分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)2015

1、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 華中師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)?zāi)夸?基本原理 1. 基因組DNA 的提取通常用于構(gòu)建基因組文庫(kù)、Southern 雜交及PCR 分離基因等。 2.不同生物（植物、動(dòng)物、微生物）的基因組DNA 的提取方法有所不同; 不同種類(lèi)或同一種類(lèi)的不同組織因其細(xì)胞結(jié)構(gòu)及所含的成分不同，分離方法也有差異。 3. 在提取某種特殊組織的DNA 時(shí)必須參照文獻(xiàn)和經(jīng)驗(yàn)建立相應(yīng)的提取方法, 以獲得可用的DNA 大分子。尤其是組織中的多糖和酚類(lèi)物質(zhì)對(duì)隨后的酶切、PCR 反應(yīng)等有較強(qiáng)的抑制作用,因此用富含這類(lèi)物質(zhì)的材料提取基因組DNA 時(shí), 應(yīng)考慮除去多糖和酚類(lèi)物質(zhì)。4.核酸是生物有機(jī)體中的重要成分，在生物體

2、中核酸通常與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分為DNA和RNA，在真核生物中，前者主要存在于細(xì)胞核中，后者主要存在于細(xì)胞質(zhì)和核仁里。在制備核酸時(shí)，通過(guò)研磨破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使核蛋白被釋放出來(lái)。5. 植物基因組DNA的提取程序： （1）破碎組織 （2）破壞細(xì)胞膜 （3）去除雜質(zhì) （4）沉淀基因組DNA6. DNA的檢測(cè)方法 （1）紫外分光光度法 （2）電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量 本實(shí)驗(yàn)是通過(guò)SDS法提取擬南芥基因組DNA。1.通過(guò)SDS提取擬南芥基因組DNA;2.為從擬南芥基因組DNA克隆目的基因作準(zhǔn)備二 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膬x器及耗材： 研缽、微量移液器及吸頭、EP管、臺(tái)式離心機(jī)。材 料： 擬南芥小

3、苗試 劑： DNA Extract Buffer (0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5); 70%乙醇；酚；氯仿；異丙醇;RNase儀器、材料和試劑實(shí)驗(yàn)步驟 1. 取一定量的擬南芥組織; 2. 加入600 l抽提緩沖液（0.2M NaCl, 25mM EDTA, 0.5% SDS, pH 7.5），室溫下快速研磨; 3. 把抽提液從研缽中移至1.5 ml 離心管中，混勻; 4. 12,000 rpm, 離心10 min (RT)。取上清，加等體積的酚/氯仿（1：1）混合液，上下顛倒混勻； 5. 12,000 rpm, 5min (RT) ，取上清，加等

4、體積的異丙醇，上下顛倒混勻； 6. 12,000 rpm, 10min (RT) ，棄上清，倒置于吸水紙上待壁上液體流盡后加入1ml的70%乙醇洗沉淀； 7. 12,000 rpm, 5 min (RT) ，棄上清，倒置于紙巾上待其干燥； 8 加20 l ddH2O溶解沉淀; 9.在溶解DNA中加入3-5 l RNase，37消化2-3h； 10.補(bǔ)充ddH2O至總體積400 l ，加入等體積的酚/氯仿，混勻； 11.12000rpm，5min（RT）， 12.取上清，加入1/10體積的乙酸鈉和2倍體積的無(wú)水乙醇，-20 放置10min; 13.12000rpm，4 離心10min； 14.去

5、上清，70%乙醇洗滌沉淀,12000rpm，4 離心5min; 15.去上清，沉淀干燥后，加入20 l ddH2O溶解DNA； 16.分光光度計(jì)法檢測(cè)DNA的濃度和純度。實(shí)驗(yàn)報(bào)告分析A260=1時(shí)相當(dāng)于50 g的雙鏈DNA。A260/A280=1.8，DNA純度高。A260/A2801.9,有RNA的污染或者降解。A260/A230在2.02.5，DNA純度高。A260/A2302.0,有糖類(lèi)，鹽類(lèi)或者有機(jī)溶劑污染。注意事項(xiàng)（1）選用幼嫩植物組織，可減少淀粉類(lèi)的含量。（2）植物組織充分勻漿。（3）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素的影響引起雙鏈解開(kāi)，即“變性”，因此抽提時(shí)避免使用變性的條件。（

