第3章細(xì)胞工程制藥

1、李光勇手機(jī)箱：第第3 3章章 細(xì)胞工程制藥細(xì)胞工程制藥第第1 1節(jié)節(jié) 細(xì)胞、細(xì)胞工程與細(xì)胞工程制藥細(xì)胞、細(xì)胞工程與細(xì)胞工程制藥一、細(xì)胞一、細(xì)胞二、細(xì)胞工程二、細(xì)胞工程三、細(xì)胞工程制藥三、細(xì)胞工程制藥第第2 2節(jié)節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞工程制藥動(dòng)物細(xì)胞工程制藥一、動(dòng)物細(xì)胞的全能性一、動(dòng)物細(xì)胞的全能性二、動(dòng)物細(xì)胞工程制藥中的轉(zhuǎn)基因與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)二、動(dòng)物細(xì)胞工程制藥中的轉(zhuǎn)基因與細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)第第3 3節(jié)節(jié) 植物細(xì)胞工程制藥植物細(xì)胞工程制藥一、植物細(xì)胞的特點(diǎn)一、植物細(xì)胞的特點(diǎn)二、植物細(xì)胞工程藥物研究二、植物細(xì)胞工程藥物研究三、植物細(xì)胞融合與核移植技術(shù)三、植物細(xì)胞融合與核移植技術(shù)四、轉(zhuǎn)基因植

2、物藥物技術(shù)四、轉(zhuǎn)基因植物藥物技術(shù)五、植物細(xì)胞培養(yǎng)工程五、植物細(xì)胞培養(yǎng)工程六、植物細(xì)胞的染色體工程六、植物細(xì)胞的染色體工程指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，法，按照需要和設(shè)計(jì)按照需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行，在細(xì)胞水平上進(jìn)行操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過功能，即通過細(xì)胞融合細(xì)胞融合、核質(zhì)移植核質(zhì)移植、染色染色體或基因移植體或基因移植及及組織和細(xì)胞培養(yǎng)組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，等方法，快速繁殖和培養(yǎng)新物種的生物工程技術(shù)?？焖俜敝澈团囵B(yǎng)新物種的生物工程技術(shù)。

3、核移植技術(shù)核移植技術(shù) 動(dòng)物核移植是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核動(dòng)物核移植是將動(dòng)物的一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核, ,移如入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞移如入一個(gè)已經(jīng)去掉細(xì)胞核的卵母細(xì)胞中中. .使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎使其重組并發(fā)育成一個(gè)新的胚胎, ,這個(gè)這個(gè)新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體新的胚胎最終發(fā)育為動(dòng)物個(gè)體. .黑面綿羊去黑面綿羊去核卵細(xì)胞核卵細(xì)胞白面綿羊乳白面綿羊乳腺細(xì)胞核腺細(xì)胞核細(xì)胞核移植細(xì)胞核移植重組細(xì)胞重組細(xì)胞電脈沖刺激電脈沖刺激早期胚胎早期胚胎胚胎移植胚胎移植另一頭綿羊的子宮另一頭綿羊的子宮妊娠、出生妊娠、出生克隆羊多利克隆羊多利1.1.克隆羊培育過程克隆羊培育過程19971997年多利年多

4、利體細(xì)胞核移植技術(shù)用于治療人類疾病體細(xì)胞核移植技術(shù)用于治療人類疾病核移植核移植 核移植：將一個(gè)細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)移到另一去核移植：將一個(gè)細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)移到另一去核的細(xì)胞中就是核移植，這是一項(xiàng)相當(dāng)精核的細(xì)胞中就是核移植，這是一項(xiàng)相當(dāng)精細(xì)的技術(shù)。細(xì)的技術(shù)。 細(xì)胞核移植的三個(gè)工作：細(xì)胞核移植的三個(gè)工作：（a）去掉原有的受精卵細(xì)胞核，）去掉原有的受精卵細(xì)胞核，（b）取得另一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，）取得另一個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞核，（c）重新植入新的細(xì)胞核。）重新植入新的細(xì)胞核。細(xì)胞器移植細(xì)胞器移植 即將細(xì)胞器從一個(gè)細(xì)胞中分離出來移入另即將細(xì)胞器從一個(gè)細(xì)胞中分離出來移入另一細(xì)胞中。一細(xì)胞中。目前已對(duì)葉綠體和目前已對(duì)葉綠體和線粒

5、體進(jìn)行了移植線粒體進(jìn)行了移植實(shí)驗(yàn)。人們已將葉實(shí)驗(yàn)。人們已將葉綠體移入雞卵中，綠體移入雞卵中，能成活能成活2727天，還有天，還有10%10%的光合能力。的光合能力。指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，法，按照需要和設(shè)計(jì)按照需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行，在細(xì)胞水平上進(jìn)行操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過功能，即通過細(xì)胞融合細(xì)胞融合、核質(zhì)移植核質(zhì)移植、染色染色體或基因移植體或基因移植及及組織和細(xì)胞培養(yǎng)組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，等方法，快速繁殖和培養(yǎng)新物種的生物工

