無抗生素選擇系統(tǒng)綜述

1、無抗生素選擇系統(tǒng)的發(fā)展現(xiàn)狀摘 要在我國，濫用抗生素的現(xiàn)象十分普遍，導(dǎo)致抗生素耐受基因基因的泛濫。其實，不止抗生素的濫用，在一些食品菌的生產(chǎn)、質(zhì)粒DNA的生產(chǎn)、DNA疫苗的生產(chǎn)等多方面都會使用含抗生素的選擇系統(tǒng)，這些都會導(dǎo)致抗生素耐受基因的傳播。尤其是在生物藥品領(lǐng)域，一種含有抗生素耐受基因載體的重組生物藥物是完全不可取的，因此，無抗生素選擇系統(tǒng)的發(fā)展是勢在必行的。本文簡介了無抗生素選擇系統(tǒng)的發(fā)展現(xiàn)狀。關(guān)鍵詞：無抗生素選擇；耐受基因；DNA疫苗；質(zhì)粒DNA；重組The development of Antibiotic-free selection systemAbstract In China,

2、 the widespread abuse of antibiotics leads to the spread of antibiotic resistance genes. In fact,not only the abuse of antibiotics, some bacteria in food production, the production of plasmid DNA and DNA vaccine,all of them will use the antibiotic selection system which can lead to the spread of ant

3、ibiotic resistance genes. Especially, in the field of bio-medicine, an recombinant biological drug containing antibiotic resistance gene vector is unacceptable totally, and therefore, the development of antibiotic-free selection system is imperative. This article introduced the development of the an

4、tibiotic-free selection systems.Keywords：antibiotic-free selection;Tolerance gene; DNA Vaccine; Plasmid DNA; Restructuring前言細(xì)菌的每一種耐藥機(jī)制都由不同的耐藥基因所控制，這些耐藥基因可由突變產(chǎn)生，也可以通過增殖過程垂直傳播，或者通過質(zhì)粒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子等可移動的遺傳物質(zhì)在相同或不同種屬細(xì)菌間水平傳播。環(huán)境中細(xì)菌耐藥基因的存在和抗菌藥物的使用是影響細(xì)菌耐藥性形成和發(fā)展的兩個主要因素?？股啬退幮曰虻耐耆笔谴_保在環(huán)境中抗生素抗性基因不傳播或轉(zhuǎn)化到致病菌株中產(chǎn)生抗性的唯一

5、方法1。目前已經(jīng)試驗成功的無抗生素選擇系統(tǒng)主要在DNA疫苗和基因藥物、食品菌和轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)研究等方面。技術(shù)方法1.DNA疫苗和基因藥物DNA疫苗和基因藥物正在成為一種重要的藥品類，然而，這種從細(xì)菌質(zhì)粒衍生出來的藥物在質(zhì)粒DNA的分離純化方面一直是工業(yè)化生產(chǎn)的難題，而且由于各種理論安全問題，監(jiān)管機(jī)構(gòu)一直不建議使用抗生素抗性標(biāo)記的DNA疫苗。因此，新的無抗生素選擇系統(tǒng)的研發(fā)已經(jīng)勢在必行。1.1自溶系統(tǒng)分離質(zhì)粒DNA為了解決DNA疫苗在下游純化方面的難題，Aaron E. Carnes等人研發(fā)了一種新穎的宿主菌株在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)噬菌體內(nèi)溶素的自溶大腸桿菌系統(tǒng)。這種系統(tǒng)在發(fā)酵過程中通過熱誘導(dǎo)啟動子誘

6、導(dǎo)表達(dá)內(nèi)溶素。內(nèi)溶素保留在細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞壁中肽聚糖基板上分離；因此細(xì)胞保持完好，可用通常的方法收獲。然后回收的質(zhì)粒DNA在微酸性環(huán)境下自溶提取，低鹽緩沖液條件下用低濃度的無離子型去垢劑處理。在這些條件下，大腸桿菌的基因組DNA與不溶性的細(xì)胞碎片仍連在一起，然后由固液分離法分理出質(zhì)粒DNA2。1.2 利用RNA-OUT的系統(tǒng) 為了解決DNA疫苗的抗生素安全問題，Luke等人3提出了一種新方法，此方法設(shè)計并合成抗原基因克隆到RNA-OUT上編碼無抗生素DNA疫苗載體，同時優(yōu)化提高蛋白的表達(dá)和免疫原性，以替代其他卡那霉素抗性的載體。其簡要過程為，首先在抗原免疫反應(yīng)背景下考慮抗原靶向問題，其方法為通

