感染性疾病病原的診斷策略講座參考模板

1、感染性疾病病原的診斷策略上海交通大學醫(yī)學院病原生物學教研室 周與華感染和感染性疾病一直是臨床醫(yī)學的重要課題，引起人們的廣泛關(guān)注，自動化鑒定技術(shù)是怎樣的？ELISA、核酸探針、PCR診斷、16S文庫診斷技術(shù)的基本原理是什么？ELISA實驗的主要實驗策略和應用側(cè)重有哪些？基因芯片技術(shù)的原理是什么？下面，我們共同探討一下這些技術(shù)的原理策略以及發(fā)展的趨勢。在我們的日常生活中，小到一個皮膚創(chuàng)衛(wèi)，大到肺炎，肝炎，性傳播疾病，都有感染聲音的存在。在感染性疾病的診療過程中，對于其感染性病原體的診斷處于一個非常重要的位置，因為他既幫助我們確定疾病的病原，又指導我們后期的治療與用藥，可以說是一個不可或缺的因素。但

2、我們都知道，造成感染性病原體的千差萬別，他們都具有不同的生物學特性，這就迫使我們用策略和手段去尋找他們。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，微生物學的鑒定和專斷技術(shù)也有了長足的進步一、病原診斷策略的分類如今病原學的診斷技術(shù)多種多樣，從最簡單的手工平板劃線分離到最常規(guī)的自動化細菌鑒定儀，到最新的DNA測取技術(shù)，病原學的診斷技術(shù)幾乎覆蓋了醫(yī)學微生物學、分子生物學、生物化學的方方面面，具有很長的交叉性，這個問題看起來似乎復雜，沒有頭緒，但是我們能夠認真梳理還是很容易的理出一條主線，其實無論什么方法，都能歸入兩個大類。一類是以病原體表現(xiàn)型為基礎的方法；另一類是以病原體基因型為基礎的方法，所以表現(xiàn)型就是病原體直接表型出

3、的一些性狀，其物理學性狀、生化反應特性、免疫學特性，特性可以通過平板劃線分離，生化反應，血性型實驗的檢測出來。從分子微生物學的角度講，表現(xiàn)型是病原體基因組，特別是一些活躍的基因經(jīng)過轉(zhuǎn)入翻譯后的外在表現(xiàn)，雖然只能體現(xiàn)病原體基因組的部分特征，但是由于針對其實驗技術(shù)成熟，操作方便，成本相對低廉，因此，仍然是當今病原體診斷的常規(guī)技術(shù)，相比之下以基因型為基礎的方法更加接近病原體的本質(zhì)，因為基因組的存在了病原組的全部遺傳信息，以基因性為基礎的方法大致可以分為基于退性基因的檢測，以及基于測序的兩大手段。前者主要針對退役性基因，這些基因包含了病原體的某些種系特征，該方法快速特異，但鑒于臨床標本千差萬別，有時會

4、出現(xiàn)敏感性問題。而后者主要基于病原體剪輯系列，可以說做到了觸及病原體的本質(zhì)，是當今所有檢測技術(shù)的基因標準，但是由于經(jīng)濟成本和標準化的問題還很難廣泛推廣，不可否認它將是未來診斷技術(shù)的趨勢和發(fā)展方向。二、以表現(xiàn)型為基礎的方法（一）基因物理學特性和生化反應的診斷在整個微生物的發(fā)展歷史中，人類經(jīng)歷了經(jīng)驗時期、現(xiàn)代微生物學時期這幾個重要的歷史階段，在1670年荷蘭人發(fā)明了顯微鏡，第一次揭示了微生物世界的存在，開始人類進入了實驗時期，從那以后至今300多年的時間里，通過多種多樣的實驗方法來鑒別不同微生物的物種間的不同性質(zhì)；這其中有形態(tài)學的方法最基本的格蘭染色，鑒定白喉棒狀桿菌的染色。鑒定結(jié)核分枝桿菌的抗酸