6、程技術(shù)?？焖俜敝澈团囵B(yǎng)新物種的生物工程技術(shù)。染色體片段重組染色體片段重組“手術(shù)手術(shù)”與分與分離離 是指利用物理技術(shù)對(duì)基因的載體是指利用物理技術(shù)對(duì)基因的載體染色體染色體進(jìn)行進(jìn)行“手術(shù)手術(shù)”，使它斷裂與片段重組，以，使它斷裂與片段重組，以至對(duì)特定染色體的分離，為生物遺傳性狀至對(duì)特定染色體的分離，為生物遺傳性狀的轉(zhuǎn)移與改造、植物新品種開辟了新途徑的轉(zhuǎn)移與改造、植物新品種開辟了新途徑。 用用X X射線處理，斷裂染色體，將染色體上有射線處理，斷裂染色體，將染色體上有用的與無用的部分分開，形成片段，再通用的與無用的部分分開，形成片段，再通過易位、重組與選擇，獲得具有新染色體過易位、重組與選擇，獲得具有新染

7、色體片斷的重組類型。片斷的重組類型。 指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，法，按照需要和設(shè)計(jì)按照需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行，在細(xì)胞水平上進(jìn)行操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過功能，即通過細(xì)胞融合細(xì)胞融合、核質(zhì)移植核質(zhì)移植、染色染色體或基因移植體或基因移植及及組織和細(xì)胞培養(yǎng)組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，等方法，快速繁殖和培養(yǎng)新物種的生物工程技術(shù)?？焖俜敝澈团囵B(yǎng)新物種的生物工程技術(shù)。細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng) 是把這些細(xì)胞從體內(nèi)取出，然后接種在特是把這些細(xì)胞從體內(nèi)取出，然后

8、接種在特制的培養(yǎng)容器中，給予必要的生長條件，制的培養(yǎng)容器中，給予必要的生長條件，使它們?cè)隗w外繼續(xù)生長與增殖。使它們?cè)隗w外繼續(xù)生長與增殖。 細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的關(guān)鍵取決于兩個(gè)因細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的關(guān)鍵取決于兩個(gè)因素：一是營養(yǎng)，包括糖、氨基酸和維生素素：一是營養(yǎng)，包括糖、氨基酸和維生素等。培養(yǎng)不同的細(xì)胞需要不同成分的培養(yǎng)等。培養(yǎng)不同的細(xì)胞需要不同成分的培養(yǎng)基。二是生長環(huán)境，如特定的溫度、培養(yǎng)基。二是生長環(huán)境，如特定的溫度、培養(yǎng)液的酸堿度和無菌條件等。液的酸堿度和無菌條件等。 組織培養(yǎng)組織培養(yǎng) 是將取自動(dòng)物或植物體的小塊組織轉(zhuǎn)移到是將取自動(dòng)物或植物體的小塊組織轉(zhuǎn)移到該組織能在其中繼續(xù)生存并發(fā)揮功能的

9、人該組織能在其中繼續(xù)生存并發(fā)揮功能的人工環(huán)境中。工環(huán)境中。 被培養(yǎng)的組織可為單個(gè)細(xì)胞、一群細(xì)胞或被培養(yǎng)的組織可為單個(gè)細(xì)胞、一群細(xì)胞或器官的一部分或整個(gè)器官。器官的一部分或整個(gè)器官。 培養(yǎng)中的細(xì)胞可以繁殖，可以改變大小、培養(yǎng)中的細(xì)胞可以繁殖，可以改變大小、形態(tài)和功能，顯示特化的活動(dòng)或與其他細(xì)形態(tài)和功能，顯示特化的活動(dòng)或與其他細(xì)胞相互作用。胞相互作用。 組織培養(yǎng)首先將外植體分離出來，然后在組織培養(yǎng)首先將外植體分離出來，然后在無菌及適當(dāng)條件下培養(yǎng)以誘導(dǎo)出愈傷組織無菌及適當(dāng)條件下培養(yǎng)以誘導(dǎo)出愈傷組織，另外在愈傷組織隨外植體生長一段時(shí)間，另外在愈傷組織隨外植體生長一段時(shí)間后還需要進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以避免代謝

