第十四章液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用

1、114.3 液相色譜液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法質(zhì)譜聯(lián)用分析法14.3 Hyphenated Technology of HPLC-MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（LCMS聯(lián)用）2對(duì)于熱穩(wěn)定性差、不易汽化的樣品，GSMS聯(lián)用有一定的困難。因此，近年來(lái)又發(fā)展了液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。LC分離要使用大量的液態(tài)流動(dòng)相，如何有效地除去流動(dòng)相而不損失樣品，是LCMS聯(lián)用的難題之一。目前應(yīng)用較多的有兩種接口裝置。LC-MS用傳送帶聯(lián)接裝置用傳送帶聯(lián)接裝置3 一一 、高效液相色譜、高效液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀 二、二、 離子源離子源 三、三、 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器 四、四、 串聯(lián)四級(jí)質(zhì)譜法的掃描方式和模式串聯(lián)四級(jí)

2、質(zhì)譜法的掃描方式和模式 五、檢測(cè)器和真空泵五、檢測(cè)器和真空泵 六、六、 LC-MSLC-MS分離條件的選擇和優(yōu)化分離條件的選擇和優(yōu)化 七、注意事項(xiàng)見(jiàn)建議七、注意事項(xiàng)見(jiàn)建議4一、液相色譜一、液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀1. 1. 液質(zhì)聯(lián)用儀組成流程液質(zhì)聯(lián)用儀組成流程5p 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）p 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS）；p 也可以質(zhì)譜-質(zhì)譜聯(lián)用（MS-MS）。 基于色譜和質(zhì)譜的儀器靈敏度相當(dāng)，加之使分離效果好的色譜成為質(zhì)譜的進(jìn)樣器，而速度快、分離好、應(yīng)用廣的質(zhì)譜儀作為色譜的鑒定器，使它們成為目前最好的用于分析微量的有機(jī)混合物的儀器。一、液相色譜一、液相色譜- -

3、質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀2. 2. 液質(zhì)聯(lián)用儀類(lèi)型液質(zhì)聯(lián)用儀類(lèi)型6p 氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS)是最早商品化的聯(lián)用儀器，適宜分析小分子、易揮發(fā)、熱穩(wěn)定、能氣化的化合物；用電子轟擊方式（EI）得到的譜圖，可與標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)對(duì)比。p 液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)主要可解決如下幾方面的問(wèn)題：不揮發(fā)性化合物分析測(cè)定；極性化合物的分析測(cè)定；熱不穩(wěn)定化合物的分析測(cè)定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析測(cè)定；沒(méi)有商品化的譜庫(kù)可對(duì)比查詢，只能自己建庫(kù)或自己解析譜圖u 液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別液質(zhì)聯(lián)用與氣質(zhì)聯(lián)用的區(qū)別:7LC-MS聯(lián)用儀系統(tǒng)構(gòu)成8 廣適性檢測(cè)系統(tǒng)3. 3. 液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)勢(shì)液質(zhì)聯(lián)用的優(yōu)勢(shì)一、液相色譜一

4、、液相色譜- -質(zhì)譜聯(lián)用儀質(zhì)譜聯(lián)用儀9 分析熱不穩(wěn)定化合物 分析氣相色譜-質(zhì)譜無(wú)法分析的樣品 分析大分子量的化合物，如生化樣品 極高的靈敏度10 進(jìn)一步增加 HPLC 的分離能力 114. LC-MS 4. LC-MS 聯(lián)用中的轉(zhuǎn)變過(guò)程聯(lián)用中的轉(zhuǎn)變過(guò)程 液相色譜的現(xiàn)實(shí)情況： 從高效液相色譜流出的化合物存在于大氣壓條件下的溶液之中 質(zhì)譜的現(xiàn)實(shí)情況： 在高真空工作條件下的質(zhì)譜僅接受氣相的離子: : 因此，液質(zhì)聯(lián)用的接口接口必須完成: 帶電狀態(tài): “中性 ”-離子 物態(tài)轉(zhuǎn)變：液態(tài) - 氣態(tài) 真空變化: 760 torr 760 torr - 10 10-5-5 10 10-8-8 torrtorr

5、。p 從從LC-MSLC-MS轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)變 p LC-MSLC-MS轉(zhuǎn)變過(guò)程轉(zhuǎn)變過(guò)程 l 去除溶劑l 保留樣品l 電離化合物12p 接口 13p API API接口：接口：Z-Spray Z-Spray 接口接口14二、離子源p 大氣壓電離大氣壓電離 (API) 技術(shù)技術(shù) 目前，LC-MS采用大氣壓離子化（Atmospheric pressure ionization, API)技術(shù)作為液質(zhì)聯(lián)用的接口技術(shù)，也是質(zhì)譜離子化技術(shù)。p APIAPI主要包括：主要包括： 電噴霧 electrospray ionization, ESI 大氣壓化學(xué)電離 atmospheric pressure chemic