7、過主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類或II類基因指導(dǎo)抗原表達(dá)；例如ntc868系列RNA-OUT載體系統(tǒng)允許同時克隆到多個載體細(xì)胞內(nèi)的不同的轉(zhuǎn)基因目的地上。然后設(shè)計密碼子優(yōu)化和基因合成的詳細(xì)流程圖。最后就是克隆轉(zhuǎn)基因到NTC868系列RNA-OUT載體系統(tǒng)上。最后得到的無抗生素DNA疫苗載體是更有效的卡那霉素抗性標(biāo)記編碼載體的安全替代品。1.3基于營養(yǎng)缺陷型的新型無抗生素選擇系統(tǒng) 1.3.1NAD合成缺陷系統(tǒng)針對抗生素選擇系統(tǒng)的安全問題，不同類型的無抗生素選擇系統(tǒng)被不斷突出，其中，Dong, WR等人4提出了一種新型營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)系統(tǒng),可以在無抗生素使用的情況下有效地選擇宿主細(xì)胞和質(zhì)粒。其基本

8、流程為，在一個大腸桿菌菌株中的染色體上移除喹啉酸尿嘧啶磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(QAPRTase)基因，這樣大腸桿菌就攜帶了NAD合成缺陷基因。質(zhì)粒中的抗性基因被大腸桿菌的QAPRTase基因取代。結(jié)果,只有表達(dá)了QAPRTase基因的大腸桿菌宿主細(xì)胞可以在基本培養(yǎng)基上生長繁殖。這是第一次一個脊椎動物基因被用于構(gòu)造無抗生素選擇系統(tǒng),并且它可以廣泛應(yīng)用于DNA疫苗和基因治療。QAPRTase基因廣泛存在于從細(xì)菌到哺乳動物的不同物種當(dāng)中，因此基因的水平轉(zhuǎn)移引起的潛在的環(huán)境生物安全問題可以被消除。1.3.2甘氨酸營養(yǎng)缺陷型互補(bǔ)選擇系統(tǒng) Vidal, L 等人5在2008年提出了一種基于甘氨酸營養(yǎng)缺陷

9、型互補(bǔ)原理在大腸桿菌中構(gòu)建重組質(zhì)粒來替代抗生素選擇標(biāo)記的方法。利用PCR方法構(gòu)建一個大腸桿菌M15衍化物的甘氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株。這個菌株包含了一個缺失的甘氨酸基因，該基因編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶，這是一種在大腸桿菌甘氨酸主生物合成途徑中的酶。同時構(gòu)建一個在弱啟動子P3控制下的含有甘氨酸同源基因的pQErham質(zhì)粒，這樣就成功構(gòu)建了一個互補(bǔ)系統(tǒng)，該系統(tǒng)允許轉(zhuǎn)話體生長在基本培養(yǎng)基中而不需要補(bǔ)充甘氨酸，成功的替代了抗生素選擇標(biāo)記系統(tǒng)。2.食品菌 在目前形形色色的食品菌當(dāng)中，乳酸菌是一類生產(chǎn)應(yīng)用非常廣泛的食品菌。作為一種安全型(GRAS)微生物，乳酸菌已經(jīng)被應(yīng)用于大量表達(dá)一些有價值的酶、抑菌素、次級代謝

10、產(chǎn)物。但是應(yīng)用于乳酸菌的質(zhì)粒載體常帶有一些氯霉素、紅霉素等抗生素抗性基因，帶來較大的生物安全隱患，美國FDA等權(quán)威機(jī)構(gòu)禁止對GRAS微生物使用抗生素類抗性標(biāo)記，因此，乳酸菌非抗生素抗性選擇標(biāo)記已成為該領(lǐng)域研究的熱點。目前已經(jīng)研究出了多種不同類型的無抗生素選擇系統(tǒng)，根據(jù)篩選時質(zhì)粒和受體菌之間的表型關(guān)系及特征，可分為顯性選擇標(biāo)記、互補(bǔ)性選擇標(biāo)記、顯性/互補(bǔ)型選擇標(biāo)記和雙質(zhì)粒選擇標(biāo)記6。顯性選擇標(biāo)記是通過轉(zhuǎn)入帶有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，賦予受體菌新的特性，使其能夠在相應(yīng)的選擇壓力下生長繁殖，從而達(dá)到篩選轉(zhuǎn)化子的目的。在乳酸菌分子技術(shù)的非抗生素抗性標(biāo)記的相關(guān)研究中主要涉及了細(xì)菌素類、重金屬抗性、熱激蛋白三