6、4）抑制內(nèi)外源DNase的活力。（5）防止化學(xué)降解。（6）防止物理因素降解。思考題.1在擬南芥基因組提取緩沖液中，EDTA和SDS的作用分別是什么？ 1溶液I溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當(dāng)溶液中pH小于8時(shí)，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對(duì)DNA的降解作用（DNase作用時(shí)需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因?yàn)槿芫傅姆磻?yīng)要求有較低的離子強(qiáng)度的環(huán)境。

7、2溶液IINaOHSDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩(wěn)定的。 但當(dāng)pH12或pH3時(shí)，就會(huì)引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。 在溶液II中的NaOH濃度為0.2mo1L，加抽提液時(shí)，該系統(tǒng)的pH就高達(dá)12.6， 因而促使染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性。 SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有： （1）溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細(xì)胞膜。 （2）解聚細(xì)胞中的核蛋白。 （3）SDS能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為R-O-SO3-R-蛋白質(zhì)的復(fù)合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來(lái)。 但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過(guò)程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中

8、 （用RNase去除RNA時(shí)）受到干擾。 3. 溶液III-3molL NaAc（pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調(diào)節(jié)pH至4.8，必須加入大量的冰醋酸。 所以該溶液實(shí)際上是NaAc-HAc的緩沖液。用pH4.8的NaAc溶液是為了把pH12.6的抽提液，調(diào)回pH至中性， 使變性的質(zhì)粒DNA能夠復(fù)性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽的3molL NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、 RNA以及SDS-蛋白復(fù)合物凝聚而沉淀之。前者是因?yàn)橹泻秃怂嵘系碾姾?，減少相斥力而互相聚合， 后者是因?yàn)殁c鹽與SDS蛋白復(fù)合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復(fù)合物，使沉淀更完全。 4為什么用無(wú)水乙醇沉淀DNA？

9、 用無(wú)水乙醇沉淀DNA，這是實(shí)驗(yàn)中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的優(yōu)點(diǎn)是可以任意比和水相混溶， 乙醇與核酸不會(huì)起任何化學(xué)反應(yīng)，對(duì)DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時(shí)，乙醇會(huì)奪去DNA周?chē)乃肿樱笵NA失水而易于聚合。一般實(shí)驗(yàn)中，是加2倍體積的無(wú)水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。 因而也可改用95乙醇來(lái)替代無(wú)水乙醇（因?yàn)闊o(wú)水乙醇的價(jià)格遠(yuǎn)遠(yuǎn)比95乙醇昂貴）。 但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大， 一 實(shí)驗(yàn)原理 PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

10、反應(yīng))是一種選擇性體外擴(kuò)增DNA 的方法.它包括三個(gè)基本步驟: (1) 變性(Denature):目的雙鏈DNA 片段在94下解鏈; (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(56左右)下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì); (3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最適溫度下,以目的DNA 為模板進(jìn)行合成. 由這三個(gè)基本步驟組成一輪循環(huán),理論上每一輪循環(huán)將使目的DNA 擴(kuò)增一倍,這些經(jīng)合成產(chǎn)生的DNA 又可作為下一輪循環(huán)的模板,所以經(jīng)25-35 輪循環(huán)就可使DNA 擴(kuò)增達(dá)待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。PCR原理FLASH演示PCR技術(shù)發(fā)展 PCR是2

11、0世紀(jì)80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍。 PCR技術(shù)是生物科學(xué)領(lǐng)域中的一項(xiàng)革命性創(chuàng)舉和里程碑。 1985年美國(guó)PE-Cetus公司人類(lèi)遺傳研究室的Mullis 等發(fā)明了具有劃時(shí)代意義的聚合酶鏈反應(yīng)。 Mullis因發(fā)明了“聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”而獲得1993年度諾貝爾化學(xué)。 Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大腸桿菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺點(diǎn)是：Klenow酶不耐高溫， 90會(huì)變性失活，每次循環(huán)都要重新加。引物鏈延