6、al ionization, APCIp 離子源：使樣品產(chǎn)生離子的裝置叫離子源。15（一）電噴霧離子源一）電噴霧離子源 ESIESI（二）大氣壓化學(xué)電離（二）大氣壓化學(xué)電離APCIAPCI（三）（三）ESIESI與與APCIAPCI比較比較二、離子源16電噴霧離子化ESI接口電噴霧離子化ESI特征電噴霧離子化ESI過(guò)程影響化合物 ESIESI電離的因素（一）（一） 電噴霧離子化電噴霧離子化 ESIESI171. ESI 1. ESI 接口接口（一）（一） 電噴霧離子源電噴霧離子源氮?dú)庥脕?lái)做去溶劑氣和錐孔氣氬氣做碰撞氣先形成帶點(diǎn)電荷先形成帶點(diǎn)電荷18l 低分子量化合物一般產(chǎn)生單電荷離子(失去或得

7、到一個(gè)質(zhì)子)l 高分子量生物大分子和聚合物產(chǎn)生多電荷離子l 幾乎沒(méi)有碎片離子l 可能生成加合物和/或多聚體;常見(jiàn)的是溶劑加合物和NH4+(M+18), Na+(M+23),和K+(M+39) 加合物l 靈敏度取決于化合物本身和基質(zhì)（一）（一） 電噴霧離子源電噴霧離子源2. ESI 特征19u（1）形成帶電小液滴u （2）溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂u （3）最終形成氣相離子3. 電噴霧離子化電噴霧離子化ESIESI過(guò)程過(guò)程（一）（一） 電噴霧離子源電噴霧離子源20u（1 1）形成帶點(diǎn)離子）形成帶點(diǎn)離子3. 電噴霧離子化電噴霧離子化ESIESI過(guò)程過(guò)程2122u （2 2）溶劑蒸發(fā)和小液滴碎裂）溶劑蒸發(fā)

8、和小液滴碎裂3. 電噴霧離子化電噴霧離子化ESIESI過(guò)程過(guò)程23u（3 3）形成氣相離子）形成氣相離子對(duì)于半徑對(duì)于半徑 10nm10nm的液滴的液滴 , ,電荷的排斥作電荷的排斥作用導(dǎo)致離子從用導(dǎo)致離子從液滴表面蒸液滴表面蒸發(fā)而不是液滴發(fā)而不是液滴的分裂。離子的分裂。離子從溶液中轉(zhuǎn)移從溶液中轉(zhuǎn)移至氣相至氣相3. 電噴霧離子化電噴霧離子化ESIESI過(guò)程過(guò)程244. ESI-MS4. ESI-MS的基本離子化原理是：的基本離子化原理是： 溶劑由液相泵輸送到ESI毛細(xì)管，經(jīng)其內(nèi)的不銹鋼毛細(xì)管流出，在ESI高壓電極處施以負(fù)的高電壓, 小液滴從毛細(xì)管高速噴出而帶有過(guò)量的負(fù)電荷. 從而產(chǎn)生電化學(xué)反應(yīng)：

9、通過(guò)溶劑組分氧化而去掉正離子或通過(guò)毛細(xì)管自身的氧化而增加負(fù)離子。在高溫和氮?dú)獾拇祾呦拢軇┲饾u揮發(fā)，變成小顆粒的液滴，由于高電場(chǎng)作用，極性溶質(zhì)成為帶電離子溶解在溶劑液滴上，當(dāng)溶劑顆粒逐漸減小，小到一定程度，帶電的溶質(zhì)粒子便從液滴表面蒸發(fā)出來(lái)，形成帶電離子，完成離子化25（4）影響化合物 ESIESI電離的因素l (a）化合物的濃度l (b）基質(zhì)的性質(zhì)l (c) 化合物的表面活性l (d) 流速26離子的釋放取決于濃度. 信號(hào)在 10 M時(shí)達(dá)到飽和. 線性動(dòng)態(tài)范圍限制在2-3個(gè)數(shù)量級(jí)信號(hào)的飽和歸因于離子在液滴表面過(guò)于密集,致使某些樣品離子不能到達(dá)液滴表面.l ESI: 樣品濃度對(duì)其響應(yīng)的影響27

10、28l ESI:ESI: 基質(zhì)對(duì)樣品響應(yīng)的影響基質(zhì)對(duì)樣品響應(yīng)的影響 u 一般而言,樣品信號(hào)強(qiáng)度響應(yīng)隨著其它電解質(zhì)濃度的增高而降低;u 這一現(xiàn)象叫作離子抑制。u 樣品離子和電解質(zhì)離子對(duì)電荷及占據(jù)液滴表面的競(jìng)爭(zhēng)導(dǎo)致離子抑制。表面競(jìng)爭(zhēng)表面競(jìng)爭(zhēng)電荷競(jìng)爭(zhēng)電荷競(jìng)爭(zhēng)29p 基質(zhì)選擇一般原則基質(zhì)選擇一般原則 一般而言，對(duì)于正離子檢測(cè)模式，樣品必須比基質(zhì)更具堿性，以便形成 (M+H)+ 或足夠的極性去形成穩(wěn)定的加和離子，例 (M+NH4)+。 對(duì)于負(fù)離子檢測(cè)模式，樣品必須比基質(zhì)更具酸性，以便形成 (M-H)- 或足夠的極性去形成穩(wěn)定的加和離子，例如 (M+OAc)-。 l ESI:ESI: 基質(zhì)對(duì)樣品響應(yīng)的影響