10、產(chǎn)物后還需要進(jìn)行繼代培養(yǎng)，以避免代謝產(chǎn)物積累及水分散失等因素的影響。積累及水分散失等因素的影響。 細(xì)胞培養(yǎng)可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、平板培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)可分為懸浮細(xì)胞培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、飼養(yǎng)層培養(yǎng)和雙層濾紙植板等幾類方式、飼養(yǎng)層培養(yǎng)和雙層濾紙植板等幾類方式。 組織培養(yǎng)技術(shù)在鑒定感染、酶缺陷、染色組織培養(yǎng)技術(shù)在鑒定感染、酶缺陷、染色體異常，分類腦腫瘤和設(shè)計(jì)及測(cè)驗(yàn)藥物和體異常，分類腦腫瘤和設(shè)計(jì)及測(cè)驗(yàn)藥物和疫苗方面已起了很大作用。疫苗方面已起了很大作用。 將取自孕婦的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可判定其體將取自孕婦的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可判定其體內(nèi)的胎兒是否存在與唐氏綜合癥有關(guān)的染內(nèi)的胎兒是否存在與唐氏綜合癥有關(guān)的染色體缺陷。色體缺

11、陷。 指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育指應(yīng)用現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方生物學(xué)、遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的理論和方法，法，按照需要和設(shè)計(jì)按照需要和設(shè)計(jì)，在細(xì)胞水平上進(jìn)行，在細(xì)胞水平上進(jìn)行操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和操作，重組細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變生物的結(jié)構(gòu)和功能，即通過功能，即通過細(xì)胞融合細(xì)胞融合、核質(zhì)移植核質(zhì)移植、染色染色體或基因移植體或基因移植及及組織和細(xì)胞培養(yǎng)組織和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，等方法，快速繁殖和培養(yǎng)新物種的生物工程技術(shù)?？焖俜敝澈团囵B(yǎng)新物種的生物工程技術(shù)。細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)一、概述一、概述細(xì)胞融合的發(fā)展細(xì)胞融合的發(fā)展 細(xì)胞融合是細(xì)胞融合是6060年代發(fā)展起來的一

12、門細(xì)胞工年代發(fā)展起來的一門細(xì)胞工程技術(shù)，它不僅在基礎(chǔ)研究中有重要的作程技術(shù)，它不僅在基礎(chǔ)研究中有重要的作用，而且在植物、微生物的改良，基因治用，而且在植物、微生物的改良，基因治療、疾病診治等應(yīng)用領(lǐng)域中展現(xiàn)著美好的療、疾病診治等應(yīng)用領(lǐng)域中展現(xiàn)著美好的前景。通過細(xì)胞融合得到淋巴細(xì)胞雜交瘤前景。通過細(xì)胞融合得到淋巴細(xì)胞雜交瘤制備單克隆抗體被譽(yù)為免疫學(xué)上的一次技制備單克隆抗體被譽(yù)為免疫學(xué)上的一次技術(shù)性革命。細(xì)胞融合已成為細(xì)胞工程中的術(shù)性革命。細(xì)胞融合已成為細(xì)胞工程中的核心技術(shù)。核心技術(shù)。 細(xì)胞融合細(xì)胞融合是指指人為地使兩種不同的生物是指指人為地使兩種不同的生物細(xì)胞在同一培養(yǎng)器中，用無性的人工方法細(xì)胞在

13、同一培養(yǎng)器中，用無性的人工方法進(jìn)行直接接觸，產(chǎn)生能同時(shí)具有兩個(gè)親本進(jìn)行直接接觸，產(chǎn)生能同時(shí)具有兩個(gè)親本細(xì)胞有益性狀的雜交細(xì)胞技術(shù)。細(xì)胞有益性狀的雜交細(xì)胞技術(shù)。 人工方法使兩個(gè)不同的細(xì)胞融合，發(fā)生體人工方法使兩個(gè)不同的細(xì)胞融合，發(fā)生體細(xì)胞雜交，形成新的雜種細(xì)胞。故有人稱細(xì)胞雜交，形成新的雜種細(xì)胞。故有人稱融合細(xì)胞為融合細(xì)胞為雜種細(xì)胞雜種細(xì)胞。 細(xì)胞融合過程可分成兩個(gè)階段：異核體階段細(xì)胞融合過程可分成兩個(gè)階段：異核體階段(heterokaryon)(heterokaryon)：異核體是指在融合細(xì)胞內(nèi)含：異核體是指在融合細(xì)胞內(nèi)含有來自兩個(gè)親本的細(xì)胞核。異核體中細(xì)胞核尚有來自兩個(gè)親本的細(xì)胞核。異核體中