12、伸反應(yīng)在37下進(jìn)行，容易發(fā)生模板和引物之間的堿基錯(cuò)配，其PCR產(chǎn)物特異性較差，合成的DNA片段不均一。 Klenow這些缺點(diǎn)給PCR技術(shù)操作程序添了不少困難。這使得PCR技術(shù)在一段時(shí)間內(nèi)沒(méi)能引起生物醫(yī)學(xué)界的足夠重視。 Taq DNA Polymerase 1988年Saiki 等從水生嗜熱桿菌(thermus aquaticus) 中提取耐高溫的Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase) ， 此酶在93下反應(yīng)2h后其殘留活性是原來(lái)的60%。 缺點(diǎn)： Taq DNA Polymerase只有53 聚合酶活性，但沒(méi)有3 5外切活性，無(wú)法消除突變和錯(cuò)配，堿基錯(cuò)誤摻入率可達(dá)10-4/

13、堿基/循環(huán) Pfu DNA Polymerase Pfu DNA 聚合酶是已知保真度最高的聚合酶，來(lái)自于Pyrococcus furiosis 菌株，不僅具有摻入反應(yīng)迅速及熱穩(wěn)定性高的優(yōu)點(diǎn)，更是當(dāng)前市場(chǎng)上所有DNA聚合酶中摻入出錯(cuò)率最低的一種。 優(yōu)點(diǎn)：Pfu具有3 5校閱功能，其錯(cuò)配率分別僅為10-7。 缺點(diǎn)：效率低，擴(kuò)增片段較短 Taq Plus DNA Polymerase 是Taq和Pfu DNA 聚合酶的混合物，與Taq DNA聚合酶相比，具有擴(kuò)增長(zhǎng)度增加（簡(jiǎn)單模板可有效擴(kuò)增20kb,復(fù)雜模板可有效擴(kuò)增10kb), 保真度好的特點(diǎn)；與Pfu DNA 聚合酶相比，具有擴(kuò)增速度快，反應(yīng)效率

14、高的優(yōu)勢(shì)。 PCR反應(yīng)體系組成 模板 5引物和3引物 4 種dNTP DNA 聚合酶 Mg2+ 反應(yīng)緩沖液1. 模板 PCR 反應(yīng)必須以DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增, 模板DNA 可以是單鏈分子,也可以是雙鏈分子,可以是線(xiàn)狀分子,也可以是環(huán)狀分子 就模板DNA 而言,影響PCR 的主要因素: 純純 度度: 蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)會(huì)抑制蛋白、多糖、酚類(lèi)等雜質(zhì)會(huì)抑制PCR反應(yīng)反應(yīng) 完整性完整性: 模板降解會(huì)導(dǎo)致模板降解會(huì)導(dǎo)致PCR擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物 濃濃 度度: 加量過(guò)多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加加量過(guò)多導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增增加2. 引物 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的特異性由一對(duì)上下游引物所決定。引物的好壞往往是PCR

15、成敗的關(guān)鍵 引物影響因素：特異性：特異性： 長(zhǎng)度適當(dāng)、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體長(zhǎng)度適當(dāng)、避免二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體完整性：完整性： 避免反復(fù)凍融避免反復(fù)凍融濃濃 度：度： 應(yīng)適當(dāng)應(yīng)適當(dāng),過(guò)高導(dǎo)致非特異性增加過(guò)高導(dǎo)致非特異性增加,過(guò)低則過(guò)低則 擴(kuò)增產(chǎn)物太少擴(kuò)增產(chǎn)物太少引物設(shè)計(jì)原則(1) 引物長(zhǎng)度： 約為16-30b(2) G+C含量： G+C含量通常為40%-60%, 較短引物可粗略估計(jì)Tm4(G+C)+2(A+T).(3) 四種堿基隨機(jī)分布，在3端不存在連續(xù)3 個(gè)G 或C,因這樣易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。(4) 在引物內(nèi)及兩引物之間, 尤其在3端應(yīng)不存在二級(jí)結(jié)構(gòu)。(5) 引物5端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大, 可在引物設(shè)

16、計(jì)時(shí)加上限制酶位點(diǎn)。 (6)引物不與模板結(jié)合位點(diǎn)以外的序列互補(bǔ)4 種 dNTP 濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融濃度適當(dāng)，避免反復(fù)凍融 dNTP 原液配成10mM或者2.5mM分裝,-20oC貯存。 一般反應(yīng)中每種dNTP 的終濃度為20-200M。當(dāng)dNTP 終濃度大于50mM 時(shí)可抑制Taq DNA 聚合酶的活性. 4 種dNTP 的濃度應(yīng)該相等,以減少合成中由于某種dNTP 的不足出現(xiàn)的錯(cuò)誤摻入。Mg2+ 過(guò)高非特異性嚴(yán)重，過(guò)低無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)高非特異性嚴(yán)重，過(guò)低無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物 Mg2+濃度對(duì)DNA 聚合酶影響很大,它可影響酶的活性,影響引物退火和解鏈溫度, 影響產(chǎn)物的特異性以及引物二聚體的形成等。 通常