11、基質(zhì)對(duì)樣品響應(yīng)的影響 30l ESI: ESI: 流速對(duì)樣品響應(yīng)的影響流速對(duì)樣品響應(yīng)的影響 ESI 響應(yīng)隨流速的增加而降低 對(duì) ESI 接口來(lái)說(shuō),最佳工作流速為100-250 L/min.31大氣壓化學(xué)電離源 APCI接口大氣壓化學(xué)電離源APCI特征大氣壓化學(xué)電離源過(guò)程( (二）二） 大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 APCIAPCI32（二）（二） 大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 APCI 1. APCI 1. APCI接口接口霧化霧化332. 大氣壓化學(xué)電離源APCI特征 一般而言, 只生成單電荷離子 幾乎沒(méi)有碎片離子 可能生成加合物和/或多聚體; 一般是溶劑加合物及NH4+ (M+18

12、), Na+ (M+23), 和 K+(M+39)加合物 基質(zhì)影響較小 (相對(duì)于 ESI)。質(zhì)譜圖不受緩沖鹽及其緩沖力變化的影響343. 大氣化學(xué)電離過(guò)程大氣壓化學(xué)電離可分為以下兩個(gè)步驟:l （1）快速蒸發(fā)l （2）氣相化學(xué)電離(電暈放電)35l （1）快速蒸發(fā) 液流被強(qiáng)迫通過(guò)一根窄的管路以使其得到高的線速度 高溫加熱器和噴霧器使液流在脫離管路時(shí)蒸發(fā)成氣體由于溶劑蒸汽的保護(hù)，樣品分子較少受熱裂解的影響，大量的熱量用于溶劑的蒸發(fā)，但是有時(shí)也會(huì)有熱不穩(wěn)定樣品分解36l （2）氣相化學(xué)電離37Needle噴霧針噴霧針（Corona Needle電暈針電暈針reagent gas試劑氣試劑氣離子離子-

13、分子反應(yīng)分子反應(yīng)2. 大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 APCI38大氣壓化學(xué)電離源大氣壓化學(xué)電離源 APCI離子離子-分子反應(yīng)分子反應(yīng)質(zhì)質(zhì) 子子 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn) 移移電電 子子 捕捕 獲獲電電 荷荷 交交 換換離離 子子 加加 和和適合于熱穩(wěn)定、易氣化的小分子低極性化合物適合于熱穩(wěn)定、易氣化的小分子低極性化合物39（三）（三）ESI與與APCI的比較的比較共同點(diǎn)都屬于大氣壓電離法（都屬于大氣壓電離法（APIAPI）通常產(chǎn)生通常產(chǎn)生 (M+H)+ 或或 (M-H)- 等準(zhǔn)分子離子等準(zhǔn)分子離子都使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生氣相離子都使用高電壓元件和霧化氣噴霧法產(chǎn)生氣相離子產(chǎn)生極少的碎片，但可以控制產(chǎn)生

14、結(jié)構(gòu)碎片產(chǎn)生極少的碎片，但可以控制產(chǎn)生結(jié)構(gòu)碎片40ESI與與APCI的比較的比較不同點(diǎn)生成離子方式不同生成離子方式不同樣品兼容性不同樣品兼容性不同流速兼容性不同流速兼容性不同ESI ：液相離子化：液相離子化APCI ：氣相離子化：氣相離子化ESI ：0.2-0.5ml/minAPCI ：0.5-1ml/minESI ：極性化合物和：極性化合物和 生物大分子生物大分子 APCI ：非極性：非極性, 小分子小分子化合物化合物 (相對(duì)于用相對(duì)于用 ESI電電離的化合物而言離的化合物而言) 且有一且有一定的揮發(fā)性定的揮發(fā)性4142 樣品已經(jīng)變成氣相離子 樣品仍處于大氣壓下 必須把樣品送入質(zhì)譜高真空環(huán)境

15、中43 蒸氣通過(guò)樣品錐孔進(jìn)入一級(jí)真空區(qū)(離子源區(qū))并且膨脹 蒸氣在膨脹時(shí)會(huì)冷卻 這種冷卻可能導(dǎo)致在被分析物離子上的溶劑凍結(jié)從而生成各種質(zhì)量數(shù)的簇離子一級(jí)真空一級(jí)真空成簇過(guò)程成簇過(guò)程簇離子會(huì)降低所要檢測(cè)的被分析物質(zhì)量處的信號(hào)；簇離子會(huì)增加背景信號(hào)44l 加熱一級(jí)真空區(qū) (離子源區(qū)) 以阻止簇離子的生成,使不帶溶劑的樣品離子被檢測(cè)l 在通過(guò)加熱的離子源區(qū)以后,樣品離子在靜電場(chǎng)作用下通過(guò)萃取錐孔l 通過(guò)萃取錐孔后, 樣品離子進(jìn)入六極桿聚焦透鏡l 從六極桿聚焦透鏡出來(lái),樣品離子進(jìn)入四極桿質(zhì)量分析器45三三. . 質(zhì)量分析器質(zhì)量分析器 雙聚焦扇形磁場(chǎng)-電場(chǎng)串聯(lián)儀器(sector). 四極質(zhì)譜儀(Q).