5、染色，也有基于生化反應的方法，如平板考察腸道細菌對于乳糖分解能力的不同以確定致病菌株，運用了整合了四個生化反應的實驗鑒定了不同的腸道桿菌的方法雖然這些方法被視作經(jīng)費的保留下來再醫(yī)學上廣泛和大量的應用但是手工操作存在效率偏低的疫病。而隨著工業(yè)化的推進和科學技術(shù)的不斷發(fā)展，其中很多方法被系統(tǒng)化集成化標準化，許多手工作業(yè)被自動化儀器所取代，這樣便催生了自動化鑒定技術(shù)，手工鑒定和自動化鑒定技術(shù)可以說相同原理在不同技術(shù)條件下的不同形式，但不可否認無論效率的高低它們都是基于相同的經(jīng)典微生物學理論。雖然在高技術(shù)條件下的今天，許多手工操作的方法已經(jīng)瀕臨淘汰，但是在一些基礎條件欠發(fā)達的地區(qū)，在一些經(jīng)驗性診斷已經(jīng)

6、相當成熟的疾病面前，經(jīng)典的手工操作方法以及低技術(shù)要求，低成本的獨特魅力在高科技的加分中仍然取得了一席之地，上圖中為我們展示了幾種比較經(jīng)典的手工操作方法，讓我們先來看最左邊的一張，這張圖片給我們展現(xiàn)給我們的是平板劃線分離的方法，將含有多種細菌的菌液圖鋪在同一個題板上，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，可以根據(jù)菌落的特性辨別出不同的細菌，在圖中我們可以看出兩種明顯不同的菌落，一種菌落較大，明顯來源于不同的菌種，經(jīng)驗豐富的實驗者往往能直接通過菌落的顏色、光澤、干濕、外形的信息做出初步的診斷，同時這種方法也是自動化細菌檢定儀的第一道工序中間農(nóng)業(yè)的格蘭染色，在圖中所指區(qū)域，可以找到大量格蘭陰性的球菌集合。病人不檢性生

7、活史、尿急尿痛的尿道刺激征，我們很容易做到林秋菌性尿道炎的診斷，而無需進一步的微生物學檢查；第三張圖展示的是甲乙丙的三種鏈球菌在血滴板上不同溶血快的特征，在點中方向是不溶血的典型溶血性球菌，在五點中方向生長的是完全溶血的的隱形溶血的，在7點溶血的是不完全溶血的甲型溶血性鏈球菌，鏈球菌是常見的人體的致命菌，菌落特征很難區(qū)別只有通過溶血的特點才能完全區(qū)別，因此血平板的培養(yǎng)的也是不錯的區(qū)別不同細菌的方法。以上我們講解的比較經(jīng)典的手工操作的方法但是我們知道手工操作存在人為影響因素多主觀因素強這樣可以控制效率工作的缺點及檢查以及很難想象是如今對于醫(yī)療條件的要求，由于工業(yè)化和標準化的問題自動化鑒定技術(shù)也意

8、義而深了我們知道一個菌種面對不同的反應物有不同的反應結(jié)果，一個菌種也會產(chǎn)生不同的結(jié)果；將這些反應結(jié)果建立不同的數(shù)據(jù)庫就是我通常所說的反應庫，那么其中針對細菌的特點就會有特定的反應組合，將待檢細菌的結(jié)果與反應比對，就能得出相應的鑒定結(jié)果，這就是自動化鑒定的基本原理。雖然和手工操作一樣自動化鑒定技術(shù)在相似的原理之上，但是將信息標準化集成化使得很大成功提高了檢測效率；同時操作的程序化也減少了人為因素的影響，使整個結(jié)果更加可靠。自動化鑒定技術(shù)的系統(tǒng)反應表中展示的應用與自動化鑒定儀各種反應系統(tǒng)，通過反應系統(tǒng)將手工操作的方法跟其結(jié)果反應的本質(zhì)進行分類，比如有些跟菌可以分解特定糖類產(chǎn)生酸。導致培養(yǎng)環(huán)境值發(fā)生