17、Mg2+濃度范圍為0.5-3mM。 試劑公司通常會(huì)將Mg2+加入到DNA 聚合酶的反應(yīng)緩沖液中： 10Reaction Buffer (including Mg2+) 10Reaction Buffer (without Mg2+)DNA 聚合酶Taq DNA Polymerase活性半衰期為95 40min, 97 5min.Taq DNA 聚合酶的酶活性單位定義為74下,30min,摻入10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量。Taq DNA 聚合酶的一個(gè)致命弱點(diǎn)是它的出錯(cuò)率,一般PCR 中出錯(cuò)率為210-4 核苷酸/每輪循環(huán),100l PCR 反應(yīng)中,1.5-2 單位的Taq DN

18、A 聚合酶就足以進(jìn)行30 輪循環(huán). 反應(yīng)結(jié)束后，如果需要利用這些產(chǎn)物進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),需要預(yù)先滅活Taq DNA 聚合酶, 滅活Taq DNA 聚合酶的方法有：(1) PCR 產(chǎn)物經(jīng)酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L 的EDTA螯合Mg2+ 。 (3) 99-100加熱10min.目前已有直接純化PCR 產(chǎn)物的Kit 可用。Taq /Pfu /Taq Plus DNA Polymerase DNA 聚合酶單位定義：1個(gè)酶單位是指在以下分析條件下，于74，30min內(nèi)使10nmol/L的dNTP摻入核酸中所需的酶。 不同公司提供的酶U的定義也不同。反應(yīng)緩沖液 各種DNA聚合酶都

19、有自己特定反應(yīng)緩沖液； Taq DNA Polymerase反應(yīng)緩沖液一般含： 10-50mM TrisCl (20下pH8.3-8.8) 50mM KCl 適當(dāng)濃度的Mg2+ 緩沖液緩沖液 10 mmol/l Tris.Cl 提供適合反應(yīng)的pH值（pH 8.4） 50 mmol/l KCl促進(jìn)引物退火 10 g/ml 明膠或血清白蛋白 為T(mén)aq酶的保護(hù)劑PCR反應(yīng)反應(yīng)主要參數(shù)：主要參數(shù)：1. 預(yù)變性：預(yù)變性：94C， 3-5min2. 變性：變性： 94C，30s-1min3. 復(fù)性：復(fù)性： 56 C，20s-2min4. 延伸：延伸： 72 C，30s-3min5. 總延伸：總延伸：72

20、C， 10min預(yù)變性和變性 在第一輪循環(huán)前,在94下變性35min 非常重要,它可使模板DNA 完全解鏈 。變性不完全,往往使PCR失敗,因?yàn)槲醋冃酝耆腄NA雙鏈會(huì)很快復(fù)性,減少DNA產(chǎn)量. 一般變性溫度與時(shí)間為94 1min。在變性溫度下,雙鏈DNA 解鏈只需幾秒鐘即可完全,所耗時(shí)間主要是為使反應(yīng)體系完全達(dá)到適當(dāng)?shù)臏囟取Ｍ嘶?引物退火的溫度和所需時(shí)間的長(zhǎng)短取決于引物的堿基組成，引物的長(zhǎng)度、引物與模板的配對(duì)程度以及引物的濃度.實(shí)際使用的退火溫度比擴(kuò)增引物的Tm 值約低5。 通常退火溫度和時(shí)間為55左右,1-2min。延伸 延伸反應(yīng)通常為72,接近于Taq DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度75.