16、飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF). 離子阱質(zhì)譜儀（TRAP） 四極四極+TOF+TOF（Q-TOFQ-TOF） 串列式多級(jí)質(zhì)譜儀串列式多級(jí)質(zhì)譜儀三重四極（三重四極（QqQQqQ） (MS/MS) (MS/MS) TOF+TOF TOF+TOF1. 1. 分類(lèi)分類(lèi)46單四極桿分析器單四極桿分析器 QuadrupoleQuadrupole 由四根棒狀電極組成由四根棒狀電極組成直流電壓：直流電壓：DCDC射頻電壓：射頻電壓：RFRF形成二維四極電場(chǎng)形成二維四極電場(chǎng)離子在場(chǎng)的作用下產(chǎn)生振動(dòng)，碰到四極桿而被吸收離子在場(chǎng)的作用下產(chǎn)生振動(dòng)，碰到四極桿而被吸收通過(guò)四極桿的離子到達(dá)檢測(cè)器被檢測(cè)通過(guò)四極桿的離子到達(dá)檢測(cè)器

17、被檢測(cè)2. 2. 四級(jí)桿分析器四級(jí)桿分析器4748通過(guò)改變通過(guò)改變RF，從而改變通過(guò)的離子質(zhì)量，從而改變通過(guò)的離子質(zhì)量離子質(zhì)量離子質(zhì)量時(shí)時(shí) 間間掃描循環(huán)時(shí)間掃描循環(huán)時(shí)間掃描時(shí)間掃描時(shí)間回程回程時(shí)間時(shí)間程程序序處處理理時(shí)時(shí)間間49串聯(lián)質(zhì)量分析器串聯(lián)質(zhì)量分析器空間串聯(lián)空間串聯(lián)時(shí)間串聯(lián)時(shí)間串聯(lián)空間空間 - 時(shí)間串聯(lián)時(shí)間串聯(lián)四極桿串聯(lián)四極桿串聯(lián) Q-Q-Q離子阱離子阱 FTICRQ-Trap都有碰撞活化室都有碰撞活化室50實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類(lèi)型：實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的質(zhì)量分析器類(lèi)型：串聯(lián)四極質(zhì)譜儀(MS/MS) ： 三重四極（QqQ）離子源第一分析器碰撞室第二分析器接收器 MS1 MS2 Q1 q2 Q3

18、第一級(jí)質(zhì)量分析器第一級(jí)質(zhì)量分析器：用于選擇一個(gè)前體離子或母離子，然后，用：用于選擇一個(gè)前體離子或母離子，然后，用適當(dāng)?shù)幕罨椒ㄊ沁@一離子裂解成產(chǎn)物離子或稱子離子及中性碎片。適當(dāng)?shù)幕罨椒ㄊ沁@一離子裂解成產(chǎn)物離子或稱子離子及中性碎片。 mmp p+ + m mf f + +m+mn nmmp p+ + 為前體離子；為前體離子； mmf f+ + 為產(chǎn)物離子；為產(chǎn)物離子； mmn n為中性碎片為中性碎片； 第二級(jí)質(zhì)量分析器第二級(jí)質(zhì)量分析器：用于產(chǎn)物離子分析：用于產(chǎn)物離子分析如從產(chǎn)物中再選擇一個(gè)離子，分析最后選擇的離子的碎片，則標(biāo)如從產(chǎn)物中再選擇一個(gè)離子，分析最后選擇的離子的碎片，則標(biāo)記記MS/MS

19、/MSMS/MS/MS，數(shù)級(jí)可進(jìn)一步增加至，數(shù)級(jí)可進(jìn)一步增加至n n次，實(shí)現(xiàn)次，實(shí)現(xiàn)MSMSn n實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)51串聯(lián)質(zhì)量分析器串聯(lián)質(zhì)量分析器三重四極桿三重四極桿三個(gè)四極桿串聯(lián)三個(gè)四極桿串聯(lián) Q-Q-QQ1 質(zhì)量分離質(zhì)量分離Q2 碰撞活化碰撞活化 CIDCollision-Induced DissociationQ3 質(zhì)量分離質(zhì)量分離52 3. 碰撞誘導(dǎo)解離CID 質(zhì)譜 QqQ 檢測(cè)器中的碰撞反應(yīng)在CID 中進(jìn)行。選擇一定質(zhì)量的離子作為母體離子，進(jìn)入碰撞室，室內(nèi)充有靶子反應(yīng)氣體(本實(shí)驗(yàn)室選擇高純氦) ，發(fā)生離子分子碰撞反應(yīng)，從而產(chǎn)生子離子，再經(jīng)MS2的分析器及接受器得到子離子質(zhì)譜， 一般稱做CID