9、改變。而有些細菌無法分特定糖類則不產(chǎn)生酸。類似于手工操作的中的發(fā)酵試驗，又如有些細菌含有特定的酶類，如螺旋桿菌和尿素酶可以分解尿素產(chǎn)生的胺類物質(zhì)。有些鎂可以使適當?shù)捏w物顯色，通過檢測不同細菌的酶類，可以達到檢測和診斷的目的。綜上所述，我們可以通過不同的反應與體系，建立不同的反應數(shù)據(jù)庫與待測菌株進行比對?？晒┍葘Φ男畔⒃蕉喾磻Y(jié)果越準確。（二）基于物理特性和生化反應方法的局限性雖然以生物學性狀與生化反應為基礎的方法是如今臨床實驗的主流方法但其本身具有的局限性也是不容回避的。首先，單一的生物學性狀與單一的與性狀直接可能在一種一對多多對一的情況因此只有增加不同的反應通過不同的反應組合與達到反應特異性

10、的目的其次當細菌要表示特有的生物學性狀和生化需要一定的數(shù)量作為保證，而從臨床標準中直接提取的細菌量是無法達到的檢測的預知的。因此，培養(yǎng)的步驟往往無法避免，通過適量的擴增才能達到反應的要求而培養(yǎng)的的步驟是比增加檢測的時間成本。最后，由于培養(yǎng)依賴性一些難培養(yǎng)或者體外無法培養(yǎng)的細菌就很難達到數(shù)量上擴增的要求，也很難檢測這就造成假音性結(jié)果，這對于病情是一種低估或誤診。二、基于免疫學特征（一）ELISA的原理有些病原體如異樣性病都離開人體很難通過培養(yǎng)性依賴檢測但是我們知道很多病原體在人體的感染程度會遺留下某些證據(jù)，比如病原體的一些抗原，或是這些抗原激發(fā)人體產(chǎn)生的抗體這些抗原和抗體就通過免疫學的方法檢測出

11、來，簡言之免疫學手段就是通過人工方法以知的抗原抗體利用免疫學結(jié)合的原理檢測病原體位置的抗原和抗體。并將這種結(jié)合可視化來達到鑒定的目的，免疫學鑒定的方法和反應介質(zhì)分類分為物象測定和液相測定，在病原體的診斷中主要依賴于固相免疫測定，其中以酶來鎂為代表性，也就是我們說的實驗。實驗是雇傭名才定方法，雖然針對其也有不同的策略，但是大致的原理是一致的。在設計過程中，有一種非常重要的酶標抗體，這種抗體在不影響其抗議性結(jié)合的情況下與某種酶工賈結(jié)合，而酶本身的活性不受抗體的影響，這種酶可以喝特異性的地物反應并顯色，在實驗中先將已知的抗原和抗體包在載體表面，然后再臨床標本在與其反應，反應后洗未反應的物質(zhì)，待顯標準

12、中可結(jié)合物越多，則殘留在表面可抗原抗體殘留物越多，在加入酶抗體與之結(jié)合洗脫后如果結(jié)合越多則酶含量越高，最后加入特異的地物顯色，顏色的深淺與酶多少相關(guān)，將顏色深淺量化之后得出樣品中含有多少抗原或抗體物質(zhì)結(jié)果，這就是實驗。通過上圖可以看到實驗結(jié)果，由下向上講解，最下方是一條橫線代表固相載體，上面的是小三角是足量的包被的已知抗原，與之結(jié)合的是病人的血型在抗體的上方時能識別人免疫球蛋白的抗體。酶工價結(jié)合成酶標抗體，在反應中我們可以看到病人的血清是擔任重要的角色，而與包被抗原之間是不能形成免疫復合物，只有當血清中含有真正抗原的酶標抗體才能避免被洗脫，然后保留下來。因此，顯示可以看到形成圖中所示的復合物才

