第五章蛋白質(zhì)組研究方法概論

1、 第三章第三章 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì) 組研究方法概論組研究方法概論 一、三大基本技術(shù)一、三大基本技術(shù) 三大基本技術(shù)的功能：三大基本技術(shù)的功能：1D、2D電泳（色譜）技術(shù)電泳（色譜）技術(shù)-分離分離 計(jì)算機(jī)輔助圖象處理技術(shù)計(jì)算機(jī)輔助圖象處理技術(shù)-識(shí)別識(shí)別 生物質(zhì)譜技術(shù)生物質(zhì)譜技術(shù)-鑒定鑒定pH3 10MW 100Kd10Kd2D map of HL-60 cell treated with ATRAZoom gel469113107622周齡胎肝周齡胎肝 2-DE 圖譜圖譜3104.55.54.55.5466.55窄范圍膠條雙向電泳圖譜窄范圍膠條雙向電泳圖譜RH20和和RH35之間差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)之間差異

2、表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)MS鑒定：鑒定：1287212872Subunit Identification by MALDI-TOF MSJing 411(N, 7+8, 2+12)Single Subunit Identification by MALDI-TOF MSPMF of Emmer 87(1Ax 2.1*)1Ax 2.1*Single Subunit Identification by MALDI-TOF MSPMF of Emmer 87(1Bx 17*)1Bx 17*DNA與蛋白質(zhì)分析方法比較與蛋白質(zhì)分析方法比較二、蛋白質(zhì)組研究的基本思路與策略二、蛋白質(zhì)組研究的基本思路與策略基因組基因組(

3、genome = gene + chromosome): 生物體所擁有的全套染色體上的全部基因生物體所擁有的全套染色體上的全部基因轉(zhuǎn)錄組轉(zhuǎn)錄組(transcriptome=transcript + genome): 一種細(xì)胞、組織或生物體完整基因組所對(duì)應(yīng)的一種細(xì)胞、組織或生物體完整基因組所對(duì)應(yīng)的全套全套mRNA蛋白質(zhì)組蛋白質(zhì)組(proteome = protein + genome): 一種細(xì)胞、組織或生物體完整基因組所對(duì)應(yīng)的一種細(xì)胞、組織或生物體完整基因組所對(duì)應(yīng)的全套蛋白質(zhì)全套蛋白質(zhì)l表達(dá)蛋白質(zhì)組表達(dá)蛋白質(zhì)組(compositional proteomics) Human Plasma Pr

4、oteome, Human Liver Proteome Yeast Proteome Database (YPD, 6145 proteins) l差異蛋白質(zhì)組差異蛋白質(zhì)組(comparative proteomics) Disease proteome Pharmaceutical proteome l基本生物學(xué)問題基本生物學(xué)問題Post-translational modificationProtein-protein interactionl臨床應(yīng)用問題臨床應(yīng)用問題Disease marker-diagnosisDrug target-therapy l Profiling l Ide

5、ntificationl Quantificationl Localizationl Modificationl Interactionl ActivitiesFunction蛋白質(zhì)組總體研究方案蛋白質(zhì)組總體研究方案Image AnalysisDatabase Built SampleCell or TissueDatabaseSearchingProteinCharacterizationPMFEndoproteinaseDigestion MALDI/TOF/MSPeptide mixture2D-GelPSD/MALDI/TOF/MSESI/MS/MSPeptideSequence Ta

6、gsPeptide LadderSequenceSchematic Overview of Proteome Analysis Based 2DEPost-translationalmodification蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線流程圖蛋白質(zhì)組研究技術(shù)路線流程圖數(shù)據(jù)庫一次檢索數(shù)據(jù)庫一次檢索未知蛋白未知蛋白已知蛋白已知蛋白翻譯后修飾鑒定翻譯后修飾鑒定PSD-MALDI-MSPSD-MALDI-MSESI-MS-MSESI-MS-MS肽序列測(cè)定肽序列測(cè)定數(shù)據(jù)庫二次檢索數(shù)據(jù)庫二次檢索蛋白質(zhì)鑒定蛋白質(zhì)鑒定凝膠圖象分析凝膠圖象分析（蛋白質(zhì)作圖（蛋白質(zhì)作圖基因產(chǎn)物作圖基因產(chǎn)物作圖蛋白質(zhì)表達(dá)水平的分析蛋白質(zhì)表達(dá)

