切酶的特點限制酶的一個活性單位（限制酶的一個活性單位（1U）：）：原則上指原則上指在在50l 反應(yīng)體系中，反應(yīng)體系中，37下，經(jīng)過下，經(jīng)過1小時的反應(yīng)小時的反應(yīng)將將1 g的的DNA完全分解所需要的酶量。完全分解所需要的酶量。限制酶的限制酶的star活性：活性：限制酶在某些條件下使限制酶在某些條件下使用時對底物用時對底物DNA的特異性可能降低，即可將與的特異性可能降低，即可將與原來識別的特定原來識別的特定DNA序列不同的堿基序列切斷，序列不同的堿基序列切斷，這種現(xiàn)象叫限制

46、酶的這種現(xiàn)象叫限制酶的star活性。它的出現(xiàn)的頻率活性。它的出現(xiàn)的頻率與酶、底物及反應(yīng)條件有關(guān)。與酶、底物及反應(yīng)條件有關(guān)。細(xì)菌堿性磷酸酶（細(xì)菌堿性磷酸酶（BAPBAP）, ,牛小腸堿性磷酸酶（牛小腸堿性磷酸酶（CIAPCIAP）以及小蝦堿性磷酸酶（以及小蝦堿性磷酸酶（SAPSAP）都能催化磷酸單脂鍵的）都能催化磷酸單脂鍵的水解（包括水解（包括DNADNA、RNARNA、dNTPdNTP和和NTPNTP上的上的55磷酸殘磷酸殘基）基） ，不能催化磷酸三脂的水解。，不能催化磷酸三脂的水解。比較而言，比較而言，CIAPCIAP的活性比的活性比BAPBAP的高的高10102020倍倍,CIAP,CIA

47、P經(jīng)加經(jīng)加熱處理，容易失活但不能完全失活熱處理，容易失活但不能完全失活, ,若要使酶完全失若要使酶完全失活，不論是活，不論是BAPBAP還是還是CIAPCIAP還需要經(jīng)苯酚處理。而還需要經(jīng)苯酚處理。而SAPSAP經(jīng)經(jīng)6565C C 加熱加熱1515分鐘就可完全失活。分鐘就可完全失活?；钚远x：在活性定義：在37 37 C C 、pH9.8pH9.8的條件下，的條件下，1 1分鐘內(nèi)水解分鐘內(nèi)水解對硝基苯磷酸鹽（對硝基苯磷酸鹽（-nitrophenyl phosphate)-nitrophenyl phosphate)生成生成1M1M的對硝基苯的對硝基苯(-nitrophenol)(-nitrop

48、henol)所需的酶量定義為所需的酶量定義為1 1個活性單位（個活性單位（U U）. .堿性磷酸酶堿性磷酸酶體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和酶：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接酶，但噬菌體連接酶，但幾乎在所有的克隆中幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是首噬菌體連接酶都是首選的酶，因其能在正常的反應(yīng)條件下能有效選的酶，因其能在正常的反應(yīng)條件下能有效的將平端連接起來。的將平端連接起來。連接酶連接酶各種連接酶特性的比較：各種連接酶特性的比較：T4DNA Ligase E.coli DNA LigaseT4 RNA LigaseLigases o

49、f thermophilic bacteria最適最適pH輔酶輔酶7.2-7.8ATP7.5-8.0NAD7.2-8.4ATPNAD平滑末端平滑末端可能可能*不能不能NODNA 5P末端和末端和RNA 3OH末端末端可能可能可能可能不能不能NORNA 5P末端和末端和DNA 3OH末端末端可能可能不能不能不能不能NORNA和和RNA少數(shù)少數(shù) 可能可能不能不能可能可能NO實驗四實驗四 外源外源DNA片段在質(zhì)粒載體中的克隆片段在質(zhì)粒載體中的克隆實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模簩W(xué)習(xí)學(xué)習(xí)DNA的酶切、外源片段的純化及外源片段與的酶切、外源片段的純化及外源片段與載體的連接，將載體的連接，將BAC克隆的酶切片段克隆到