14、細(xì)胞核尚未融合。雜種細(xì)胞形成：當(dāng)異核體同步進(jìn)入未融合。雜種細(xì)胞形成：當(dāng)異核體同步進(jìn)入有絲分裂后，核膜崩潰，來自兩個(gè)細(xì)胞核的染有絲分裂后，核膜崩潰，來自兩個(gè)細(xì)胞核的染色體結(jié)合在一起。融合細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)細(xì)胞色體結(jié)合在一起。融合細(xì)胞內(nèi)只含有一個(gè)細(xì)胞核，是由來自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因組組合在一核，是由來自兩個(gè)親本細(xì)胞的基因組組合在一起所形成的。此時(shí)的細(xì)胞就稱為雜種細(xì)胞。起所形成的。此時(shí)的細(xì)胞就稱為雜種細(xì)胞。發(fā)展史發(fā)展史 1838年年Muller第一個(gè)描述了脊椎動(dòng)物腫瘤細(xì)胞融第一個(gè)描述了脊椎動(dòng)物腫瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。 1907年，體外組織培養(yǎng)技術(shù)成功之后，人們觀察年，體外組織培

15、養(yǎng)技術(shù)成功之后，人們觀察到體外培養(yǎng)的細(xì)胞也能融合而形成多核巨細(xì)胞。到體外培養(yǎng)的細(xì)胞也能融合而形成多核巨細(xì)胞。 1958年，日本岡田善雄年，日本岡田善雄(Okada)用高濃度的仙臺(tái)用高濃度的仙臺(tái)病毒病毒(Sendai Virus)在體外成功地融合了在體外成功地融合了小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞后，細(xì)胞融合技術(shù)，得到迅小鼠艾氏腹水癌細(xì)胞后，細(xì)胞融合技術(shù)，得到迅速發(fā)展。速發(fā)展。 19601960年，法國的年，法國的BarskiBarski等首先發(fā)現(xiàn)不同類型的細(xì)等首先發(fā)現(xiàn)不同類型的細(xì)胞在混合培養(yǎng)過程中自發(fā)融合的現(xiàn)象胞在混合培養(yǎng)過程中自發(fā)融合的現(xiàn)象 19661966年，年，YerganianYerganian進(jìn)一

16、步用仙臺(tái)病毒獲得了能進(jìn)一步用仙臺(tái)病毒獲得了能夠增殖的雜種細(xì)胞。從此，人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的夠增殖的雜種細(xì)胞。從此，人工誘導(dǎo)細(xì)胞融合的方法，即被廣泛地用于種內(nèi)、種間、屬間、科間方法，即被廣泛地用于種內(nèi)、種間、屬間、科間、乃至動(dòng)、植物之間的雜種細(xì)胞的構(gòu)建，而迅速、乃至動(dòng)、植物之間的雜種細(xì)胞的構(gòu)建，而迅速發(fā)展成為一項(xiàng)無論在生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，或發(fā)展成為一項(xiàng)無論在生物學(xué)的基礎(chǔ)理論研究，或在工、農(nóng)、醫(yī)方面的應(yīng)用，均具有廣闊前景的細(xì)在工、農(nóng)、醫(yī)方面的應(yīng)用，均具有廣闊前景的細(xì)胞工程技術(shù)胞工程技術(shù) 。 7070年代，童第周在我國率先開展了這方面研究。年代，童第周在我國率先開展了這方面研究。二、細(xì)胞工程中遺傳物質(zhì)

17、的轉(zhuǎn)移途徑二、細(xì)胞工程中遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移途徑 細(xì)胞遺傳物質(zhì)包括：細(xì)胞核細(xì)胞遺傳物質(zhì)包括：細(xì)胞核DNADNA、細(xì)胞質(zhì)葉、細(xì)胞質(zhì)葉綠體綠體DNA DNA 、線粒體、線粒體DNADNA和質(zhì)粒和質(zhì)粒DNADNA 遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移方式：遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移方式：1.1.完整細(xì)胞之間的融合作用完整細(xì)胞之間的融合作用2.2.核體與完整細(xì)胞或胞質(zhì)體的融合作用核體與完整細(xì)胞或胞質(zhì)體的融合作用3.3.胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合作用胞質(zhì)體與完整細(xì)胞的融合作用4.4.脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞融合脂質(zhì)體介導(dǎo)的細(xì)胞融合5.5.微細(xì)胞與完整細(xì)胞的融合微細(xì)胞與完整細(xì)胞的融合6.6.生物大分子引入完整細(xì)胞生物大分子引入完整細(xì)胞誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)方式物理法

18、：電融合物理法：電融合化學(xué)法：化學(xué)法：PEGPEG融合融合生物法：生物法：滅活的病毒滅活的病毒仙臺(tái)病毒仙臺(tái)病毒紫外線紫外線喪失感染性喪失感染性（不感染細(xì)胞）（不感染細(xì)胞）保留融合活性保留融合活性 （誘導(dǎo)細(xì)胞融合）（誘導(dǎo)細(xì)胞融合）三、細(xì)胞融合的方法三、細(xì)胞融合的方法（常用范圍濃度（常用范圍濃度10%-60%10%-60%，分子量分子量 1000-60001000-6000）電融合電融合 電融合技術(shù)的原理：懸于大小不同的兩平電融合技術(shù)的原理：懸于大小不同的兩平行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在行電極間的低導(dǎo)電率溶液中的細(xì)胞，在1 1100MHz100MHz和和1001001000V/cm1000V