20、 (collision-induced dissociation)譜。53CID CID 產(chǎn)生的過(guò)程產(chǎn)生的過(guò)程 544. 4. 影響影響CIDCID質(zhì)譜的因素：質(zhì)譜的因素：l 較大影響的因素有：所用碰撞氣體的種類(lèi)，壓力，離子的能量，儀器的配置以及離子電荷狀態(tài)l 由于在不同的儀器上不可能在完全相同的條件下去分析樣品，任何一個(gè)給定的化合物將在不同的條件下給出差別或大或小的質(zhì)譜，尤其是各個(gè)離子峰的相對(duì)豐度的差別幾乎是無(wú)法避免的。因而目前尚難以建立商品化的譜庫(kù)供檢索使用，只能進(jìn)行人工解析或自己建庫(kù)。l 大氣壓電離技術(shù)中產(chǎn)生的離子為偶數(shù)電子離子，其主要的碎片應(yīng)由化學(xué)鍵的誘導(dǎo)斷裂和重排反應(yīng)來(lái)產(chǎn)生，所以在E

21、I質(zhì)譜解析中總結(jié)出的偶數(shù)電子離子的開(kāi)裂規(guī)則一般可適用于CID質(zhì)譜的解釋。55四、掃描方式和掃描模式四、掃描方式和掃描模式p 全掃描(Full Scan)p 子離子掃描(Daughter Scan)p 母離子掃描(Parent Scan)p 中性碎片丟失掃描(Constant Neutral Loss Scan)p 選擇離子監(jiān)測(cè)(SIR)p 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)（一）掃描方式（一）掃描方式（二）掃描模式（二）掃描模式p 正離子模式p 負(fù)離子模式561 1、全掃描、全掃描p 特征：特征：質(zhì)譜掃描得到一段質(zhì)量范圍從而獲得質(zhì)譜圖用于未知物的結(jié)構(gòu)分析用于SIR方法的開(kāi)發(fā)以及MRM方法開(kāi)發(fā)尋找母離子最佳電

22、離參數(shù)Q3Q2Q1= scanned= CID= selected m/zl 定性定性 尋找總分子離子峰尋找總分子離子峰 出峰時(shí)間出峰時(shí)間 57p LC-MS LC-MS中常見(jiàn)的本底離子中常見(jiàn)的本底離子 m/z 50-150, 溶劑離子，(H2O)nH+ ，n= 3-112 m/z 102, H+乙腈 +乙酸, C4H7NO2H+,102.0549 m/z149, 管路中鄰苯二甲酸酯的酸酐, C8H4O3H+,149.0233 m/z 288, 2mm 離心管的產(chǎn)生的特征離子 m/z 279, 管路中鄰苯二甲酸二丁酯 C16H22O4H+, 279.1591 m/z 316, 2mm 離心管的

23、產(chǎn)生的特征離子 m/z 384, 瓶的光穩(wěn)定劑產(chǎn)生的離子 m/z391, 管路中鄰苯二甲酸二辛酯, C24H38O4H+, 391.2843 m/z413, 鄰苯二甲酸二辛酯+鈉, C24H38O4Na+, 413.2668 m/z 538, 乙酸+氧 +鐵（噴霧管）, Fe3O(O2CCH3)6, 537.8793 58Q3Q2Q1= scanned= selected m/z= CIDp 過(guò)程：過(guò)程：通過(guò)Q1 選擇目標(biāo)物質(zhì)的母離子，在Q2 發(fā)生碰撞反應(yīng)，Q3 對(duì)目標(biāo)物質(zhì)豐度最大的子離子進(jìn)行掃描。2 2、子離子掃描、子離子掃描p 特征：特征：監(jiān)測(cè)單個(gè)離子或一系列單個(gè)離子目標(biāo)化合物的跟蹤提高采

24、集靈敏度10023059p 子離子質(zhì)譜圖子離子質(zhì)譜圖用MS2MS2質(zhì)量分析器掃描指定母離子的子離子碎片，所得到的質(zhì)譜圖只能是由指定母離經(jīng)碰撞產(chǎn)生。60p 子離子掃描質(zhì)譜圖61用MS1MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定質(zhì)譜碎片的母離子，所得到的母離子質(zhì)譜峰一定是能丟失指定質(zhì)譜碎片的母離子。p 母離子質(zhì)譜圖 3 3、母離子掃描、母離子掃描62p母離子掃描質(zhì)譜圖母離子掃描質(zhì)譜圖634 4、中性碎片丟失、中性碎片丟失母離子掃描、中性丟失掃描可用來(lái)研究結(jié)構(gòu)相似性化合物（如具有相同結(jié)構(gòu)碎片、或相同結(jié)構(gòu)基團(tuán)的化合物）Q3Q2Q1= scanned= CID= scanned with offset64p 中性碎

