分析化學-毛細管電泳法

1、第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法第一節(jié)第一節(jié) 概述概述電泳電泳（Electrophoresis)是指溶液中帶電粒子在電場的作用下向與自身帶相反電荷的電極移動的現(xiàn)象。將電泳發(fā)展成為分離技術應歸功于Tiselius的工作。他于1937年建立“移界電泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地將人血清中的蛋白質分為白蛋白、和球蛋白，這項工作成為蛋白質化學發(fā)展的基礎，因此Tiselius本人榮獲1948年諾貝爾化學獎。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法 高效毛細管電泳高效毛細管電泳 經典電泳法散熱差，分離電壓受到限制。經典電泳法散熱差，分離電壓受到限

2、制。1981年，年，Jorgenson和和Lukacs發(fā)表了在毛細管電泳發(fā)展史上具有劃時代發(fā)表了在毛細管電泳發(fā)展史上具有劃時代意義的工作，他們采用意義的工作，他們采用75m內徑的石英毛細管做為分離室，紫外柱上內徑的石英毛細管做為分離室，紫外柱上檢測的方法，在檢測的方法，在30kv的分離電壓下分離丹?；被?，柱效達到的分離電壓下分離丹酰化氨基酸，柱效達到40萬萬個理論塔板。他們的工作為毛細管電泳的發(fā)展奠定了基礎。個理論塔板。他們的工作為毛細管電泳的發(fā)展奠定了基礎。James W. JorgensonNorth Illinois University化學系教授化學系教授第二十章第二十章 毛細管電

3、泳法毛細管電泳法第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法第二節(jié)第二節(jié) 基本理論基本理論一一. 電滲電滲u電滲（電滲（electroosmosis)是毛細管電泳分離理論中最基本的概是毛細管電泳分離理論中最基本的概念之一。念之一。 電滲電滲是指在電場作用下，毛細管中或固相多孔物質內，是指在電場作用下，毛細管中或固相多孔物質內，液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。電滲與固液兩相界面的雙電液體沿固體表面移動的現(xiàn)象。電滲與固液兩相界面的雙電層有著密切關系。層有著密切關系。 EEuosos4os電滲速度電滲速度uos以下式表示：以下式表示： 第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法u石英毛細管壁上的硅羥基在水石

4、英毛細管壁上的硅羥基在水溶液中發(fā)生電離，所產生的溶液中發(fā)生電離，所產生的SiO-負離子使毛細管壁帶負電負離子使毛細管壁帶負電荷。溶液中的抗衡離子靠靜電荷。溶液中的抗衡離子靠靜電吸附和分子擴散在固液界面上吸附和分子擴散在固液界面上形成雙電層（形成雙電層（electric double layer)，雙電層包括緊密層和，雙電層包括緊密層和擴散層。擴散層。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法HPLC由于壓差產生拋物線型的流體流速輪廓。電滲流的流速輪廓是由于壓差產生拋物線型的流體流速輪廓。電滲流的流速輪廓是一個平面，在毛細管中如同瓶塞一樣流動，不存在徑向的流速梯度。一個平面，在毛細管中如同瓶塞一

5、樣流動，不存在徑向的流速梯度。這是毛細管電泳分離柱效高于這是毛細管電泳分離柱效高于HPLC的原因之一。的原因之一。u在電場作用下，固液兩相間的相對運動發(fā)生在緊密層與擴散層之間的在電場作用下，固液兩相間的相對運動發(fā)生在緊密層與擴散層之間的滑動面上?；瑒用嫔稀Ｓ捎陔x子的溶劑化作用，當形成擴散層的離子在電場中移動時，攜帶由于離子的溶劑化作用，當形成擴散層的離子在電場中移動時，攜帶著液體一同移動，因此產生電滲流（著液體一同移動，因此產生電滲流（electroosmotic flow,EOF）第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法 緩沖液緩沖液pH對電滲流的影響對電滲流的影響隨著隨著pH的增大，石英