21、實(shí)際上。 延伸反應(yīng)時(shí)間的長(zhǎng)短取決于目的序列的長(zhǎng)度和濃度。Taq DNA 聚合酶每分鐘約可合成2kb 長(zhǎng)的DNA。 一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后,都需要一步較長(zhǎng)時(shí)間(10-30min)的延伸反應(yīng),以獲得盡可能完整的產(chǎn)物, 這對(duì)以后進(jìn)行克隆或測(cè)序反應(yīng)尤為重要。循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)主要取決于DNA 濃度。一般而言25-30 輪循環(huán)已經(jīng)足夠。 循環(huán)次數(shù)過(guò)多,會(huì)使PCR 產(chǎn)物中非特異性產(chǎn)物大量增加。1.通過(guò)PCR從擬南芥基因組中擴(kuò)增目的基因片段2.學(xué)習(xí)PCR儀等儀器的使用實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟牧希簲M南芥基因組DNA器材：移液器及吸頭，PCR 管， PCR儀，臺(tái)式離心機(jī)。實(shí)驗(yàn)材料和器材所需試劑10PCR 反應(yīng)緩沖液 dNTP

22、Mix:每種10 mM 5和3引物：各10 pmol/l （10mmol/L） Taq DNA 聚合酶 5U/l 無(wú)菌去離子水；實(shí)驗(yàn)步驟1. 在PCR管中依次混勻下列試劑(總體積50l ) 5 l 10Buffer (Including MgCl2) 1l dNTP mix （各10 mM ） 1l 5上游引物 （ 10M ） 1l 3下游引物 （ 10M ） 模板DNA (1000 ng) 0.25 l Taq DNA聚合酶 補(bǔ)充ddH2 O 至50l 混勻后短暫離心（點(diǎn)離）。2. 將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子3. 用94oC預(yù)變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1 分鐘

23、, 72oC延伸2 分鐘, 30個(gè)循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72oC下保溫10 分鐘，4. 終止反應(yīng)，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存 1.PCR 非常靈敏, 盡可能避免污染。吸頭、離心管應(yīng)高壓滅菌, 每次吸頭用畢應(yīng)更換, 不要互相污染試劑； 2.加試劑前, 應(yīng)短促離心10 秒鐘, 然后再打開(kāi)管蓋, 以防手套污染試劑及管壁上的試劑污染吸頭側(cè)面； 3.應(yīng)設(shè)含除模板DNA 所有其它成分的負(fù)對(duì)照。注意事項(xiàng)思考題 簡(jiǎn)述PCR技術(shù)克隆的主要原理。一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖

24、的濃度。性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶影響DNA 遷移速率因素DNA分子泳動(dòng)主要的因素分兩方面：DNA分子特性和電泳條件。1. DNA 的分子大小:2. DNA 分子的構(gòu)象3. 瓊脂糖濃度4. 電源電壓5. 嵌入染料的存

25、在6. 離子強(qiáng)度影響 瓊脂糖是從瓊脂中分離得到，由1,3連接的吡喃型b-D-半乳糖和1,4連接的3,6脫水吡喃型阿a-L-半乳糖組成，形成相對(duì)分子量為104105的長(zhǎng)鏈。 瓊脂糖加熱溶解后分子呈隨機(jī)線(xiàn)團(tuán)狀分布，當(dāng)溫度降低時(shí)鏈間糖分子上的羥基通過(guò)氫鍵作用相連接，形成孔徑結(jié)構(gòu)，而隨著瓊脂糖濃度不同形成不同大小的孔徑 瓊脂糖濃度(%)線(xiàn)型DNA分子的分離范圍(Kb)0.35600.61200.70.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12瓊脂糖凝膠的濃度與DNA分離范圍核酸電泳緩沖液有三種Tris-乙酸(TAE) 、Tris-硼酸(TBE)和 Tris-磷酸(TPE). DN

26、A電泳上樣緩沖液電泳上樣緩沖液 DNA Loading Buffer作用 1.螯合Mg2，防止電泳過(guò)程中DNA被降解，一般上樣緩沖液中含10mM EDTA。 2. 增加樣品密度以保證DNA沉入加樣孔，一般上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖，這樣可以增加樣品的比重。 3. 指示劑監(jiān)測(cè)電泳的行進(jìn)過(guò)程，一般加入泳動(dòng)速率較快的溴酚藍(lán)指示電泳的前沿，它的速率約與300bp的線(xiàn)狀雙鏈DNA相同。DNA電泳的標(biāo)準(zhǔn)分子量電泳的標(biāo)準(zhǔn)分子量 目前各廠(chǎng)商開(kāi)發(fā)了各種類(lèi)型的標(biāo)準(zhǔn)分子量，有廣泛用于PCR產(chǎn)物鑒定的小分子Marker，也有常規(guī)用的大分子Marker常用的DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量電泳圖 二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1