25、片丟失掃描質(zhì)譜圖MS1MS1質(zhì)量分析器掃描能丟失指定中性碎片的母離子，MS2MS2質(zhì)量分析器掃描丟失指定中性碎片的離子，所得到的質(zhì)譜圖是由MS1MS1掃描的母離子，母離子只能是丟失指定中性碎片的離子65p 中性碎片丟失掃描質(zhì)譜圖665. 選擇離子掃描Q3Q2Q1= scanned= selected m/z= CID定 量 滿足一般要求 信噪比不如MRM只監(jiān)測(cè)指定的離子67p 選擇離子記錄(SIR)MS1MS1質(zhì)量分析器是靜態(tài)，并且只監(jiān)測(cè)指定的離子。68p 選擇離子記錄掃描 696.多反應(yīng)監(jiān)測(cè)多反應(yīng)監(jiān)測(cè) SRM & MRMSRM & MRMp 特征：特征：監(jiān)測(cè)特定母離子產(chǎn)生特定

26、子離子碎片的化合物目標(biāo)化合物的跟蹤提高采集靈敏度，是靈敏度最高的定量采集方式定定 量量 最佳選擇最佳選擇 干擾小干擾小 信噪比高信噪比高Q3Q2Q1= scanned= selected m/z= CID70p 子離子質(zhì)譜圖子離子質(zhì)譜圖指定的母離子產(chǎn)生一指定的子離子，兩個(gè)質(zhì)量分析器都是靜態(tài)的。71p 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描72串聯(lián)質(zhì)量分析器串聯(lián)質(zhì)量分析器三重四極桿三重四極桿73化合物鑒別化合物鑒別 全掃描方式（全掃描方式（Q1Q1掃描）掃描） 全掃描數(shù)據(jù)采集可以得到化合物的準(zhǔn)分子離子，從而可判斷出化合物的分子量，用于鑒別是否有未知物，并確認(rèn)一些判斷不清的化合物，如合成化合物的質(zhì)量及結(jié)構(gòu)。 子離子分析（

27、子離子分析（ MS/MS MS/MS ） 子離子，用于結(jié)構(gòu)判斷(得到化合物的二級(jí)譜圖即碎片離子)和選擇離子對(duì)作多種反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）。 子離子譜圖與錐體電壓斷裂譜圖（源內(nèi)CID）可能十分相似，所不同的是子離子質(zhì)譜圖已知只有一種質(zhì)量通過(guò)MS1，因此也已知所有碎片離子都是由我們所選定的母離子所產(chǎn)生的，所以我們更相信由MS/MS產(chǎn)生的譜圖的純度。74（二）掃描模式一般的商品儀器中,ESI 和APCI 接口都有正負(fù)離子測(cè)定模式可供選擇。一般不要選擇兩種模式同時(shí)進(jìn)行。正、負(fù)離子模式建議根據(jù)文獻(xiàn)選擇。75正離子模式：正離子模式： 適合于堿性樣品，可用乙酸或甲酸對(duì)樣品加以酸化。樣品中含有仲氨或叔氨時(shí)可優(yōu)先考

28、慮使用正離子模式。2. 2. 負(fù)離子模式：負(fù)離子模式： 適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿化。樣品中有較多的強(qiáng)伏電性基團(tuán)，如含氯、含溴和多個(gè)羥基時(shí)可嘗試使用負(fù)離子模式。（二）掃描模式選擇的一般原則為選擇的一般原則為76檢檢測(cè)測(cè)器器數(shù)數(shù)據(jù)據(jù)分分析析電電 子子 倍倍 增增 管管光光 電電 倍倍 增增 管管電電 子子 倍倍 增增 管管打打 拿拿 極極PCQ3五、檢測(cè)器和真空泵五、檢測(cè)器和真空泵77高真空泵高真空泵 10-6Torr油擴(kuò)散泵油擴(kuò)散泵渦輪分子泵渦輪分子泵極限真空可達(dá)極限真空可達(dá)10-5 -10-6Torr蒸汽噴射泵蒸汽噴射泵泵液蒸汽返流，提高本泵液蒸汽返流，提高本底、易污染系統(tǒng)

29、底、易污染系統(tǒng)五、檢測(cè)器和真空泵五、檢測(cè)器和真空泵78高真空泵高真空泵 10-6Torr油擴(kuò)散泵油擴(kuò)散泵渦輪分子泵渦輪分子泵真空可達(dá)真空可達(dá)10-5 10-6Torr小型蒸汽渦輪機(jī)小型蒸汽渦輪機(jī)高速旋轉(zhuǎn)葉片高速旋轉(zhuǎn)葉片貴、易損貴、易損79真空系統(tǒng)其他附件真空系統(tǒng)其他附件真空規(guī)（真空計(jì)）真空規(guī)（真空計(jì)）真真 空空 管管 道道真真 空空 閥閥 門(mén)門(mén)吸吸 附附 阱阱抽抽 氣氣 方方 式式單泵抽氣方式單泵抽氣方式雙泵差動(dòng)抽氣方式雙泵差動(dòng)抽氣方式801. 1. 樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理：u從保護(hù)儀器角度出發(fā)，防止固體小顆粒堵塞進(jìn)樣管道和噴嘴，防止污染儀器，降低分析背景，排除對(duì)分析結(jié)果的干擾。u要求獲得最