6、管壁表面的硅羥基的增大，石英管壁表面的硅羥基解離度增加，界面有效電荷密度增大，解離度增加，界面有效電荷密度增大，EOF隨之增大。隨之增大。陽離子型的表面活性劑使電滲流陽離子型的表面活性劑使電滲流發(fā)生反轉發(fā)生反轉 a.無表面活性劑存在；無表面活性劑存在；b陽離子表陽離子表面活性劑在毛細管壁表面的吸附，面活性劑在毛細管壁表面的吸附，抵消了原來的負電荷，使電滲遷移抵消了原來的負電荷，使電滲遷移率率0；c.繼續(xù)增大陽離子表面活性繼續(xù)增大陽離子表面活性劑的濃度，陽離子表面活性劑分子劑的濃度，陽離子表面活性劑分子通過非極性鏈疏水相互作用，在毛通過非極性鏈疏水相互作用，在毛細管柱表面形成雙分子層，使電滲細管

7、柱表面形成雙分子層，使電滲流反轉流反轉.u在緩沖液中在緩沖液中加入有機添加劑加入有機添加劑，如甲醇、，如甲醇、異丙醇等，或水溶性高分子物質，對異丙醇等，或水溶性高分子物質，對EOF也有較顯著的抑制作用。也有較顯著的抑制作用。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法u電泳電泳（electrophoresis）是指溶液中帶電粒子（離子）在電場）是指溶液中帶電粒子（離子）在電場中定向移動的現(xiàn)象。中定向移動的現(xiàn)象。u電泳遷移速度電泳遷移速度 uep 為為： 式中式中 電泳遷移率（電泳淌度）電泳遷移率（電泳淌度） （electrophoresis mobility)（m2/V.s） V毛細管柱兩端施加

8、的電壓毛細管柱兩端施加的電壓, L毛細管柱長毛細管柱長二二 . 電泳電泳LVEuepepepep 在空心毛細管中一個粒子的淌度可近似表示為：在空心毛細管中一個粒子的淌度可近似表示為： 4iep第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法三、表觀淌度三、表觀淌度Euuuoseffoseffap)（表觀淌度表觀淌度表觀遷移速度表觀遷移速度正離子正離子eff+osueff+ uos中性分子中性分子osuos負離子負離子eff-osueff - uos由于電滲流速度大大高于電泳速度，所以，不管正離子、負離子還是由于電滲流速度大大高于電泳速度，所以，不管正離子、負離子還是中性分子，均隨電滲流移動。中性分子

9、，均隨電滲流移動。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法u物物質在毛細管中的保留時間為質在毛細管中的保留時間為： Ld為毛細管柱進樣端至檢測窗口的距離（為毛細管柱進樣端至檢測窗口的距離（有效長度有效長度）VLLuLtapdapdm四、分離效率和譜帶展寬四、分離效率和譜帶展寬（一）理論板數(shù)和板高（一）理論板數(shù)和板高22/154. 5WtnmnLHd第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法22dLn 22dLn m22DtVLLuLtapdapdmDLVLn2dap毛細管電泳分離柱效方程毛細管電泳分離柱效方程u從分離柱效方程可知：從分離柱效方程可知：（1）分離電壓）分離電壓V, n（2）V一

10、定時，一定時，Ld/L , n（3）擴散系數(shù)）擴散系數(shù)D, n；大分子的；大分子的D小，故小，故CE對大分子分離柱效高。對大分子分離柱效高。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法（二）引起區(qū)帶展寬的因素（二）引起區(qū)帶展寬的因素1.1.分子擴散分子擴散2.2.焦耳熱焦耳熱 電流通過毛細管中的電解質溶液時會電流通過毛細管中的電解質溶液時會產生焦耳熱，使毛細管內及周圍溫度分布。產生焦耳熱，使毛細管內及周圍溫度分布。由于毛細管柱中沿徑向存在一個拋物線型的溫度梯度，由此引起介質的粘度在徑向上的梯度分布，進而引起徑向上的電泳速度梯度。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法3.3.吸附吸附產生原因產