19、/cm的交流電場(chǎng)中，會(huì)的交流電場(chǎng)中，會(huì)沿電場(chǎng)方向排列成串，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)沿電場(chǎng)方向排列成串，此時(shí)再加上適當(dāng)強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖、即可使相鄰度和持續(xù)時(shí)間的高壓電脈沖、即可使相鄰細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電擊穿，從而觸細(xì)胞膜的接觸區(qū)產(chǎn)生可逆電擊穿，從而觸發(fā)細(xì)胞融合。發(fā)細(xì)胞融合。電融合技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) 1.只有小面積的細(xì)胞膜在電場(chǎng)的作用下產(chǎn)生暫時(shí)性的結(jié)構(gòu)變化。整個(gè)過程是在室溫和生理?xiàng)l件下進(jìn)行的，因此，不存在影響細(xì)胞活力的某些生理因素。 2.異核體能夠在光學(xué)顯微鏡下直接觀察、跟蹤、鑒定和收集培養(yǎng)，不要任何選擇介質(zhì) 3.若進(jìn)行大數(shù)量細(xì)胞融合能夠快速而又近似同步的方式進(jìn)行。 4雜交瘤產(chǎn)率相當(dāng)高。 5. 適用

20、廣泛，亦可用于酵母、植物原生質(zhì)體的融合。電融合突出的優(yōu)點(diǎn)是對(duì)數(shù)量很少的細(xì)胞進(jìn)行操作。缺點(diǎn) 最大的不利之處是儀器的購置；在融合大小不同的細(xì)胞時(shí)存在問題；在融合膜成分不同的細(xì)胞時(shí)存在困難。 利用空間微重力條件進(jìn)行細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)的目的，是利用在微重力條件下細(xì)胞在融合液中重力沉降現(xiàn)象消失，可以提高電融合雜種細(xì)胞得率和細(xì)胞活力。已在“神舟四號(hào)” 上的實(shí)驗(yàn)成功。在電融合的基礎(chǔ)上，加入生物素親和素介導(dǎo)的B細(xì)胞融合，稱為特異性細(xì)胞電融合?；瘜W(xué)融合 化學(xué)融合劑：它們主要包括聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、二價(jià)陽離子載體等。其中則以PEG的使用最為廣泛。PEG 的作用：1、PEG可能使細(xì)胞膜（尤其是有

21、絲分裂的骨髓瘤細(xì)胞）的脂類分子的物理結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，容易被PEG作用打開細(xì)胞膜，使細(xì)胞融合。2、PEG可能會(huì)把細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)分子排開，使脂質(zhì)體扦入與膜結(jié)合。3、PEG可能作用于膜磷脂極性基團(tuán)和細(xì)胞膜表面蛋白。使膜磷脂的表面電位下降，同時(shí)使膜糖蛋白的排阻體積減少，最終使膜出現(xiàn)缺口，進(jìn)而融合。 PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合的效果：同其分子量大小及濃度高低相關(guān)。常用分子量為10006000，濃度為30-50。PEG使細(xì)胞融合或致死的劑量界限很狹。須嚴(yán)格掌握PEG的處理時(shí)間。 懸浮法，處理1-2分鐘為宜。 離心法，先將細(xì)胞混合物懸于30-40的PEG中，再通過離心進(jìn)行融合，可適當(dāng)延長接觸時(shí)間，以5-8分鐘為宜。

22、隨后，均須立即加液稀釋，以及時(shí)終止PEG作用。 PEG溶液的pH對(duì)融合效果也有影響。一般pH7.4-8.0為宜。若輔以5-15的二甲亞砜或在融合前先用植物血凝素處理一下，則效果更好。病毒融合 最早被采用病毒融合劑有皰疹病毒、天花病毒和副粘液病毒等在內(nèi)的病毒類融合劑。滅活仙臺(tái)病毒介導(dǎo)細(xì)胞融合過程可以大大提高融合頻率。它在病毒類融合劑中最為有效，使用最廣。四、影響細(xì)胞融合的因素 影響因素包括：促融劑、細(xì)胞本身性狀、溫度、pH、離子強(qiáng)度及離子種類。1.親本細(xì)胞表面覆蓋絨毛較易融合，表面光滑規(guī)則難融合。2.融合時(shí)要適量氧存在。3.Ca2、Mg2 、 Mn2 等離子能促進(jìn)融合4.最佳溫度為37，最佳離子