30、佳的分析結(jié)果，從ESI電離的過(guò)程分析：ESI電荷是在液滴的表面，樣品與雜質(zhì)在液滴表面存在競(jìng)爭(zhēng)，不揮發(fā)物（如磷酸鹽等）防礙帶電液滴表面揮發(fā)，大量雜質(zhì)防礙帶電樣品離子進(jìn)入氣相狀態(tài)，增加電荷中和的可能。六、六、 LC-MSLC-MS分離條件的選擇和優(yōu)化分離條件的選擇和優(yōu)化p分離條件選擇分離條件選擇81樣品的預(yù)處理常用方法樣品的預(yù)處理常用方法 a）超濾 b）溶劑萃取去鹽 c）固相萃取 d）灌注（Perfusion）凈化去鹽 e）色譜分離 反相色譜分離 親和技術(shù)分離 f）甲醇或乙腈沉淀蛋白 g）酸水解，酶解 h）衍生化822. 2. 電離源的選擇電離源的選擇 ESI適合于中等極性到強(qiáng)極性的化合物分子，特

31、別是那些在溶液中能預(yù)先形成離子的化合物和可以獲得多個(gè)質(zhì)子的大分子（蛋白質(zhì)）。只要有相對(duì)強(qiáng)的極性，ESI對(duì)小分子的分析常常可以得到滿意的結(jié)果。 APCI不適合多電荷的大分子分析，它的優(yōu)勢(shì)在于非極性或中等極性的小分子的分析。83電離方式電離方式 ESI采用離子蒸發(fā)方式使樣品分子電離，而APCI電離是放電探針促使溶劑和其它反應(yīng)物電離、碰撞及電荷轉(zhuǎn)移等方式形成了反應(yīng)氣等離子區(qū)，樣品分子通過(guò)等離子區(qū)時(shí)，發(fā)生了質(zhì)子轉(zhuǎn)移。樣品流速樣品流速 APCI源允許的流量相對(duì)較大，0.2-2mL/min，而ESI源允許流量相對(duì)較小，最大只能為1.0mL/min。斷裂程度斷裂程度 APCI源的探頭處于高溫，可使熱不穩(wěn)定的

32、化合物分解，產(chǎn)生碎片；ESI源探頭處于常溫，常生成分子離子峰，不易產(chǎn)生碎片。靈敏度靈敏度 都很高。ESI有利于分析生物大分子及其他分子量大的化合物，而APCI更適合于分析極性小的化合物。多電荷多電荷 APCI源不能生成一系列多電荷離子，所以不適合分析生物大分子。而ESI源特別適合于蛋白質(zhì)、多肽類(lèi)的生物分子，由于它能產(chǎn)生一系列的多電荷離子。843. 3. 正負(fù)離子模式的選擇正負(fù)離子模式的選擇l 正離子模式適合于堿性樣品，可用乙酸（pH3-4）或甲酸（pH2-3）對(duì)樣品加以酸化。l 負(fù)離子模式適合于酸性樣品，可用氨水或三乙胺對(duì)樣品進(jìn)行堿化。l 有些酸堿性并不明確的化合物，可優(yōu)先選用APCI（+）進(jìn)

33、行測(cè)定。854. 4. 流動(dòng)相的選擇流動(dòng)相的選擇u 常用的流動(dòng)相為甲醇、乙腈、水和它們不同比例的混合物以及一些易揮發(fā)鹽的緩沖液，如甲酸銨、乙酸銨等，還可以加入易揮發(fā)酸堿如甲酸、乙酸和氨水等調(diào)節(jié)pH值。u LCMS接口避免進(jìn)入不揮發(fā)的緩沖液，避免含磷和氯的緩沖液，含鈉和鉀的成分必須lmmol/l。（鹽分太高會(huì)抑制離子源的信號(hào)和堵塞噴霧針及污染儀器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸銨10一5 mmol/l。u 送樣前一定要摸好LC條件，能夠基本分離，緩沖體系符合MS要求。86 不適合的溶劑和緩沖液不適合的溶劑和緩沖液a 不揮發(fā)的鹽b 表面活性劑/洗滌劑c 無(wú)機(jī)酸 其它溶劑和

34、調(diào)節(jié)劑其它溶劑和調(diào)節(jié)劑a 異丙醇、2-甲氧基乙醇及乙醇等b 三氟醋酸（TFA）常用于LC-MS分析肽和蛋白質(zhì)的化合物c 三乙胺（TEA） d 四氫呋喃（THF)875. 5. 流量和色譜柱的選擇流量和色譜柱的選擇u不加熱ESI的最佳流速是150ulmin，應(yīng)用4.6 mm內(nèi)徑LC柱時(shí)要求柱后分流，目前大多采用 l2.1 mm內(nèi)徑的微柱uAPCI的最佳流速lmlmin，常規(guī)的直徑4.6mm柱最合適。u為了提高分析效率，常采用 100 mm的短柱（此時(shí)UV圖上并不能獲得完全分離，由于質(zhì)譜定量分析時(shí)使用MRM的功能，所以不要求各組分沒(méi)有完全分離）。這對(duì)于大批量定量分析可以節(jié)省大量的時(shí)間。886. 6