11、生原因： （1）陽離子溶質和帶負電的管壁的離子相互作用陽離子溶質和帶負電的管壁的離子相互作用（2）疏水作用。）疏水作用。 對于生物大分子，對于生物大分子，如堿性蛋白和多肽等，吸附嚴重時可能導致測不如堿性蛋白和多肽等，吸附嚴重時可能導致測不到信號。因此，生物大分子分析時常需用涂層處理的毛細管柱。到信號。因此，生物大分子分析時常需用涂層處理的毛細管柱。 4.4.進樣進樣 （過載）（過載）5.5.電泳電泳樣品區(qū)帶與周圍電解質溶液間的電導率差，從而導致峰形展寬。樣品區(qū)帶與周圍電解質溶液間的電導率差，從而導致峰形展寬。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法u分離度是指將淌度相近的組分分離的能力分離度

12、是指將淌度相近的組分分離的能力 4)(2122112mmmmttWWttR分離度也可表示為柱效的函數(shù)：分離度也可表示為柱效的函數(shù)： uunR42/1oseffdeff241）（DLVLR討論討論：分離度是下列因素的函數(shù)：外加電壓：分離度是下列因素的函數(shù)：外加電壓V；有效柱長與總；有效柱長與總長度之比（長度之比（Ld/L）；電泳有效淌度差；電滲淌度）；電泳有效淌度差；電滲淌度 五、分離度五、分離度第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法第三節(jié)第三節(jié) 毛細管電泳的主要分離模式毛細管電泳的主要分離模式 u毛細管區(qū)帶電泳（毛細管區(qū)帶電泳（capillary zone electrophoresis，

13、CZE）u膠束電動色譜（膠束電動色譜（micellar electrokinetic chromatography, MEKC)u毛細管凝膠電泳（毛細管凝膠電泳（capillary gel electrophoresis, CGE)u毛細管等速電泳（毛細管等速電泳（capillary isotachophoresis, CITP)u 毛細管等電聚焦（毛細管等電聚焦（capillary isoelectric focus, CIF)u毛細管電色譜（毛細管電色譜（capillary electrochromatography, CEC)第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法一、毛細管區(qū)帶電泳（

14、一、毛細管區(qū)帶電泳（CZE）毛細管電泳最基本的分離模式。背景電解質是緩沖液，分離是基于樣品中毛細管電泳最基本的分離模式。背景電解質是緩沖液，分離是基于樣品中各個組分間質荷比的差異。有時需在緩沖液中加入一定的添加劑，用以提各個組分間質荷比的差異。有時需在緩沖液中加入一定的添加劑，用以提高分離選擇性，改變電滲流的大小、方向或抑制毛細管壁的吸附等。高分離選擇性，改變電滲流的大小、方向或抑制毛細管壁的吸附等。在在CZE中，影響分離的操作條件為：中，影響分離的操作條件為： 分離電壓分離電壓 背景電解質種類、濃度和背景電解質種類、濃度和pH 添加劑種類和濃度添加劑種類和濃度 第二十章第二十章 毛細管電泳法

15、毛細管電泳法u分離效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最佳工作分離效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最佳工作電壓。電壓。u在實際分離中，如果所用的毛細管很細或緩沖液的電導很低，在實際分離中，如果所用的毛細管很細或緩沖液的電導很低，極大電壓可能會超出儀器范圍，此時沒有最佳電壓，可選擇極大電壓可能會超出儀器范圍，此時沒有最佳電壓，可選擇儀器允許的最大輸出電壓。儀器允許的最大輸出電壓。u當毛細管較粗或緩沖液電導較高時，極大電壓可能很小，若當毛細管較粗或緩沖液電導較高時，極大電壓可能很小，若此時分離度很高，也可選擇大于極大值的電壓進行分離。此時分離度很高，也可選擇大于極大值的電壓進行分離。1