27、 掌握瓊脂糖凝膠電泳分離掌握瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的的原理和方法原理和方法2 通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCRPCR擴(kuò)擴(kuò)增的目的基因增的目的基因儀器及耗材：天平、電泳設(shè)備、臺(tái)式離心機(jī)、稱(chēng)量紙、藥勺、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、三角瓶、微波爐、凝膠成像系統(tǒng)。材 料： PCR產(chǎn)物試 劑： 瓊脂糖，1TAE電泳緩沖液電泳緩沖液、溴化乙錠（溴化乙錠（EB）、6Loading buffer、無(wú)菌去離子水、DNA Marker；三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 1g 瓊脂糖加入瓊脂糖加入100ml 0.5TAE電泳緩沖液中，電泳緩沖液中

28、，搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。搖勻。在微波爐中加熱至瓊脂糖完全溶解。2. 將制膠板放好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊將制膠板放好，插入適當(dāng)梳子，將溶解的瓊脂糖（約脂糖（約50）倒入，室溫冷卻凝固）倒入，室溫冷卻凝固3. 充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出充分凝固后將膠板取出，小心垂直向上拔出梳子，置入電泳槽中，加梳子，置入電泳槽中，加0.5TAE電泳緩沖電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠液至液面覆蓋凝膠1-2mm。4. 用移液器吸取用移液器吸取3l 的的6loading buffer于封口膜上，于封口膜上，再加入再加入5l DNA樣品，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。樣品，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔。 5

29、. 打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，一般紅色為正極黑色為負(fù)極一般紅色為正極黑色為負(fù)極，調(diào)調(diào)節(jié)電壓至節(jié)電壓至3-5V/cm，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，電泳約正極移動(dòng)，電泳約30min-60min。6. 在瓷盤(pán)中加入適量的水，再加入在瓷盤(pán)中加入適量的水，再加入5 510l EB10l EB，將凝膠放入盤(pán)中將凝膠放入盤(pán)中5 510 10 分鐘分鐘 7. 將凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)，在紫外燈下檢測(cè)將凝膠置于凝膠成像儀內(nèi)，在紫外燈下檢測(cè)PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)物的DNADNA條帶條帶思考題 瓊脂糖凝膠電泳中DNA分子遷移率受哪些因素影響？1、DNA的分子大小及構(gòu)型 2、瓊脂糖濃度3

30、、DNA分子的構(gòu)象4、電源電壓5、嵌入染料的存在 6、離子強(qiáng)度影響 一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理目的基因與載體連接 平末端連接 粘性末端連接 T載體策略連接平末端連接 Taq DNA 聚合酶往往在PCR 產(chǎn)物3端加上多余的非模板依賴(lài)堿基,在用平末端連接克隆PCR 產(chǎn)物前,可用Klenow 片段或T4 DNA 聚合酶處理補(bǔ)平末端。 有些DNA聚合酶（pfu DNA 聚合酶）擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為平端，可以直接用于平端連接粘性末端連接 利用引物中附加在5端的限制酶位點(diǎn),直接將PCR 產(chǎn)物經(jīng)適當(dāng)?shù)南拗泼盖懈詈螽a(chǎn)生粘性末端,與載體連接,產(chǎn)生重組DNA. 如果下游兩個(gè)引物中含有兩個(gè)不同的限制酶位點(diǎn).經(jīng)酶切后定向

31、克隆到載體中。T-載體連接 TaqDNA聚合酶能在平端雙鏈DNA的3末端加一個(gè)非模板依賴(lài)堿基(A或T),所加堿基多為A。 利用這一特點(diǎn),可以經(jīng)限制酶(如EcoRV)切割載體,使其產(chǎn)生平末端,再利用Taq DNA聚合酶向載體雙鏈DNA的3末端加上T ,使載體與PCR 產(chǎn)物末端互補(bǔ)并進(jìn)行連接 pMD18-T Vector pMD18-T Vector是一種高效克隆PCR產(chǎn)物（TA Cloning）的專(zhuān)用載體。用EcoR V進(jìn)行酶切反應(yīng)后，再在兩側(cè)的3端添加“T”而成。，本制品中的高效連接液Solution I可以在短時(shí)間內(nèi)（約30分鐘）完成連接反應(yīng)，大大方便了實(shí)驗(yàn)操作。pMD18-T Vector