23、濃度為0.1mol/L，最適pH為7.47.8.五、細(xì)胞融合中的問題1.提高雜種細(xì)胞形成率的措施 a控制適當(dāng)?shù)脑|(zhì)體的形成率（85) b.選擇S期親本細(xì)胞有利于形成異型雙核體 c.減小營養(yǎng)缺陷型親本細(xì)胞的生理效應(yīng)對(duì)雜種細(xì)胞的影響2.雜交瘤形成之后胞內(nèi)染色體的穩(wěn)定性。同一物種和親緣關(guān)系較近的物種細(xì)胞間形成的雜種通常相當(dāng)穩(wěn)定。 異種間形成的雜種細(xì)胞會(huì)發(fā)生染色體丟失（如人鼠雜種細(xì)胞到100-150個(gè)細(xì)胞世代，人染色體只剩1-3條才會(huì)穩(wěn)定） 措施:盡量多選擇雜種細(xì)胞;穩(wěn)定培養(yǎng)條件.六、雜種細(xì)胞的篩選原理 并非所有的細(xì)胞都能融合。細(xì)胞融合本身又帶有一定的隨機(jī)性，除不同親本細(xì)胞間的融合外，還伴有各親本細(xì)

24、胞的自身融合，需設(shè)法把含兩親本細(xì)胞染色體的雜種細(xì)胞分離或篩選出來。 最簡便的辦法無疑是應(yīng)用選擇培養(yǎng)基，使親本細(xì)胞死亡，而僅讓雜種細(xì)胞存活下來 已先后利用親本細(xì)胞的藥物抗體、營養(yǎng)缺陷型和溫度敏感性等遺傳標(biāo)記，建立了許多選擇系統(tǒng)，并成功地利用于雜種細(xì)胞的篩選。 主要有：藥物抗性篩選、營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)篩選等。1.抗藥性篩選系統(tǒng) 細(xì)胞突變后對(duì)某一種藥物的抗性顯著增加而形成的一種突變型。某一種藥物在達(dá)到一定濃度時(shí)，可以殺死野生型細(xì)胞。 在培養(yǎng)細(xì)胞藥物抗性突變型中研究得最為廣泛的藥物抗性是氮鳥嘌呤抗性。氮鳥嘌呤是一種鳥嘌呤類似物，當(dāng)培養(yǎng)基中含有這一藥物時(shí)，細(xì)胞就會(huì)由于其結(jié)構(gòu)與鳥嘌呤類似而利用這一藥物，將它摻入

25、到細(xì)胞自身的DNA中，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。 細(xì)胞內(nèi)參與這一反應(yīng)的一個(gè)重要酶稱為次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶。 2.營養(yǎng)互補(bǔ)選擇系統(tǒng) 利用細(xì)胞在合成某些低分子量代謝物(如氨基酸，嘌呤、嘧啶等）的能力缺陷，而難以在缺乏這些營養(yǎng)物的培養(yǎng)基中存活。 利用兩種親本細(xì)胞營養(yǎng)互補(bǔ)的作用原理篩選雜種細(xì)胞的方法稱為營養(yǎng)互補(bǔ)篩選系統(tǒng)3.利用物理特性、細(xì)胞的生長特性差異篩選細(xì)胞重編程細(xì)胞重編程(Renrogramming Cells) 指分化的細(xì)胞在特定的條件下被逆轉(zhuǎn)后恢指分化的細(xì)胞在特定的條件下被逆轉(zhuǎn)后恢復(fù)到全能性狀態(tài)復(fù)到全能性狀態(tài), 或者形成胚胎干細(xì)胞系或者形成胚胎干細(xì)胞系, 或者進(jìn)一步發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體的過程或

26、者進(jìn)一步發(fā)育成一個(gè)新的個(gè)體的過程“返老還童返老還童” 誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 iPS(induced pluripotent stem cells)干細(xì)胞（干細(xì)胞（stem cell ） 具有無限制自我更新能力、同時(shí)也可分化具有無限制自我更新能力、同時(shí)也可分化成特定組織的細(xì)胞，在細(xì)胞發(fā)育過程中處成特定組織的細(xì)胞，在細(xì)胞發(fā)育過程中處于較原始階段。于較原始階段。 包括：胚胎干細(xì)胞包括：胚胎干細(xì)胞 成體干細(xì)胞：上皮干細(xì)胞成體干細(xì)胞：上皮干細(xì)胞 造血干細(xì)胞造血干細(xì)胞 神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞 肌肉干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞 人體胚胎干人體胚胎干(hES)細(xì)胞細(xì)胞 優(yōu)點(diǎn)：有潛力在體內(nèi)發(fā)育成任何細(xì)胞類型優(yōu)點(diǎn)：