16、. 分離電壓分離電壓第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法u毛細管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。毛細管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。溫度選擇應考慮熱效應、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介溫度選擇應考慮熱效應、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質對溫度的限制等因素。質對溫度的限制等因素。u溫度的確定也應通過實驗，多數(shù)情況下，在溫度的確定也應通過實驗，多數(shù)情況下，在20203030之間之間進行電泳，能獲得良好的分離效果?？筛鶕?jù)初步分離結果進行電泳，能獲得良好的分離效果。可根據(jù)初步分離結果調整溫度。調整溫度。u不少糖類樣品需要高于室溫的分離環(huán)境，一些樣品如蛋白不少糖類樣品需

17、要高于室溫的分離環(huán)境，一些樣品如蛋白等則可能需要低于室溫的分離條件。等則可能需要低于室溫的分離條件。2.分離溫度分離溫度第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法對背景電解質的對背景電解質的要求要求：在所選擇的在所選擇的pH范圍內有足夠大的緩沖容量。范圍內有足夠大的緩沖容量。在檢測波長處的吸收低。在檢測波長處的吸收低。自身的淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產生。自身的淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產生。應使被測組分帶合適的電荷量，以實現(xiàn)有效進樣和有合適的電泳應使被測組分帶合適的電荷量，以實現(xiàn)有效進樣和有合適的電泳淌度。淌度。盡可能采用酸性緩沖溶液，在低盡可能采用酸性緩沖溶液，在低

18、pH下，吸附和電滲流值都很小。下，吸附和電滲流值都很小。與毛細管種類匹配，涂層毛細管只能在一定與毛細管種類匹配，涂層毛細管只能在一定pH范圍內使用范圍內使用。 3. 背景電解質背景電解質第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法 在在CZE中，中，常用于毛細管電泳的緩沖溶液有硼砂、磷酸鹽、常用于毛細管電泳的緩沖溶液有硼砂、磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和醋酸鹽等。檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和醋酸鹽等。 緩沖體系的緩沖體系的pH值要求與樣品的性質有關，通常酸性組分的分值要求與樣品的性質有關，通常酸性組分的分離選擇在堿性條件下進行，而堿性組分則選擇酸性介質分離，蛋離選擇在堿性條件下進行，而堿性組分則選擇酸性介

19、質分離，蛋白質、多肽、氨基酸等兩性物質，可選酸性白質、多肽、氨基酸等兩性物質，可選酸性(pH2)也可選堿性也可選堿性(pH9)分離介質。糖類樣品通常在分離介質。糖類樣品通常在pH911之間能獲得最佳分離，之間能獲得最佳分離，羧酸或其它樣品多在羧酸或其它樣品多在pH59之間選擇分離條件。之間選擇分離條件。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法upH的選擇也和毛細管種類有關，很多涂層毛細管只能在一的選擇也和毛細管種類有關，很多涂層毛細管只能在一定定pH范圍內使用，如聚丙烯酰胺涂層毛細管，只能在范圍內使用，如聚丙烯酰胺涂層毛細管，只能在pH49范圍內使用，否則涂層易水解失效。范圍內使用，否則涂層

20、易水解失效。u在相同的在相同的pH下，不同緩沖體系的分離效果可能相差很大，下，不同緩沖體系的分離效果可能相差很大，一般來說，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑可能是最好的。一般來說，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑可能是最好的。如分離糖類和如分離糖類和DNA等分子時優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因等分子時優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖體系，因為硼酸根能與糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負電荷和為硼酸根能與糖羥基形成配位鍵，從而增加糖的負電荷和分離度。硼酸鹽緩沖體系也適用于其它含鄰羥基或多羥基分離度。硼酸鹽緩沖體系也適用于其它含鄰羥基或多羥基的化合物分離。的化合物分離。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法 為了選擇合適的為