32、的結(jié)構(gòu)二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 通過(guò)通過(guò)T T載體策略進(jìn)行目的基因與載體策略進(jìn)行目的基因與載體的連接載體的連接儀器及耗材：臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、EP管、封口膜、水浴鍋。材 料： PCR產(chǎn)物試 劑： 無(wú)菌去離子水；pMD18-T 三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟 1.將PCR產(chǎn)物移入1.5mLEP管中，加去離子水至400 l，加入1/10倍體積的3MNaAc和2.5倍體積的無(wú)水乙醇，混勻，-20放置10min； 2.12000rpm，4，離心10min； 3.去上清，將EP管倒置于吸水紙上； 4.向EP管加入適量70%乙醇，將DNA沉淀重懸；

33、 5.12000rpm， 4，離心5min； 6.去上清，倒置吸水紙上，晾干，加入10 l去離子水溶解DNA。7.測(cè)定測(cè)定DNA的濃度；的濃度；8.沉淀的目的基因沉淀的目的基因DNA與與T載體連接：載體連接：取一新的取一新的PCR管，加入下列反應(yīng)成分管，加入下列反應(yīng)成分(總體積總體積10l) ： 目的目的 DNA 4.5 ll (0.1 pmol0.3 pmol) pMD18-T Vector 0.5 l 加入加入5 l（等量）的（等量）的 Solution I；9. 16OC水浴中反應(yīng)水浴中反應(yīng)30分鐘。分鐘。10.將連接產(chǎn)物將連接產(chǎn)物-20保存。保存。思考題 簡(jiǎn)述目的DNA片段與載體連接的

34、不同策略。實(shí)驗(yàn)五 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備一 實(shí)驗(yàn)原理 在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主內(nèi),但在人工構(gòu)建的質(zhì)粒載體中,一般缺乏此種轉(zhuǎn)移所必需的mob基因,因此不能憑自己的能力進(jìn)入細(xì)菌 。如需將質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體細(xì)菌，需誘導(dǎo)受體細(xì)菌產(chǎn)生一種短暫的感受態(tài)以攝取外源DNA。 細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)叫感受態(tài)。感受態(tài)細(xì)胞制備方法化學(xué)法: CaCl2 處理后細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了暫時(shí)性的改變,成為能允許外源DNA分子進(jìn)入的感受態(tài)細(xì)胞 ;物理法: 大腸桿菌暴露在電荷中時(shí)，其細(xì)胞膜會(huì)不穩(wěn)定而誘導(dǎo)形成孔洞，于是DNA分子可由該孔進(jìn)入細(xì)胞。感受態(tài)細(xì)胞制備中應(yīng)注意因素1.細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和

35、密度 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于的培養(yǎng)菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。 細(xì)胞生長(zhǎng)密度以剛進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)為好，可通過(guò)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液的OD600 來(lái)控制。DH5菌株的OD600 為0.5 時(shí),細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml 左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。密度過(guò)高或不足均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率。2. 試劑的質(zhì)量 所用的試劑,如CaCl2 等均需較高純度，冰箱保存。3. 防止雜菌和雜DNA 的污染 整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA 酶或雜DNA所

36、污染。二 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.學(xué)習(xí)以 E.coli DH5菌株為受體細(xì)胞，用CaCl2處理受體菌使其處于為感受態(tài)；2. 制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，為轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、細(xì)菌投布器、三角瓶、牙簽、恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)、冷凍離心機(jī)、1.5mL離心管、無(wú)菌工作臺(tái)材 料： E. coli DH5菌株試 劑： LB 固體和液體培養(yǎng)基、 100 mM CaCl2、甘油。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑LB 液體培養(yǎng)基(Luria-Bertani)配方： 蛋白胨(Tryptone) 1 g 酵母提取物(Yeast extract) 0.5 g NaCl 1 g 加去離子

