實(shí)驗(yàn)五 糞標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)

1、實(shí)驗(yàn)六實(shí)驗(yàn)六糞便標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn)糞便標(biāo)本的微生物學(xué)檢驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩?shí)驗(yàn)?zāi)康模?掌握糞便標(biāo)本的采集與處理、常見病原菌及一般微生物學(xué)檢驗(yàn)程序。 掌握沙門氏菌和志賀氏菌的鑒定方法；熟悉它們的生物學(xué)性狀。 糞便標(biāo)本的采集與處理：糞便標(biāo)本的采集與處理：自然排便采集法：自然排便采集法：自然排便后，挑取糞便23克于無菌的容器內(nèi)送檢。應(yīng)盡可能取有膿血、粘液的標(biāo)本。肛拭子法：肛拭子法：不易獲得糞便的患者或作厭氧菌培養(yǎng)時(shí)，常采用此法。將無菌棉拭子用無菌生理鹽水濕潤后，插入肛門約45厘米（幼兒約23厘米）處，輕輕旋轉(zhuǎn)，擦取直腸表面粘液后取出，置無菌試管內(nèi)送檢。除嬰幼兒外，不推薦用棉拭子做常規(guī)病原菌培養(yǎng)。疑似痢疾患

2、者疑似痢疾患者應(yīng)在發(fā)病初期、用藥前采取標(biāo)本；疑似傷寒患者疑似傷寒患者應(yīng)在發(fā)病23周內(nèi)采集糞便標(biāo)本。若疑為霍亂患者若疑為霍亂患者，標(biāo)本應(yīng)置堿性蛋白胨水中。若疑有耶爾森菌或彎曲菌等若疑有耶爾森菌或彎曲菌等，標(biāo)本應(yīng)置卡布運(yùn)送培養(yǎng)基送檢。糞便標(biāo)本如不能立即送檢，糞便標(biāo)本如不能立即送檢，可將標(biāo)本放入甘油鹽水保存液中或保存于冰箱內(nèi)（勿超過2h）種種 類類病病 原原 菌菌革蘭陽性菌革蘭陽性菌金黃色葡萄球、厭氧鏈球菌、腸球菌、結(jié)核分枝桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、艱難芽胞梭菌、蠟樣芽胞桿菌革蘭陰性菌革蘭陰性菌傷寒桿菌及其它沙門菌、志賀菌、彎曲菌、致病大腸埃希菌、霍亂弧菌、副溶血弧菌 、氣單胞菌、鄰單胞菌、小腸結(jié)腸炎耶爾

3、森菌真菌真菌白假絲酵母菌病毒病毒輪狀病毒糞便標(biāo)本中常見的病原微生物糞便標(biāo)本中常見的病原微生物糞便標(biāo)本的檢驗(yàn)程序糞便標(biāo)本或肛拭子標(biāo)本直接涂片革蘭染色抗酸染色分離培養(yǎng)（SS、MaC、TCBS、堿性蛋白胨平板）增菌培養(yǎng)（ GN增菌、 亞硒酸鹽增菌液、堿性蛋白胨水）351824h菌落形態(tài)、革蘭染色氧化酶試驗(yàn)KIA、MIU及其他生化反應(yīng)、血清學(xué)凝集、藥敏試驗(yàn)報(bào)告結(jié)果注：注：GN增菌液、亞硒酸鹽增菌液用于志賀菌、沙門菌的增菌。 直接涂片只適應(yīng)于疑為霍亂、腸結(jié)核及偽膜炎腸炎患者。 GN增菌液：增菌液：本培養(yǎng)基含有膽鹽、枸櫞酸鹽對革蘭氏陽性菌有抑制作用，而對革蘭氏陰性菌有增菌作用，接種標(biāo)本6小時(shí)內(nèi)，大腸桿菌、

4、變形桿菌及假單胞菌在此培養(yǎng)基中生長遲緩，而志賀菌、沙門氏菌生長較迅速。故常于接種糞便68小時(shí)，再自此增菌液內(nèi)接種至SS平板、MaC平板中。 亞硒酸鹽增菌液：亞硒酸鹽增菌液： 本培養(yǎng)基中的04%亞硒酸鈉可抑制革蘭氏陽性菌的生長，對革蘭氏陰性菌也有毒性，但磷酸鈉有中和此毒性的作用，能使腸道致病菌迅速繁殖。磷酸氫二鈉與磷酸二氫鈉有緩沖作用，有利于腸道致病菌生長。 SS平板：平板：是專用志賀菌、沙門菌分離培養(yǎng)用的一種強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基。 膽鹽膽鹽能抑制革蘭氏陽性菌生長，煌綠煌綠抑制大腸桿菌的生長。促進(jìn)志賀菌、沙門菌生長（對膽鹽和煌綠等染料有抵抗力）。 膽鹽、枸櫞酸鈉及硫代硫酸鈉在一定比例時(shí)發(fā)揮聯(lián)合抑菌作用

5、。 硫代硫酸鈉有緩和膽鹽對志賀菌、沙門菌的有害作用并中和煌綠、中性紅的毒性作用。 本培養(yǎng)基除抑制腸球菌、革蘭氏陽性菌外，還可抑制大部分大腸艾希氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌等革蘭氏陰性菌，對志賀菌、沙門菌也有輕度的抑制作用。 由于該培養(yǎng)基抑制雜菌的能力強(qiáng)，故可以增加糞便接種量而獲得較高的陽性分離率。 實(shí)驗(yàn)器材：實(shí)驗(yàn)器材：1、標(biāo)本：、標(biāo)本：已增菌模擬糞便標(biāo)本1#、2#、3#、4#、5#。2、培養(yǎng)基：、培養(yǎng)基：SS、MaC、 KIA、蛋白胨水、枸櫞酸鹽斜面、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸鹽蛋白胨水、甘露醇半固體培養(yǎng)基。3、試劑：、試劑：革蘭染液、氧化酶試劑、3%H2O2、靛基質(zhì)試劑、甲基紅試劑、10%FeCl3、硝酸