21、了選擇合適的pH值，需要值，需要pH調節(jié)劑調整介質的酸堿性。調節(jié)劑調整介質的酸堿性。由于多數(shù)緩沖試劑屬酸性物質，如磷酸，所以由于多數(shù)緩沖試劑屬酸性物質，如磷酸，所以pH調節(jié)劑主要是調節(jié)劑主要是堿類，常用的堿類，常用的pH調節(jié)劑有調節(jié)劑有NaOH、KOH、Tris等。有時也可考慮等。有時也可考慮用胺或醇胺等有機堿，如乙醇胺、乙二胺。如果緩沖試劑為堿類，用胺或醇胺等有機堿，如乙醇胺、乙二胺。如果緩沖試劑為堿類，則可用酸作為調節(jié)劑，盡量使用弱酸，如則可用酸作為調節(jié)劑，盡量使用弱酸，如 H3PO4。 緩沖劑及調節(jié)劑的濃度對改善分離、抑制吸附、控制焦耳熱緩沖劑及調節(jié)劑的濃度對改善分離、抑制吸附、控制焦耳

22、熱等均有影響，一般緩沖試劑的濃度控制在等均有影響，一般緩沖試劑的濃度控制在10200mmol/L，有，有時為了抑制蛋白質等的吸附作用，可用高達時為了抑制蛋白質等的吸附作用，可用高達500mmol/L的濃度的濃度（此時應減少分離電壓）。電導率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸（此時應減少分離電壓）。電導率高的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸鹽等，一般控制在鹽等，一般控制在20mmol/L，電導小的緩沖試劑如硼酸其濃度，電導小的緩沖試劑如硼酸其濃度可在可在100mmol/L以上。以上。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法 如果緩沖體系經各種參數(shù)優(yōu)化后仍無法給出良好的分離結果，如果緩沖體系經各種參數(shù)優(yōu)化后仍無法

23、給出良好的分離結果，可以加入添加劑以改善分離。添加劑種類較多：可以加入添加劑以改善分離。添加劑種類較多： 1.無機電解質（無機電解質（NaCl、KCl） 2.有機溶劑（如甲醇、乙腈）有機溶劑（如甲醇、乙腈） 3.非電解質高分子（纖維素、多糖、聚乙烯醇、非電解質高分子（纖維素、多糖、聚乙烯醇、Triton X-100) 4. 功能性添加劑（手性冠醚、環(huán)糊精等）功能性添加劑（手性冠醚、環(huán)糊精等） 第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法二、膠束電動色譜（二、膠束電動色譜（MEKC） 在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑（如在緩沖溶液中加入離子型表面活性劑（如SDSSDS），當表面活性劑濃度超過），當

24、表面活性劑濃度超過其臨界膠束濃度時，則形成親水膠束，膠束具有疏水內核其臨界膠束濃度時，則形成親水膠束，膠束具有疏水內核, , 外層帶負電荷。外層帶負電荷。溶質分子則在極性緩沖液與膠束中心的非極性相（溶質分子則在極性緩沖液與膠束中心的非極性相（假固定相假固定相）之間有一定的）之間有一定的分配。分配。中性分子因其本身疏水性不同，在兩相中分配存在差異。中性分子因其本身疏水性不同，在兩相中分配存在差異。在電滲流作在電滲流作用下，膠束攜帶溶質一起前行，疏水性強的溶質和膠束結合得較牢，流出慢。用下，膠束攜帶溶質一起前行，疏水性強的溶質和膠束結合得較牢，流出慢。不同分子在兩相中的分配差異是不同分子在兩相中的

25、分配差異是MECCMECC分離的基礎。分離的基礎。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法u常用的陰離子表面活性劑有十二烷基硫酸鈉（SDS）、N-月桂酰-N-甲基?；撬徕c（LMT）、?；敲撗跄懰徕c（STDC）等。u陽離子表面活性劑最常用的是季銨鹽，如十二烷基三甲基溴化銨（DTAB）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等。u非離子型表面活性劑有3-3-(氯化酰胺基丙基)二甲基胺基-1-丙基磺酸酯（CHAPS）等。u另外，還有手性表面活性劑，如膽酸、毛地黃皂苷、十二烷基-N-L-纈氨酸鈉等。 第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法表面活性劑選擇時應考慮以下因素：表面活性劑選擇時應考慮以下因素：