7、水平的分析）膜轉(zhuǎn)印膜轉(zhuǎn)印生物樣品生物樣品SDS-PAGE + HPLCSDS-PAGE + HPLC2D-PAGE2D-PAGEMALDI-TOF-MSMALDI-TOF-MS精確分子量精確分子量酶酶 解解羧肽酶酶解羧肽酶酶解Edman降解降解氨基酸分析氨基酸分析肽混合物肽混合物MALDI-MSMALDI-MS肽指紋圖肽指紋圖PMFPMFN-端序列端序列C-端序列端序列蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫Global Protein AnalysisDifferential Proteome Analysis Disease Control Analytical 2-DE Analytical 2-DES

8、ubtractive AnalysisVariation, Additional spots, Missing spots, Intensity differencesPreparative 2-DEIn-gel digestionPeptide mixtureMALDI-TOF-MS, ESI-MS-MSPMF, SequencingDatabase searchingIdentity of the query protein, Function of protein Gene knock-out, transfection Yeast two-hybrid Immunohistochemi

9、stryPeptide synthesis Gene Protein-protein interaction Protein localization AntibodyProteome database三、蛋白質(zhì)組研究新技術(shù)三、蛋白質(zhì)組研究新技術(shù) 同位素編碼親和標(biāo)簽技術(shù)同位素編碼親和標(biāo)簽技術(shù) （用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究）（用于定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究） isotope-coded affinity tags, ICATisotope-coded affinity tags, ICAT 雙色熒光技術(shù)雙色熒光技術(shù) 酵母雙雜交技術(shù)酵母雙雜交技術(shù)（蛋白質(zhì)（蛋白質(zhì)- -蛋白質(zhì)相互作用研究）蛋白質(zhì)相互作用研究）

10、蛋白質(zhì)復(fù)合物免疫分離與質(zhì)譜鑒定技術(shù)蛋白質(zhì)復(fù)合物免疫分離與質(zhì)譜鑒定技術(shù) 多維色譜多維色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù) 蛋白質(zhì)翻譯后修飾質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)蛋白質(zhì)翻譯后修飾質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù) 蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。蛋白質(zhì)芯片技術(shù)等。四、大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術(shù)四、大規(guī)模的蛋白質(zhì)分離技術(shù) 蛋白質(zhì)種類繁多，如：蛋白質(zhì)種類繁多，如：酵母：酵母：6145個(gè)；個(gè)；人類：人類：2.8-4萬個(gè)基因，萬個(gè)基因， 編碼十幾萬個(gè)蛋白質(zhì)。編碼十幾萬個(gè)蛋白質(zhì)。包括：酸性、堿性、疏水、親水、分子量包括：酸性、堿性、疏水、親水、分子量 大、大、 分子量小等。分子量小等。1、2-DE（二維電泳）（二維電泳） Smithies and Pouli

11、k: Nature, 1956, 177: 1033 (首先提出雙向電泳思路首先提出雙向電泳思路) Raymond and Weintraub: Science, 1959, 30: 711 (發(fā)明發(fā)明PAGE). 1969: 發(fā)明發(fā)明 IEF-PAGE。1975，OFarrel：JBC, 250: 4007-4021. Klose: Humangenetik, 26: 231-243. Scheele: JBC, 250: 5375-5385.進(jìn)一步優(yōu)化后建立進(jìn)一步優(yōu)化后建立2-DE。 80年代初：固相化年代初：固相化pH梯度梯度（immobilized pH gradient, IPG）等

12、電聚）等電聚焦電泳技術(shù)，使重復(fù)性、上樣量大大提高。焦電泳技術(shù)，使重復(fù)性、上樣量大大提高。 微量鑒定技術(shù)：微量鑒定技術(shù)： Edman微量測(cè)序技術(shù)微量測(cè)序技術(shù) （microsequencing） 高靈敏度質(zhì)譜技術(shù)。高靈敏度質(zhì)譜技術(shù)。細(xì)胞、組織、生物體蛋白質(zhì)（蛋細(xì)胞、組織、生物體蛋白質(zhì)（蛋白群）表達(dá)譜白群）表達(dá)譜（磷酸化蛋白質(zhì)譜，糖基化蛋白（磷酸化蛋白質(zhì)譜，糖基化蛋白質(zhì)譜）質(zhì)譜）蛋白質(zhì)差異表達(dá)蛋白質(zhì)差異表達(dá)（細(xì)胞周期、疾病、應(yīng)激條件下（細(xì)胞周期、疾病、應(yīng)激條件下蛋白質(zhì)表達(dá)變化，細(xì)菌分類蛋白質(zhì)表達(dá)變化，細(xì)菌分類 ）平衡平衡SDS、尿素、尿素1、DTT2、碘乙酰胺、碘乙酰胺固相固相pH梯度等電梯度等電聚