27、有潛力在體內(nèi)發(fā)育成任何細(xì)胞類型 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：(l)供體卵母細(xì)胞的來源困難供體卵母細(xì)胞的來源困難, ES細(xì)胞細(xì)胞建系效率低建系效率低(2)免疫排斥反應(yīng)免疫排斥反應(yīng)(3)ES細(xì)胞具有成瘤性細(xì)胞具有成瘤性(4)體外保持體外保持ES細(xì)胞全能性的條件非常復(fù)雜細(xì)胞全能性的條件非常復(fù)雜(5)倫理學(xué)爭論倫理學(xué)爭論iPS 通過通過基因轉(zhuǎn)染基因轉(zhuǎn)染技術(shù)技術(shù)(gene transfection)將某些將某些轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞導(dǎo)入動(dòng)物或人的體細(xì)胞, 使使體細(xì)胞體細(xì)胞直接直接重構(gòu)重構(gòu)成為成為胚胎干細(xì)胞胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell, ESC）細(xì)胞樣的）細(xì)胞樣的多潛能細(xì)胞多潛能細(xì)胞。

28、 iPS細(xì)胞不僅在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞不僅在細(xì)胞形態(tài)、 生長特性、生長特性、 干細(xì)干細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)等方面與胞標(biāo)志物表達(dá)等方面與ES細(xì)胞非常相似細(xì)胞非常相似, 而而且在且在DNA甲基化方式、甲基化方式、 基因表達(dá)譜、基因表達(dá)譜、 染色染色質(zhì)狀態(tài)、質(zhì)狀態(tài)、 形成嵌合體動(dòng)物等方面也與形成嵌合體動(dòng)物等方面也與ES細(xì)細(xì)胞幾乎完全相同。胞幾乎完全相同。 iPS優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 與經(jīng)典的胚胎干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植與經(jīng)典的胚胎干細(xì)胞技術(shù)和體細(xì)胞核移植技術(shù)不同，技術(shù)不同，iPS技術(shù)不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)技術(shù)不使用胚胎細(xì)胞或卵細(xì)胞，因此胞，因此沒有倫理學(xué)的問題沒有倫理學(xué)的問題。 利用利用iPS技術(shù)可以用病人自己的體細(xì)胞制備技術(shù)

29、可以用病人自己的體細(xì)胞制備專用的干細(xì)胞，所以專用的干細(xì)胞，所以不會(huì)有免疫排斥的問不會(huì)有免疫排斥的問題題。 iPS缺點(diǎn)缺點(diǎn) 比如，添加4個(gè)“重新編程”基因或取代疾病細(xì)胞中有缺陷基因的方法都可能有導(dǎo)致癌癥的副作用。轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子 ESCs含有誘導(dǎo)體細(xì)胞多能性的因子，這些多能性誘導(dǎo)含有誘導(dǎo)體細(xì)胞多能性的因子，這些多能性誘導(dǎo)因可能在維持因可能在維持ES多能性中起非常重要的作用。多能性中起非常重要的作用。 Takahashi等選擇了等選擇了3組多潛能性誘導(dǎo)因子：組多潛能性誘導(dǎo)因子： 第一組第一組是是特異性表達(dá)在特異性表達(dá)在ESCs的轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄因子，包括，包括Nanog，Oct3/4，Sox2，UT

30、F1，Sall4，Sox15 和和 Rex1；第二組第二組是是在在ESCs中起重要作用的生長和腫瘤相關(guān)的基因中起重要作用的生長和腫瘤相關(guān)的基因產(chǎn)物產(chǎn)物，包括，包括c-Myc，Stat3，-catenin，Grb2，KLF4，TCL1 and Eras；第三組第三組也是也是特異性表達(dá)在特異性表達(dá)在ESCs但功能仍不確定的因子但功能仍不確定的因子，包括包括ECAT1，ESG1，F(xiàn)bx15，DNMT3L，ECAT8，GDF3，ECAT151，ECAT152，F(xiàn)thl17 和和 Stella。同時(shí)建立了一套利用基因表達(dá)標(biāo)記檢測(cè)多潛能誘導(dǎo)作用同時(shí)建立了一套利用基因表達(dá)標(biāo)記檢測(cè)多潛能誘導(dǎo)作用的系統(tǒng)，檢測(cè)以

31、上誘導(dǎo)因子的作用。的系統(tǒng)，檢測(cè)以上誘導(dǎo)因子的作用。 iPS發(fā)展歷程發(fā)展歷程 2006年日本京都大學(xué)年日本京都大學(xué)中村彌伸 Shinya Yamanaka領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室在世界著名學(xué)術(shù)雜志領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室在世界著名學(xué)術(shù)雜志細(xì)胞細(xì)胞上率先報(bào)道了上率先報(bào)道了iPS的研究。的研究。 他們把他們把Oct3/4、Sox2、c-Myc和和Klf4這這4種轉(zhuǎn)錄種轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠胚胎或皮膚纖維母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)因子引入小鼠胚胎或皮膚纖維母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的可誘導(dǎo)其發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生的iPS細(xì)胞在形態(tài)、細(xì)胞在形態(tài)、基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞基因和蛋白表達(dá)、表觀遺傳修飾狀態(tài)、細(xì)胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生