26、u（1）經濟易得）經濟易得u（2）水溶性好）水溶性好u（3）紫外吸收背景越低越好）紫外吸收背景越低越好u（4）不與樣品發(fā)生破壞性作用）不與樣品發(fā)生破壞性作用u（5）所形成的膠束足夠穩(wěn)定）所形成的膠束足夠穩(wěn)定第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法u碳鏈較短的陰離子表面活性劑為優(yōu)先選擇對象。碳鏈較短的陰離子表面活性劑為優(yōu)先選擇對象。SDS易得、紫外易得、紫外吸收低，最為常用。如經濃度、緩沖溶液及吸收低，最為常用。如經濃度、緩沖溶液及pH優(yōu)化，分離仍不佳，優(yōu)化，分離仍不佳，再換具有不同碳鏈長度或結構的其它陰離子表面活性劑。若結果再換具有不同碳鏈長度或結構的其它陰離子表面活性劑。若結果仍不好，應考

27、慮使用陽離子或中性、兩性表面活性劑，如仍不好，應考慮使用陽離子或中性、兩性表面活性劑，如CTAB（ 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 銨 ） 、（ 十 六 烷 基 三 甲 基 溴 化 銨 ） 、 T r i t o n X - 1 0 0 等 。等 。u應 注 意 ： 陽 離 子 表 面 活 性 劑 可 能 會 改 變 電 滲 流 方 向 。應 注 意 ： 陽 離 子 表 面 活 性 劑 可 能 會 改 變 電 滲 流 方 向 。u膠束修飾：添加重金屬離子可改變膠束表面的電荷數(shù)量；使用混膠束修飾：添加重金屬離子可改變膠束表面的電荷數(shù)量；使用混合表面活性劑可調節(jié)分離度或峰分布；加入另一種膠束，

28、如采用合表面活性劑可調節(jié)分離度或峰分布；加入另一種膠束，如采用多相體系（水膠束環(huán)糊精），利用多種作用改善分離。多相體系（水膠束環(huán)糊精），利用多種作用改善分離。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法三、毛細管電色譜（三、毛細管電色譜（CEC）u以微填充柱作為分離柱，以電滲流驅動流動相完成色以微填充柱作為分離柱，以電滲流驅動流動相完成色譜分離過程。譜分離過程。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法uCEC中，固定相的選擇主要依據(jù)中，固定相的選擇主要依據(jù)HPLC的理論和經驗，的理論和經驗，常用常用C18或或C8 。 u根據(jù)固定相的特性（正相、反相等），緩沖液可以是根據(jù)固定相的特性（正相、反相

29、等），緩沖液可以是水溶液或有機溶液。常用乙腈水或甲醇水等為流水溶液或有機溶液。常用乙腈水或甲醇水等為流動相。動相。 第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法毛細管分離條件選擇流程毛細管分離條件選擇流程1.盡可能多地了解樣品的類型、來源、組成及其性質。盡可能多地了解樣品的類型、來源、組成及其性質。2.根據(jù)樣品性質、來源選擇分離模式，若無樣品信息可先選根據(jù)樣品性質、來源選擇分離模式，若無樣品信息可先選CZE。3.根據(jù)樣品性質確定檢測方法。根據(jù)樣品性質確定檢測方法。4.確定確定pH、緩沖試劑濃度。、緩沖試劑濃度。5.優(yōu)化其它操作參數(shù)，如毛細管尺寸、分離電壓、溫度等。優(yōu)化其它操作參數(shù)，如毛細管尺寸、

30、分離電壓、溫度等。6.確定是否需要使用添加劑和非水溶劑。確定是否需要使用添加劑和非水溶劑。7.根據(jù)分離結果考慮是否換其它分離模式。根據(jù)分離結果考慮是否換其它分離模式。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法1.高壓電極槽和進樣機構 2.填灌清洗機構 3.毛細管 4.檢測器 5.鉑絲電極 6.低壓電極槽 7.恒溫系統(tǒng) 8.數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法對對CE的要求：的要求：進樣機構不存在死體積，能進行精確的進樣控制。進樣機構不存在死體積，能進行精確的進樣控制。需有毛細管清洗機構。需有毛細管清洗機構。高壓電源至少應能輸出高壓電源至少應能輸出200A25kV的功率。的