50、克隆的酶切片段克隆到PUC18載體上。載體上。 實驗材料：實驗材料：外源片段來自一個含有水稻外源片段來自一個含有水稻DNA片段的片段的BAC克隆克隆的酶切片段；克隆載體為的酶切片段；克隆載體為PUC18。 實驗原理：實驗原理：限制性內(nèi)切酶可識別特定位點并切割限制性內(nèi)切酶可識別特定位點并切割BAC克隆產(chǎn)克隆產(chǎn)生粘性末端或平端的外片段，經(jīng)生粘性末端或平端的外片段，經(jīng)DNA的純化處理后用于連接的純化處理后用于連接反應(yīng)；選擇克隆載體反應(yīng)；選擇克隆載體PUC18多克隆位點上相應(yīng)的限制性內(nèi)切多克隆位點上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自

51、連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現(xiàn)外源片段的克隆。用下將外源片段連接到載體上，實現(xiàn)外源片段的克隆。 載體載體PUC和外源和外源DNA片段片段BAC的限制性酶切的限制性酶切 （50 l反應(yīng)體系，用反應(yīng)體系，用1.5ml tube，冰上操作），冰上操作） DNA30 lR.E1 l10buffer5 lddH2O14 l取取8 l BAC和和5 l PUC用用1.2%凝膠檢測酶切凝膠檢測酶切是否完全是否完全 BAC酶切電酶切電泳圖泳圖造成造成DNA酶切不完全的主要原因有：酶切不完全的主要原因有： DNA不干凈，反應(yīng)體系中存在酶的抑制劑；不干凈，反應(yīng)體系中存在酶的抑制劑； 操作不當(dāng)，酶

52、或操作不當(dāng)，酶或DNA加至管壁上，反應(yīng)體系加至管壁上，反應(yīng)體系沒完全混合；沒完全混合； 反應(yīng)條件不合適，用錯了緩沖液或溫度不合反應(yīng)條件不合適，用錯了緩沖液或溫度不合適；適； 酶的活力不夠酶的活力不夠酶切產(chǎn)物的純化：酶切產(chǎn)物的純化： 加入加入ddH2O 150 l （擴(kuò)大體積），加入等體積氯（擴(kuò)大體積），加入等體積氯仿仿/異戊醇（異戊醇（24:1），顛倒混勻后離心），顛倒混勻后離心10 min； 吸出上清，加吸出上清，加1/10體積體積3M NaAc和兩倍體積乙醇，和兩倍體積乙醇，-20放置放置15分鐘以上；分鐘以上； 12000 rpm 4冷凍離心冷凍離心15分鐘；分鐘； 倒去上清，用倒去上清

53、，用75乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后BAC溶溶于于10 l ddH2O（0.5ml tube中），中），PUC溶于溶于20 l ddH2O（1.5ml tube中）；中）； 載體去磷酸化載體去磷酸化DNA20 lCIAP（TaKaRa）0.5 l10 buffer4.0 lddH2O15.5 l 50反應(yīng)反應(yīng)30 min 以上以上 去磷酸化載體的純化去磷酸化載體的純化7070水浴水浴10 min, 10 min, 使使CIAPCIAP失活；失活； 加入加入ddH2O 150 l （擴(kuò)大體積），加入等體積氯（擴(kuò)大體積），加入等體積氯仿仿/異戊醇（異戊醇（24:1），顛倒混勻后離心），

54、顛倒混勻后離心10 min； 吸出上清，加吸出上清，加1/10體積體積3M NaAc和兩倍體積乙醇，和兩倍體積乙醇，-20放置放置15分鐘以上；分鐘以上；12000 rpm 4冷凍離心冷凍離心15分鐘；分鐘；倒去上清，用倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后溶于乙醇浸洗沉淀，風(fēng)干后溶于10 l ddH2O（0.5ml tube中）中）DNA10 lpUC182.5 l5 buffer1.5 lT4 ligase (3U/l)1 l 16 C水浴過夜水浴過夜連接反應(yīng)：連接反應(yīng)：熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、熱激轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞或電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、37 C培養(yǎng)過夜；培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)化子鑒定轉(zhuǎn)化子鑒