32、成能力、分化倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等都與胚胎干細(xì)胞極為相似。能力等都與胚胎干細(xì)胞極為相似。 2007年年末，末，Thompson實(shí)驗(yàn)室和山中伸彌實(shí)驗(yàn)室?guī)讓?shí)驗(yàn)室和山中伸彌實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)報(bào)道乎同時(shí)報(bào)道，利用，利用iPS技術(shù)同樣可以誘導(dǎo)技術(shù)同樣可以誘導(dǎo)人人皮膚纖皮膚纖維母細(xì)胞成為幾乎與胚胎干細(xì)胞完全一樣的多能維母細(xì)胞成為幾乎與胚胎干細(xì)胞完全一樣的多能干細(xì)胞。干細(xì)胞。 所不同的是日本實(shí)驗(yàn)室依然采用了用所不同的是日本實(shí)驗(yàn)室依然采用了用逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒引入引入Oct3/4、Sox2、c-Myc和和Klf4 4種因子組合，種因子組合，而而Thompson實(shí)驗(yàn)室則采用了以實(shí)驗(yàn)室則采用了

33、以慢病毒載體慢病毒載體引入引入OCT4、SOX2加加NANOG和和LIN28這種因子組合。這種因子組合。 這些研究成果被美國這些研究成果被美國科學(xué)科學(xué)雜志列為雜志列為2007年十年十大科技突破中的第大科技突破中的第2位。位。 2008年，哈佛大學(xué)年，哈佛大學(xué)George Daley實(shí)驗(yàn)室利用誘導(dǎo)細(xì)實(shí)驗(yàn)室利用誘導(dǎo)細(xì)胞重新編程技術(shù)把采自胞重新編程技術(shù)把采自10種種不同遺傳病患者病人不同遺傳病患者病人的皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榈钠つw細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)閕PS，這些細(xì)胞將會(huì)在建立疾病，這些細(xì)胞將會(huì)在建立疾病模型、藥物篩選等方面發(fā)揮重要作用。模型、藥物篩選等方面發(fā)揮重要作用。 美國科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，美國科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)，iPS可在

34、適當(dāng)誘導(dǎo)條件下可在適當(dāng)誘導(dǎo)條件下定向定向分化分化，如變成血細(xì)胞，再用于治療疾病。，如變成血細(xì)胞，再用于治療疾病。 哈佛大學(xué)另一家實(shí)驗(yàn)室則發(fā)現(xiàn)利用病毒將哈佛大學(xué)另一家實(shí)驗(yàn)室則發(fā)現(xiàn)利用病毒將3種在細(xì)種在細(xì)胞發(fā)育過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠胰胞發(fā)育過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子引入小鼠胰腺外分泌細(xì)胞，可以直接使其轉(zhuǎn)變成與干細(xì)胞極腺外分泌細(xì)胞，可以直接使其轉(zhuǎn)變成與干細(xì)胞極為相似的細(xì)胞，并且可以分泌胰島素、有效降低為相似的細(xì)胞，并且可以分泌胰島素、有效降低血糖。這表明利用誘導(dǎo)重新編程技術(shù)血糖。這表明利用誘導(dǎo)重新編程技術(shù)可以直接獲可以直接獲得某一特定組織細(xì)胞，而不必先經(jīng)過誘導(dǎo)多能干得某一特定組織細(xì)胞，而

35、不必先經(jīng)過誘導(dǎo)多能干細(xì)胞這一步細(xì)胞這一步。 2009年，中國科學(xué)家于年，中國科學(xué)家于2008年年11月利用月利用iPS細(xì)胞培細(xì)胞培育出小鼠育出小鼠“小小小小” 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪研究員和上海交通大中國科學(xué)院動(dòng)物研究所周琪研究員和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院曾凡一研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究組合作完成的學(xué)醫(yī)學(xué)院曾凡一研究員領(lǐng)導(dǎo)的研究組合作完成的工作表明，工作表明，利用利用iPS細(xì)胞能夠得到成活的具有繁殖細(xì)胞能夠得到成活的具有繁殖能力的小鼠，從而在世界上第一次證明了能力的小鼠，從而在世界上第一次證明了iPS細(xì)胞細(xì)胞與胚胎干細(xì)胞具有相似的多能性與胚胎干細(xì)胞具有相似的多能性?？茖W(xué)家表示，?？茖W(xué)家表示，這一研究成果表明這一研