6、鹽還原試劑甲液、硝酸鹽還原試劑乙液。4、診斷血清：診斷血清：志賀菌屬：志賀菌四種多價(jià)診斷血清、福氏志賀菌多價(jià)診斷血清、宋內(nèi)氏志賀菌單價(jià)診斷血清。沙門菌屬：AF群多價(jià)O血清、O因子血清（O2、O4 O9）、H因子血清（Ha Hb Hd）、Vi血清。 實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法：一、分離培養(yǎng)一、分離培養(yǎng) 用無菌方法將1#、2#、3#、4#、5#模擬糞便標(biāo)本分別劃線接種于SS、Mac上，置35培養(yǎng)1824小時(shí)。二、結(jié)果觀察：二、結(jié)果觀察：、菌落形態(tài)描述、菌落形態(tài)描述: 分別描述1#、2#、3#、4#、5#標(biāo)本在SS、Mac上的菌落形態(tài)。（可疑菌落與正常菌群菌落分別描述）2、革蘭染色：革蘭染色：3、觸酶試驗(yàn)：

7、觸酶試驗(yàn)：4、氧化酶試驗(yàn)：氧化酶試驗(yàn)：5、細(xì)菌分純：細(xì)菌分純：挑取生長于SS平板、MaC平板中的可疑菌落35個(gè)分別接種35支KIA。37培養(yǎng)1824小時(shí)后，觀察結(jié)果。 KIA菌名乳糖 / 葡萄糖H2S動(dòng)力氣體福氏志賀菌A / K宋內(nèi)氏志賀菌A / K甲型副傷寒桿菌A / K / +乙型副傷寒桿菌A / K+傷寒桿菌A / K+ / +三、三、KIA結(jié)果觀察結(jié)果觀察分別描述1#、2#、3#、4#、5#標(biāo)本的KIA結(jié)果。四、生化反應(yīng)：四、生化反應(yīng)： 根據(jù)KIA的結(jié)果進(jìn)一步做生化反應(yīng)。從KIA斜面上挑取1#、2#、3#、4#、5#標(biāo)本細(xì)菌分別接種于蔗糖半固體發(fā)酵管、蛋白胨水、尿素、苯丙氨酸斜面、硝酸

8、鹽蛋白胨水，37培養(yǎng)1824小時(shí)后，觀察結(jié)果。五、血清學(xué)試驗(yàn)五、血清學(xué)試驗(yàn):沙門菌屬：如生化反應(yīng)符合沙門氏菌屬，則可按下述步驟進(jìn)行血清學(xué)沙門菌屬：如生化反應(yīng)符合沙門氏菌屬，則可按下述步驟進(jìn)行血清學(xué)診斷：診斷：1、先用AF群O多價(jià)血清作玻片凝集試驗(yàn)（做生理鹽水對照, 看有無自凝）2、AF群O多價(jià)血清凝集則用用O因子血清定群：因子血清定群： O抗原有許多組成成分，有的是一種菌所獨(dú)有的，有的是幾種菌共有的。將具有相同菌體抗原的沙門氏菌歸屬于同一組（群）。故O因子血清只能定群。3、AF群O多價(jià)血清不凝集，做Vi因子血清凝集因子血清凝集。如果凝集，需用生理鹽水制成濃稠菌懸液后隔水煮沸1530分鐘，再做凝

9、集試驗(yàn)。（新分離的傷寒及丙型副傷寒常帶想此抗原。）4、按照確定的、按照確定的O群分別用群分別用H因子血清檢因子血清檢查查H抗原抗原。 志賀菌屬志賀菌屬：若生化反應(yīng)結(jié)果相符，則作玻片凝集反應(yīng)：1、做生理鹽水對照, 看有無自凝。2、用志賀氏菌屬4種多價(jià)血清反應(yīng)，若有凝集，再用單價(jià)群診斷血清（福氏志賀菌多價(jià)診斷血清、宋內(nèi)氏志賀菌單價(jià)診斷血清）行凝集反應(yīng)定群。 血清學(xué)試驗(yàn)血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果判斷判斷： 血清凝集試驗(yàn)陽性：出現(xiàn)肉眼可見凝集顆粒 血清凝集試驗(yàn)陰性：液體呈乳狀懸液 KIA標(biāo)本號(hào)乳糖 / 葡萄糖H2S動(dòng)力氣體菌名A / K福氏志賀菌A / K宋內(nèi)氏志賀菌A / K / +甲型副傷寒桿菌A / K+乙型副傷寒桿菌A / K+ / +傷寒桿菌 生化反應(yīng)標(biāo)本號(hào)蔗糖靛基質(zhì)甘露醇脲酶苯丙氨酸脫氨酶動(dòng)力氣體+ +六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：1、KIA 結(jié)果：2、生化反應(yīng)結(jié)果：標(biāo)本號(hào)AF群O多價(jià)血清O2O4O9Ha HbHd生理鹽水對照菌名+甲型副傷寒桿菌+乙型副傷寒桿菌+傷寒桿菌標(biāo)本號(hào)志4種多價(jià)血清福氏多價(jià)診斷血清宋內(nèi)氏單價(jià)診斷血清生理鹽水對照菌名+福氏志賀菌+宋內(nèi)氏志賀菌血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果：血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果：沙門