31、功率。檢測器盡量安裝在接地端，優(yōu)先考慮柱上紫外檢測方式。檢測器盡量安裝在接地端，優(yōu)先考慮柱上紫外檢測方式。 溫控范圍寬，以溫控范圍寬，以0 為界，越寬越好，上限不應低于為界，越寬越好，上限不應低于50 ，最好能，最好能達到達到6570 ，至少能在，至少能在2040內恒溫，恒溫精度應小于內恒溫，恒溫精度應小于0.2 。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法u高壓電源一般采用（高壓電源一般采用（030）kV連續(xù)可調的直流高壓電連續(xù)可調的直流高壓電源，電壓輸出精度應高于源，電壓輸出精度應高于1%。電極通常由直徑。電極通常由直徑0.5mm1mm的鉑絲制成。電極槽通常是帶螺帽的玻璃瓶的鉑絲制成。電極

32、槽通常是帶螺帽的玻璃瓶或塑料瓶（或塑料瓶（1ml5ml不等），以便于密封。不等），以便于密封。u儀器必須接地儀器必須接地，操作過程中必須注意高壓的安全保護。，操作過程中必須注意高壓的安全保護。 一、高壓電源一、高壓電源第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法二、毛細管二、毛細管1.尺寸尺寸 毛細管尺寸的選擇與分離模式和樣品有關。自由溶液電泳多選用毛細管尺寸的選擇與分離模式和樣品有關。自由溶液電泳多選用50或或75m內徑的毛細管，分離的有效長度?？刂圃趦葟降拿毠?，分離的有效長度常控制在40100cm之間。如進行之間。如進行大顆粒如紅細胞的分離，則需要內徑大于大顆粒如紅細胞的分離，則需要內徑大

33、于 300m的毛細管。的毛細管。CGE或或CEC的有效長度一般控制在的有效長度一般控制在20cm左右。左右。 2.2.涂層涂層 一般不需涂層處理。大分子化合物分離時，常常需要惰性管壁，以抑一般不需涂層處理。大分子化合物分離時，常常需要惰性管壁，以抑制吸附。做制吸附。做CIEFCIEF或或CGECGE時，需要涂層毛細管以抑制電滲。在分離中，有時時，需要涂層毛細管以抑制電滲。在分離中，有時為了加強電滲或改變其方向，也需要涂層毛細管。為了加強電滲或改變其方向，也需要涂層毛細管。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法3. 清洗清洗毛細管在使用過程可能被污染，從而影響分析的結果。為使測定具毛細管在使

34、用過程可能被污染，從而影響分析的結果。為使測定具有良好的重現(xiàn)性，毛細管在使用時應經常清洗。有良好的重現(xiàn)性，毛細管在使用時應經常清洗。空管通常用空管通常用 0.l1mol/L NaOH、水和緩沖液順序沖洗，各洗、水和緩沖液順序沖洗，各洗510min，或增加有機溶劑如甲醇清洗步驟，以除去管中的脂溶性，或增加有機溶劑如甲醇清洗步驟，以除去管中的脂溶性吸附組分。如果懷疑管內壁吸附有蛋白質或其他有機分子，可用吸附組分。如果懷疑管內壁吸附有蛋白質或其他有機分子，可用0.l1mol/L的的HNO3洗洗 510min，然后再按常規(guī)清洗。，然后再按常規(guī)清洗。兩次分析之間，可用運行緩沖液清洗、平衡。兩次分析之間，

35、可用運行緩沖液清洗、平衡。 第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法三、進樣系統(tǒng)三、進樣系統(tǒng)毛細管通道十分細小，所需樣品不過數(shù)毛細管通道十分細小，所需樣品不過數(shù)nl，所以不能采用色譜的，所以不能采用色譜的進樣方式。通過讓毛細管與樣品溶液直接接觸，然后由重力、電進樣方式。通過讓毛細管與樣品溶液直接接觸，然后由重力、電場力或其它動力來驅動樣品進入管中。進樣量可以通過控制驅動場力或其它動力來驅動樣品進入管中。進樣量可以通過控制驅動力的大小或時間長短來控制。進樣系統(tǒng)必須包括動力控制、計時力的大小或時間長短來控制。進樣系統(tǒng)必須包括動力控制、計時控制、電極槽或毛細管移位控制等機構?？刂啤㈦姌O槽或毛細管移