13、焦（聚焦（IPG IEF）SDS-PAGECH2CHCONHCH2NHCH2CHCOCH2CHCH2CHCONH2nCH2CHCONHCH2NHCH2CHCOCH2CHCONH2nCH2CH2CHCONH2nCH2CH2CHCH2CHCONH2nCONHCH2NHCOCH2CHCH2CHCONH2nCH2CH2CHCH2CHCONH2nCONH丙烯酰胺甲 叉 丙烯酰胺聚 丙烯酰胺 凝 膠CH2CHCONH2聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠構(gòu)成聚丙烯酰胺凝膠的兩個(gè)單體的結(jié)構(gòu)構(gòu)成聚丙烯酰胺凝膠的兩個(gè)單體的結(jié)構(gòu)及聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)示意圖及聚合物的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)示意圖丙稀酰胺丙稀酰胺甲叉丙稀酰胺甲叉丙稀酰胺聚丙烯

14、酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠PAGPolyacrylamide gel單體及聚合物單體及聚合物Gel 組成：組成：T= a + b / m x 100 (%)C= b / a + b x 100 (%)T- 丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺濃度丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺濃度%C- 甲叉雙丙烯酰胺濃度甲叉雙丙烯酰胺濃度% %：一般：一般3%3%a- 丙烯酰胺質(zhì)量丙烯酰胺質(zhì)量gb- 甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量甲叉雙丙烯酰胺質(zhì)量g第一維：等電聚焦第一維：等電聚焦 isoelectric focusing, IEF原理：原理： 蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI： 某一溶液中蛋白質(zhì)靜電荷為零的某一溶液中蛋白質(zhì)靜電荷為零的pH值

15、。值。分辯率高：分辯率高：0.01pH單位（精確度和重復(fù)性）。單位（精確度和重復(fù)性）。高度濃縮，可一次實(shí)驗(yàn)測(cè)出等電點(diǎn)。高度濃縮，可一次實(shí)驗(yàn)測(cè)出等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)所處環(huán)境的蛋白質(zhì)所處環(huán)境的pHpH值與其等電點(diǎn)不符，則該蛋白質(zhì)會(huì)值與其等電點(diǎn)不符，則該蛋白質(zhì)會(huì)帶一定量的正電荷或負(fù)電荷。帶一定量的正電荷或負(fù)電荷。在強(qiáng)電場(chǎng)中，帶電的蛋白質(zhì)分子會(huì)向正極或負(fù)極漂移，在強(qiáng)電場(chǎng)中，帶電的蛋白質(zhì)分子會(huì)向正極或負(fù)極漂移，當(dāng)達(dá)到其等電點(diǎn)位置時(shí)，蛋白不帶電，就不再漂移。當(dāng)達(dá)到其等電點(diǎn)位置時(shí)，蛋白不帶電，就不再漂移。連續(xù)分布的連續(xù)分布的pH值被固相化在一維干膠條上，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)值被固相化在一維干膠條上，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)樣本進(jìn)膠條后，在強(qiáng)

16、電場(chǎng)下按等電點(diǎn)不同分離蛋白質(zhì)。樣本進(jìn)膠條后，在強(qiáng)電場(chǎng)下按等電點(diǎn)不同分離蛋白質(zhì)。等電聚焦等電聚焦 等電點(diǎn)方向分離等電點(diǎn)方向分離a) 膠條和膠條和IPG緩沖液緩沖液c) 去除去除IPG膠保護(hù)膜膠保護(hù)膜b) 加入樣品和重泡脹液加入樣品和重泡脹液d) 放入膠條，鋪展樣品放入膠條，鋪展樣品e) 用覆蓋油封膠用覆蓋油封膠f) 封閉持膠槽封閉持膠槽 g) 轉(zhuǎn)移持膠槽轉(zhuǎn)移持膠槽h) 編程并運(yùn)行編程并運(yùn)行一維等電聚焦操作流程一維等電聚焦操作流程等電聚焦：結(jié)果等電聚焦：結(jié)果pH3pH10BIO-RAD公司公司PROTEAN IEF一維等電聚焦一維等電聚焦儀儀Amersham Bioscience 公司公司IPGp