55、定氯仿氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、安全鏡并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。作時需戴手套、安全鏡并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。苯酚苯酚是強(qiáng)腐蝕劑，能引起嚴(yán)重?zé)齻?。操作時是強(qiáng)腐蝕劑，能引起嚴(yán)重?zé)齻?。操作時應(yīng)戴手套、安全鏡、穿防護(hù)服，并在通風(fēng)櫥應(yīng)戴手套、安全鏡、穿防護(hù)服，并在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。中進(jìn)行。注意注意實驗五實驗五 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（熱激法）質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（熱激法）及轉(zhuǎn)化子的鑒定及轉(zhuǎn)化子的鑒定轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)粒或以它為載體構(gòu)建的重組轉(zhuǎn)化是指將質(zhì)?；蛞运鼮檩d體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)

56、子導(dǎo)入細(xì)菌的過程。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中，實現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子細(xì)胞中，實現(xiàn)重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作。可以采用多種方法篩選和鑒定目的克隆。操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。 實驗?zāi)康模簩嶒災(zāi)康模赫莆諢峒しㄞD(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子掌握熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化子的鑒定方法的鑒定方法 實驗材料：實驗材料：外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌外源片段與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌CaCl2感感受態(tài)細(xì)胞受態(tài)細(xì)胞 實驗原理：實驗原理：大腸桿菌在大腸桿菌在0 CaCl2低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹低滲溶液中，菌細(xì)胞膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成

57、抗形成抗DNase的的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42短時間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收短時間熱沖擊處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物，復(fù)合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原在豐富培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因并分裂增殖。在被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，重組子基因得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需得到表達(dá)，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉(zhuǎn)化子的轉(zhuǎn)化子 實驗步驟實驗步驟制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250 ml LA培養(yǎng)基培養(yǎng)基中中250 l Amp，250 l X-gal，25 l I

58、PTG，混勻后倒，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；入滅菌培養(yǎng)皿中；取出取出3管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；每每100 l感受態(tài)細(xì)胞加入約感受態(tài)細(xì)胞加入約20ng質(zhì)粒質(zhì)粒DNA，3管分別加管分別加連接產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì)粒連接產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì)粒DNA（陽性對照）及不加（陽性對照）及不加入任何入任何DNA（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置在冰上放置30分鐘；分鐘；熱擊：將離心管放置熱擊：將離心管放置42水浴，熱擊水浴，熱擊90秒，注意：勿秒，注意：勿搖動離心管；搖動離心管；冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置冰鎮(zhèn)：快速

59、將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，放置12分鐘；分鐘；復(fù)蘇：每管加復(fù)蘇：每管加400 l SOC培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基，在37搖床溫和搖搖床溫和搖動溫育動溫育45分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；分鐘，使細(xì)菌復(fù)蘇；布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有布皿：取適當(dāng)體積均勻涂布于含有IPTG、X-gal、抗、抗生素（生素（Amp）的）的LA平板；平板；培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于37培養(yǎng)培養(yǎng)1216小時小時 即可觀察即可觀察到藍(lán)白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片到藍(lán)白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色菌落是載體自連的轉(zhuǎn)化子）段的轉(zhuǎn)化子，藍(lán)色菌落是載體自連的轉(zhuǎn)化子）電轉(zhuǎn)化的步驟（一）電轉(zhuǎn)化的步驟（一

60、）制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的250 ml LA培養(yǎng)基中培養(yǎng)基中250 l Amp，250 l X-gal，25 l IPTG，混勻后倒入，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；滅菌培養(yǎng)皿中；取出取出3管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；管制備好的感受態(tài)細(xì)胞，放在冰上融化；每管感受態(tài)細(xì)胞中加入約每管感受態(tài)細(xì)胞中加入約20ng質(zhì)粒質(zhì)粒DNA，3管分別加連管分別加連接產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì)粒接產(chǎn)物、標(biāo)準(zhǔn)超螺旋質(zhì)粒DNA（陽性對照）及不加入（陽性對照）及不加入任何任何DNA（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，在（陰性對照），用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置冰上放置1分鐘；分鐘；電轉(zhuǎn)化儀