13、最終顯色，如果病人血清中沒有包被的抗體那么反應物沒有顯色形成陰性結(jié)果。（二）ELISA的主要策略當然實驗也有不同的策略和類別。針對不同檢測對象根據(jù)抗的不同和檢測對象的不同，可以分為直接法間接法和夾心法；直接法是固相載體表面包被已知抗原然后和未知抗體與之結(jié)合。酶標抗體和未知抗體是同一個抗體沒有抗出現(xiàn)。所以每次實驗都必須進行過程，這就無形中增加時間成本，且待測樣本中待測的量通常是未知的因此不宜大規(guī)模的生產(chǎn)，這就直接導入了直接法在臨床檢驗中不常用的結(jié)果，間接法運用的是酶標和鎂表抗其原理是我們先前講到的圖示。由于其包被在固體個表面，與之抗原檢測病人標準中的位置抗體，而且比較單一。；可以預先標記大規(guī)模生

14、產(chǎn)以此檢驗中間接法廣泛運用，。這種方法的酶標抗體是針對某種抗原的已知抗體包被在固體表面的也是某種抗原的抗體，在反應中標準中兩個抗體家在其中。因此叫夾心法；用于檢測病人血清中或其他標本中的抗體在我們臨床使用中根據(jù)不同選擇適宜的方法。（三）ELISA間接法的實驗過程上圖展示的是實驗過程，他檢測的是病人體內(nèi)的未知抗體。首先我們將已知抗原同過化學方法在固相載體表面。然后加入不同病人血清；讓我們將左右兩張圖含有大量的兩個多重抗體，在左邊的病人血清中還有包被的對應的抗體經(jīng)過洗脫的過程，只有特異性抗體保留下來；其余的也被洗脫而右邊的不合這種抗體因此當抗加入抗相結(jié)合，而右邊的標本因此抗也就無法結(jié)合；在下一步就

15、是加入酶的地物酶沒有抗沒有酶存在，顏色淺色、顏色與酶多少有關(guān)；通過酶標量化出來，計算血清量價。（四）基于免疫特征的方法存在的優(yōu)缺點首先，在大部分的情況下免疫學方法所堅持的標準是人的血清和尿液；來樣比較方便而且不用等待病原體生化反應，通常不需要培養(yǎng)的過程了。這就節(jié)省了時間成本和經(jīng)濟成本對于那些和難培養(yǎng)的病原體不受培養(yǎng)的干擾；但是有局限性依賴性優(yōu)于病原的限制，可以體外的是非常有限的；因此通過免疫學方法接受病原體的數(shù)量是有限的；二、特定抗原物種直接存在交叉性。對我們有有利的一面和不利的一面，對于難以得到的可以用其他物種之間代為堅持我們用意得到的用于檢測感染，反過來不利的因素是假陽性的結(jié)果，只有一個是

16、明顯的增高進行明確的診斷。三、以基因型為基礎的方法（一）概述基于表現(xiàn)型的方法要針對不同的病原體的不同特性，因此有眾多的方法，就像我們前面所提到的不同的反應，而且我們的表格中只是涉及其中的一小部分，而基于基因組的方法，由于針對的是細菌或者病毒的DNA，無論病原體的本身性質(zhì)如何，基于DNA性質(zhì)差異并不大。因此，針對基因型的方法是比較單一的，基因表現(xiàn)型的方法雖然途徑很多，但是能檢測的病原體十分有限，而基于基因組的方法雖然手段比較少，但是可檢測的病原體的數(shù)量卻非常之多，從這一點上來看，基于基因組的方法是一種非常有前途和潛力的方法。（二）以基因型為基礎的方法的主要策略根據(jù)試驗原理的不同，以基因型為基礎的

17、方法可以分為兩大類，第一類是檢測病原體特性基因的方法，而第二類方法是基因測序手段，基于病變體特異性基因的方法的根本原理是我們通常所熟知的A-T、C-G堿基配對原則，根據(jù)該配對原則，通過標本與特異性探針進行體外或原位雜交，或體外擴增，并且將這種反應可視化，達到檢測的目的，那么這些方法也有不同的手段，比如，低效率、低通量的核算探針，高效率、高通量的基因芯片，以及以體外擴增方法，也就是我們通常所知道的聚合酶鏈反應-PCR，基于測序的方法的原理是檢測病原體的全部或部分的建基序列，得到的序列信息與專業(yè)的數(shù)據(jù)庫進行對比，根據(jù)數(shù)據(jù)的相似度以達到檢測的目的，這類方法中，成本低，應用的是部分堿基序列中的測序，其