17、hor公司公司 Amersham Bioscience Bio-Rad 膠條長度膠條長度 （cm） 7、11、13、18、24 7、11、17、24 pH 范圍范圍 3.5-4.5、4.0-5.0、4.5-5.5、5.0-6.0 5.5-6.7、 6-9、 3-7 NL、 3-10、 3-10 NL 4-7 (膠條長度為膠條長度為 18cm 或或 24cm) 3-6 5-8 7-10 3-10 等電聚焦膠條的規(guī)格等電聚焦膠條的規(guī)格l了解所要檢測(cè)的樣品了解所要檢測(cè)的樣品離子濃度，可溶性，溶液體系離子濃度，可溶性，溶液體系l準(zhǔn)備使用的重泡脹液類型及體積準(zhǔn)備使用的重泡脹液類型及體積l膠條膠條pH值范

18、圍的選擇及相應(yīng)的兩性電解質(zhì)選擇值范圍的選擇及相應(yīng)的兩性電解質(zhì)選擇l避免外來污染避免外來污染IEFIEF的優(yōu)點(diǎn)：的優(yōu)點(diǎn)： 1 1、分辨度高：、分辨度高：0.01pH0.01pH 2 2、樣品體積和加樣位置不嚴(yán)格、樣品體積和加樣位置不嚴(yán)格 3 3、測(cè)定蛋白質(zhì)、測(cè)定蛋白質(zhì)p pI I 4 4、分離快，薄層、分離快，薄層IEFIEF：2h2h 5 5、可保持原有蛋白的生物活性、可保持原有蛋白的生物活性IEFIEF的缺點(diǎn)：的缺點(diǎn)： 1 1、pI 附近會(huì)產(chǎn)生沉淀，影響分離效果附近會(huì)產(chǎn)生沉淀，影響分離效果 2 2、樣品要不含鹽、樣品要不含鹽 3 3、兩性電解質(zhì)可與蛋白質(zhì)結(jié)合，使抗體、兩性電解質(zhì)可與蛋白質(zhì)結(jié)合

19、，使抗體反應(yīng)、酶活性降低。反應(yīng)、酶活性降低。 第二維：第二維： 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）123456789101112131415161718192021222324252627282930SMNVero Vero SARS SARSMarker94,00067,00043,00030,00020,10014,400SARS攻擊攻擊Vero E6細(xì)胞系病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果細(xì)胞系病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果一維膠條平衡一維膠條平衡目的：目的：1.打開鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵，并封閉自由巰基打開鏈內(nèi)及鏈間二硫鍵，并封閉自由巰基 2. SDS和蛋白質(zhì)以質(zhì)量比和蛋白質(zhì)以質(zhì)量比1.4

20、：1結(jié)合，使亞基表面結(jié)合，使亞基表面攜帶過量負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)攜帶過量負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)SDS-PAGE+一維膠條一維膠條分子量標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖封膠瓊脂糖封膠SDS-PAGE 膠類型膠類型濃度分布濃度分布 梯度膠，連續(xù)膠梯度膠，連續(xù)膠制膠方式制膠方式 自制膠，預(yù)制膠自制膠，預(yù)制膠電泳方向電泳方向 水平膠，垂直膠水平膠，垂直膠Bio-Rad Protean II xi Cell 二向二向分析系統(tǒng)分析系統(tǒng)水平電泳儀水平電泳儀Multiphor II及其附件及其附件SDS-PAGE膠染色膠染色染色槽染色槽 Sensitivity limit Quantification Livi

21、ng cells Linear Dynamic Range Coomassie Blue staining 100 ng + no 3 Negative staining 15 ng + no 3 Silver staining 200 pg + no 7 Fluorescent staining 400 pg + no 104 Fluorescent labelling 250 pg + no 104 Radioactive labeling: X-ray film 1 pg + yes 20 Phospor-imager plates 0.2 pg + yes 105 Stable iso

22、tope labelling 3.4 O.D.Scan color selection14 bits / pixel (grey)Linked to ImageMasterlMulti-color fluorescencelPhosphor-imaginglChemiluminescencelZoom Gel (放大膠放大膠)窄范圍等電聚焦，提高雙向電泳分辨率窄范圍等電聚焦，提高雙向電泳分辨率l差示熒光電泳（差示熒光電泳（DIGE）保證二維電泳重現(xiàn)性保證二維電泳重現(xiàn)性l虛擬虛擬2-DE技術(shù)技術(shù)4691131076Zoom gel 技術(shù)技術(shù)22周齡胎肝周齡胎肝 2-DE 圖譜圖譜3104.55.