36、位控制等機構。 進樣方式進樣方式： 電動法電動法 壓力法壓力法 擴散法擴散法第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法電動進樣電動進樣u當把毛細管的進樣端插入樣品溶液并加上電場時，組分就會因電當把毛細管的進樣端插入樣品溶液并加上電場時，組分就會因電遷移和電滲作用而進入管內。遷移和電滲作用而進入管內。u電動進樣的控制參數(shù)是電場強度電動進樣的控制參數(shù)是電場強度E和進樣時間和進樣時間t。電場強度。電場強度E取值多取值多在在160kv/60cm 之間；進樣時間通常在之間；進樣時間通常在110s 之間，有時可達之間，有時可達1min或更大?；蚋蟆優(yōu)點優(yōu)點：電動進樣對毛細管內的填充介質沒有特殊限制，屬

37、普適性：電動進樣對毛細管內的填充介質沒有特殊限制，屬普適性方法，可實現(xiàn)自動化操作。方法，可實現(xiàn)自動化操作。u缺點缺點：電動進樣對離子組分存在偏向，電遷移速度快的進樣多，：電動進樣對離子組分存在偏向，電遷移速度快的進樣多，電遷移速度小的少進甚至不進，這會降低分析的準確性和可靠性。電遷移速度小的少進甚至不進，這會降低分析的準確性和可靠性。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法壓力進樣壓力進樣u也稱流動進樣，它要求毛細管中的填充介質具有流動性。當毛細管兩也稱流動進樣，它要求毛細管中的填充介質具有流動性。當毛細管兩端置于不同的壓力環(huán)境中時，管中溶液即能流動，將樣品帶入。端置于不同的壓力環(huán)境中時，管

38、中溶液即能流動，將樣品帶入。u可用三種方法產生進樣動力：正壓、負壓（管尾抽吸）、重力（虹可用三種方法產生進樣動力：正壓、負壓（管尾抽吸）、重力（虹吸）。吸）。u采用壓縮空氣（氣體鋼瓶）可實現(xiàn)正壓進樣，并可與毛細管清洗系統(tǒng)采用壓縮空氣（氣體鋼瓶）可實現(xiàn)正壓進樣，并可與毛細管清洗系統(tǒng)共用，多為商品儀器采用。共用，多為商品儀器采用。u優(yōu)點：優(yōu)點：壓力進樣沒有偏向問題，壓力進樣沒有偏向問題，u缺點：缺點：選擇性差，樣品及其背景同時被引入選擇性差，樣品及其背景同時被引入 管中，對后續(xù)分離可能產生影響。管中，對后續(xù)分離可能產生影響。第二十章第二十章 毛細管電泳法毛細管電泳法擴散進樣擴散進樣u利用濃度差擴散原理，當將毛細管插入樣品溶液時，樣品分子因在管利用濃度差擴散原理，當將毛細管插入樣品溶液時，樣品分子因在管口界面存在濃度差而向管內擴散。擴散進樣動力屬不可控制參數(shù)，進口界面存在濃度差而向管內擴散。擴散進樣動力屬不可控制參數(shù)，進樣量僅由擴散時間控制。對于利用電動和壓力進樣的系統(tǒng)，設置電場樣量僅由擴散時間控制。對于利用電動和壓力進樣的系統(tǒng)，設置電場或壓力差為零，即可實現(xiàn)擴散進樣。擴散進樣時間一般在或壓力差為零，即可實現(xiàn)擴散進樣。擴散進樣時間一般在1060s。擴散進樣對管內介質沒有任何限制，屬普適性進樣方法。擴散進樣對管內介質沒有任何