18、中，最具代表性的就是基于細菌16SR中的DNA檢測技術(shù)，而另一類方法就是現(xiàn)在還沒有廣泛應用的全場基因序列的測序，也就是基因組測序。（三）基于病原體特異性基因的方法我們知道，不同的病原體根據(jù)其種屬的不同，攜帶有自身的特異性基因，這些基因可以將這些病原體與其他的類別區(qū)別開來，我們通過一些特定的方法，將這些特異性序列在體外進行擴增或者合成，并且，將這些人工合成、可以與病原體特異性互補結(jié)合的DNA片段運用放射性物質(zhì)、酶類物質(zhì)或生物素標記，等到發(fā)生結(jié)合之后，就可以通過標記物質(zhì)檢測到合成的存在，這有點類似于我們前面所講到的酶標抗體，只是前者標記的是免疫球蛋白，而后者標記的是DNA分子。我們簡要講解集中基于

19、病原體特異性基因的方法，核酸探針是將與病原體基因互補的，并且經(jīng)過放射性物質(zhì)、酶類物質(zhì)標志的體外合成的DNA片段，通過雜交的方式識別病人標本中與之匹配的病原體特異性基因，并且，運用標記物證明自身的存在，但是，每一種核酸探針每一次只能檢測一到幾個基因，因此，存在效率偏低的缺陷，很難在臨床上大量的應用，基因芯片的原理是將成百上千的核酸探針集中在一張微晶片上，然后，同時間將這些核酸探針與標本進行雜交，這些核酸探針既可以同時檢測一個病原體的不同基因，以達到提高檢測特異型的目的，又可以檢測不同病原體的不同基因，以達到擴大檢測范圍的目的，雜交后，通過芯片上的雜交信號加以掃描，將信號的強弱與組合和數(shù)據(jù)庫進行比

20、對，得到檢測鑒別的結(jié)果，其實，基因芯片技術(shù)，就是將成百上千次核酸探針試驗整合到一次完成，其實，是核酸探針的高通量方法，其大大提高了檢測效率，但是假陽性多鑒也是不容回避的一個問題，特異性PCR的原理其實也是堿基配對原則，只是運用較短的引物做部分結(jié)合，然后其余通過體外擴增達到檢測的目的，通過大量體外擴增以達到儀器甚至肉眼可見的水平，最終完成整個病原基因的診斷。（四）基于測序的方法至今為止，根據(jù)分子生物學的理論，病原基因組承載了病原基因所有的遺傳信息，所以至少在如今的技術(shù)條件下分析基因組的方法就是病原體診斷的基因標準，當然基因組雖然是當前條件下診斷的基因標準，可是基因組所含的信息量相當龐大，其中很多

21、的信息對于診斷的意義并不大，而且分析基因組需要依賴具有海量分析、存儲、運算能力的設備，這就大大提高了檢測的成本和時間，所以，為了解決這些問題，我們就運用了部分測序技術(shù)作為折中的辦法，通過理選出一些含有大量種序信息的特異性基因，為病人盡心測序，以達到估量總體的目的，這個方法中最具代表性的就細菌16SRDNA文庫測序技術(shù)，運用這個技術(shù)可以達到菌種檢測的目的，細菌16SRDNA測序技術(shù)具有以下幾個優(yōu)勢，首先細菌16SRDNA文庫技術(shù)包含了大量的細菌種序信息，在這個基因中包含有保守區(qū)域，方便體外進行無色記憶，在飽受區(qū)域之間包含了許多高倍區(qū)域，這就方便了在測序過程中進行區(qū)別、對比和種序分析，體外擴增的產(chǎn)物多為DNA短鏈，是當今測序技術(shù)的最適程度，這樣就避免了基因組測序過程中的后期拼接過程，減少了數(shù)據(jù)量