35、. 輔助氣體流量和溫度的選擇輔助氣體流量和溫度的選擇u 霧化氣對(duì)流出液形成噴霧有影響，干燥氣影響噴霧去溶劑效果，碰撞氣影響二級(jí)質(zhì)譜的產(chǎn)生。u操作中溫度的選擇和優(yōu)化主要是指接口的干燥氣體而言，一般情況下選擇干燥氣溫度高于分析物的沸點(diǎn)20 左右即可。對(duì)熱不穩(wěn)定性化合物，要選用更低的溫度以避免顯著的分解。u選用干燥氣溫度和流量大小時(shí)還要考慮流動(dòng)相的組成，有機(jī)溶劑比例高時(shí)可采用適當(dāng)?shù)偷臏囟群土髁啃∫稽c(diǎn)的。89用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息用大氣壓電離質(zhì)譜儀可以得到分子量信息 正離子方式常出現(xiàn)如下離子: -Na 22 Da. higher than M+H -K 38 Da. higher tha

36、n M+H -Li 6 Da. higher than M+H -NH4 17 Da. higher than M+H -ACN 40 Da. higher than M+H 2M+H,2M+Na等 負(fù)離子方式常出現(xiàn)如下離子: -TFA 114 Da. higher then M-H (113 and 227 background) -Acetate 60 Da. higher then M-H -Formic 46 Da. higher then M-H -Cl 36 Da. higher than M-H 90影響分子量測(cè)定的因素 1）pH的影響：正離子方式pH要低些，負(fù)離子方式pH要高些

37、，除對(duì)離子化有影響外，還影響LC的峰形。 2）氣流和溫度：當(dāng)水含量高及流量大時(shí)要相應(yīng)增加。 3）溶劑和緩沖液流量：流速適當(dāng)高可以提高出峰的靈敏度。 4）溶劑和緩沖液的類(lèi)型：通常正離子用甲醇好，負(fù)離子乙腈好些 5）選擇合適的液相色譜類(lèi)型：正相、反相、選擇合適的色譜柱 6）合適的電壓：DP電壓高時(shí)，樣品在源內(nèi)分解或碎裂；高DP電壓時(shí)回使多電荷離子比例低，多聚體也減少 7）樣品結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 8）雜質(zhì)的影響：溶劑的純度、水的純凈程度等。當(dāng)成分復(fù)雜，雜質(zhì)太多時(shí)，競(jìng)爭(zhēng)使被測(cè)物離子化不好，同時(shí)使LC分離不好 9）樣品濃度不夠，有時(shí)需要濃縮91分子量測(cè)定失敗的原因 a）流動(dòng)相不合適 b）不揮發(fā)性鹽的影響 c）成

38、分復(fù)雜，雜質(zhì)太多 d) 樣品濃度不夠 e）pH值不合適 f）樣品在源內(nèi)分解或碎裂92一一般般步步驟驟確定離子源、正負(fù)模式確定離子源、正負(fù)模式優(yōu)化流動(dòng)相、離子源參數(shù)，使優(yōu)化流動(dòng)相、離子源參數(shù)，使Q1信號(hào)最大化信號(hào)最大化打開(kāi)打開(kāi)Q2、Q3，優(yōu)化，優(yōu)化CID，確定子離子，確定子離子優(yōu)化優(yōu)化Detector、Scan time等等參數(shù)等等參數(shù)p 分離參數(shù)優(yōu)化分離參數(shù)優(yōu)化93分分析析待待測(cè)測(cè)物物性性質(zhì)質(zhì)極極 性性極性、弱極性極性、弱極性 ：ESI非極性非極性：APCI熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性熱不穩(wěn)定熱不穩(wěn)定 ：ESI熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定：APCI分分 子子 量量310LC-MS/MS 2000特殊性質(zhì)特殊性質(zhì)正正/負(fù)模

39、式負(fù)模式表面活性劑？污染？表面活性劑？污染？影影 響響 定定 性性 結(jié)結(jié) 果果94儀儀器器參參數(shù)數(shù)的的設(shè)設(shè)置置霧化針電壓霧化針電壓霧化氣流量霧化氣流量流動(dòng)相比例、流速流動(dòng)相比例、流速色譜柱色譜柱干燥氣溫度干燥氣溫度干燥氣流量干燥氣流量毛細(xì)管電壓毛細(xì)管電壓碰撞活化能量碰撞活化能量檢測(cè)器電壓檢測(cè)器電壓掃描時(shí)間掃描時(shí)間質(zhì)譜峰寬質(zhì)譜峰寬離子源腔室溫度離子源腔室溫度總總 結(jié)結(jié)95磺磺胺胺吡吡啶啶ESIScan（+）200-300m/zScan（-）200-300m/z確定離子源、正負(fù)模式確定離子源、正負(fù)模式S/N = 1096SIM（+）（）（m/z=250.0）SIM（-）（）（m/z=247.5）S/N = 110097優(yōu)化離子源參數(shù)，使優(yōu)化離子源參數(shù)，使Q1信號(hào)最大化信號(hào)最大化干燥氣溫