23、54.55.5466.55窄范圍膠條雙向電泳圖譜窄范圍膠條雙向電泳圖譜表達(dá)譜構(gòu)建表達(dá)譜構(gòu)建(蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù))1454 1665+1366=3031 1113+1973+1035+1366=5487 IPG 3-10 4-7 6-11 4-5 5-6 5.5-6.74.5-5.5 6-9膠內(nèi)差示熒膠內(nèi)差示熒光技術(shù)光技術(shù)（DIGE）Virtual 2-D (1)IPG膠膠-MALDI/MS分子量測(cè)定分子量測(cè)定Virtual 2-D (2)IPG IPG 膠條的改進(jìn)：膠條的改進(jìn)： pHpH變窄：變窄：1 1 pH pH擴(kuò)大：擴(kuò)大：3-123-12 長度：長度： 7 7、1111、1313、18

24、(IEF: 200018(IEF: 2000點(diǎn)點(diǎn)) )、24cm24cm。高通量與自動(dòng)化：高通量與自動(dòng)化： molecular scanner: 2-DE/MS 兩個(gè)兩個(gè)PVDF膜。膜。 2-DE2-DE的局限性：的局限性： 樣品量（樣品量（10106 6-10-107 7個(gè)細(xì)胞）、重復(fù)性、個(gè)細(xì)胞）、重復(fù)性、動(dòng)態(tài)范圍、丟失、動(dòng)態(tài)范圍、丟失、通量與自動(dòng)化。通量與自動(dòng)化。 l第一維：等電聚焦第一維：等電聚焦 實(shí)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)pI方向分離方向分離l第二維：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳第二維：變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 還原烷基化處理還原烷基化處理 分子量分離分子量分離l基于二維電泳新技術(shù)基于二維電泳新技術(shù) Zoom

25、gel, DIGE, Virtual 2-D參考讀物參考讀物錢小紅錢小紅, , 賀福初賀福初. .蛋白質(zhì)組學(xué)：理論與方法蛋白質(zhì)組學(xué)：理論與方法，科學(xué)出版社，科學(xué)出版社郭堯君郭堯君. 蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù). 科學(xué)出版社科學(xué)出版社Grg A et al. Electrophoresis 2000, 21, 1037Berkelman T. et al. 2-D electrophoreis using immobilized pH gradients principles and methods. Amersham Bioscience.2 2、色譜、色譜- -質(zhì)譜技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)（1

26、 1）2D-HPLC-MS-MS2D-HPLC-MS-MS 二維色譜二維色譜- -串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) A. 2D HPLCA. 2D HPLC優(yōu)點(diǎn)：快速、簡單、易于自動(dòng)化與質(zhì)譜連優(yōu)點(diǎn)：快速、簡單、易于自動(dòng)化與質(zhì)譜連 接、各種蛋白均可分離等。接、各種蛋白均可分離等。有多種組合模式：有多種組合模式： 第一維：離子交換色譜、凝膠過慮色譜第一維：離子交換色譜、凝膠過慮色譜 第二維：反相色譜。第二維：反相色譜。 B. 2D-HPLC/MS-MSB. 2D-HPLC/MS-MS 二維色譜二維色譜- -串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) 酵母蛋白質(zhì)組分析酵母蛋白質(zhì)組分析 Nature BiotechnolNature Biotechnol., 2001,19:242-247., 2001,19:242-247. 5540 5540個(gè)肽段被指認(rèn)、個(gè)肽段被指認(rèn)、14841484個(gè)蛋白被鑒定，個(gè)蛋白被鑒定， 并亞細(xì)胞定位。并亞細(xì)胞定位。 Mass spectrometerRPSCX蛋白鑒定蛋白鑒定變性蛋白混合物變性蛋白混合物肽段肽段 pH 3二維色譜分離二維色譜分離計(jì)算機(jī)檢索計(jì)算機(jī)檢索串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序基于二維色譜基于二維色