11、大類顯性選擇標(biāo)記7?；パa(bǔ)型非抗生素抗性質(zhì)粒選擇標(biāo)記的受體菌株通常帶有代謝途徑相關(guān)基因的突變，導(dǎo)致突變株在基本培養(yǎng)基上不能生長，只有補(bǔ)充相應(yīng)的外源營養(yǎng)物質(zhì)或是轉(zhuǎn)入含有特定選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，菌株才能生存。研發(fā)成功的主要有糖類營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)型選擇標(biāo)記、胸甘酸營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)型選擇標(biāo)記和嘌呤、嘧啶營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)型選擇標(biāo)記8。顯性/互補(bǔ)型選擇標(biāo)記，就是既可以作為顯性也可以作為互補(bǔ)型的選擇標(biāo)記.，主要有-半乳糖苷酶選擇標(biāo)記和D-丙氨酸消旋酶選擇標(biāo)記9。雙質(zhì)粒選擇標(biāo)記系統(tǒng)含有兩種質(zhì)粒，一種是帶有所要表達(dá)基因的獨立復(fù)制型質(zhì)粒，另一種是帶有抗生素選擇標(biāo)記的非獨立復(fù)制型質(zhì)粒，它必須在抗生素選擇壓力下才能復(fù)制并穩(wěn)定存在。

12、因此，先在抗生素選擇壓力下篩選出轉(zhuǎn)化子，再去掉抗生素選擇壓力，使帶有抗生素抗性標(biāo)記基因的質(zhì)粒從菌株中消失，保證了菌株中所有的基因元件無抗生素抗性基因10。3.轉(zhuǎn)基因植物的生產(chǎn)和研究3.1甘露糖選擇系統(tǒng)轉(zhuǎn)基因植物在遺傳轉(zhuǎn)化的時候轉(zhuǎn)化率比較低，所以必須使用選擇標(biāo)記來確保轉(zhuǎn)化細(xì)胞的存活并防止非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生?，F(xiàn)在的選擇方法大都含有卡那霉素、新霉素等抗生素，但由于這些抗生素對人類和環(huán)境的影響還未知，所以這些抗生素的使用備受關(guān)注。而無抗生素選擇系統(tǒng)的一般方法大都為:將植物組織培養(yǎng)在含營養(yǎng)元素復(fù)合物、維生素和生長激素的豐富培養(yǎng)基上，以維持供試外植體的生長，使非轉(zhuǎn)化組織在缺乏選擇劑的情況下與轉(zhuǎn)化組織一樣生長

13、;在使用選擇試劑時，轉(zhuǎn)化組織能正常生長，非轉(zhuǎn)化組織則不能生長。根據(jù)這種思路研究出了甘露糖選擇系統(tǒng)：露糖不能維持各種外植體的生長。當(dāng)培養(yǎng)植物細(xì)胞添加甘露糖時，它只被轉(zhuǎn)化為6-磷酸甘露糖，不能進(jìn)一步參與代謝而積累至毒性水平，克隆編碼6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶的基因作為選擇基因構(gòu)建表達(dá)載體，用甘露糖作選擇劑，選擇基因編碼的6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶則可將6-磷酸甘露糖轉(zhuǎn)化為易于糖酵解的6-磷酸果糖11。這種甘露糖選擇系統(tǒng)在甜菜、玉米中得到成功。而馬鈴薯、番茄和煙草可以用木糖作為選擇劑。3.2煙草根部的外源基因表達(dá)系統(tǒng)抗生素抗性標(biāo)記的需要、轉(zhuǎn)基因識別困難及其高水平表達(dá)是植物快速生產(chǎn)重組蛋白的主要障礙。一種替代的方

14、法生產(chǎn)無抗生素抗性選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物是依靠農(nóng)桿菌的根增值基因(rol 基因)的表型選擇的。用農(nóng)桿菌攜帶著連接了rol基因集群的pRYG轉(zhuǎn)化載體，侵染宿主，最后用毛狀根作為選擇標(biāo)記的表型。用此種方法可以解決抗生素抗性標(biāo)記的需要和轉(zhuǎn)基因的高水平表達(dá)問題12?？偨Y(jié)展望抗生素選擇系統(tǒng)由于其生物安全隱患問題，正在逐漸被其他無抗生素選擇系統(tǒng)取代，無抗生素選擇系統(tǒng)的研發(fā)正在蓬勃發(fā)展，各種新穎巧妙的的新方法途徑在不斷被提出來，改變了現(xiàn)在使用抗生素進(jìn)行選擇的格局，是今后生物制藥及生物制品的一大趨勢。參考文獻(xiàn)1Peubez I, Chaudet N, Mignon C, et al.Antibiotic-fre

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