37、水至總體積100 mL，用NaOH 調(diào)pH 至7.0,高壓滅菌LB 固體培養(yǎng)基配方：每100mL LB液體培養(yǎng)基中加1.2g 瓊脂粉,高壓滅菌。四 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟 菌株活化1用接種環(huán)直接取凍存的大腸桿菌DH5，在LB培養(yǎng)基平板表面劃線(xiàn)，于37培養(yǎng)16小時(shí)；2挑取一個(gè)單菌落，轉(zhuǎn)到10 ml LB培養(yǎng)基中，于37培養(yǎng)35小時(shí)；3將培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)到100mlLB培養(yǎng)基中培養(yǎng)23小時(shí)，到OD600 0.45-0.55感受態(tài)細(xì)胞制備4. 將1.5ml菌液轉(zhuǎn)入離心管中，冰上10 min;5.4oC，4,000 rpm，離心5 min；6. 去上清，將沉淀重懸于0.5 ml用冰預(yù)冷的 100 mM CaCl

38、2中，置于冰上10 min；7. 4oC，4,000 rpm，離心5 min；8. 去上清，將沉淀重懸于100L用冰預(yù)冷的 100 mM CaCl2溶液中，再加入75%甘油至終濃度 為15-20% (25l),混勻；9. 即成感受態(tài)細(xì)胞，-70oC冰箱中保存.思考題 感受態(tài)細(xì)胞有什么特點(diǎn)？簡(jiǎn)述感受態(tài)細(xì)胞制備的原理特點(diǎn)：處于最適攝取和容納外來(lái)DNA的生理狀態(tài)CaCl2法：操作： 1.將快速生長(zhǎng)的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成復(fù)合物。2.此時(shí)，將該體系轉(zhuǎn)移到42下做短暫的熱刺激，外源DNA就可能被細(xì)胞

39、吸收。進(jìn)入細(xì)胞的外源DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)，實(shí)現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。3.將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，篩選出帶有外源DNA分子的陽(yáng)性克隆。意義：將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，不僅可以檢驗(yàn)重組載體是否構(gòu)建成功，最主要的是感受態(tài)細(xì)胞作為重組載體的宿主可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如蛋白質(zhì)表達(dá)純化等工作。 實(shí)驗(yàn)六 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌一 實(shí)驗(yàn)原理 轉(zhuǎn)化(Transformation)是將外源DNA 分子引入受體細(xì)胞,使之獲得新的遺傳性狀的一種手段,它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領(lǐng)域的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞與重組質(zhì)粒DNA放置在冰浴(0oC)，CaCl

40、2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)突然熱激（42oC）處理，更有利于細(xì)胞對(duì)DNA復(fù)合物的攝取，外源DNA分子通過(guò)吸附、轉(zhuǎn)入、自穩(wěn)而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并且開(kāi)始進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。 將細(xì)菌放置在非選擇性培養(yǎng)基中保溫一段時(shí)間，促使在轉(zhuǎn)化過(guò)程中獲得的新的表型(如Ampr等)得到表達(dá)，然后將此細(xì)菌培養(yǎng)物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養(yǎng)基上。 分子轉(zhuǎn)化分以下幾步:吸附雙鏈分子吸附于受體菌表面；轉(zhuǎn)入雙鏈分子解鏈。一條鏈進(jìn)入受體菌，另一條降解； 自穩(wěn)外源質(zhì)粒分子在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制成雙鏈；表達(dá)一供體基因隨同復(fù)制子同時(shí)復(fù)制，分裂， 轉(zhuǎn)錄翻譯。二 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?將目的

41、基因與質(zhì)粒的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌（重組載體的篩選最準(zhǔn)備儀器及耗材：培養(yǎng)皿、細(xì)菌投布器、三角瓶、恒溫?fù)u床、電熱恒溫培養(yǎng)箱、水浴鍋、無(wú)菌工作臺(tái)材 料： 目的基因與載體的連接產(chǎn)物；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞試 劑： LB 固體和液體培養(yǎng)基、氨芐青霉素(100 mg/mL)、IPTG (200 mg/mL) 、X-gal (20mg/mL),。三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑氨芐青霉素(Amp)配置： 無(wú)菌水配制氨芐青霉素成100 mg/mL 溶液，過(guò)濾除菌，-20oC冰箱保存；X-gal配置： 將X-gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20 mg/mL濃度的溶液，裝于玻璃或聚丙烯管中，以錫鉑紙包裹

42、避光保存于-20oC， X-gal不需要過(guò)濾除菌；IPTG配置： 將2 g IPTG溶于8 mL水中，用水調(diào)節(jié)體積到10 mL, 過(guò)濾除菌， -20oC冰箱保存。固體LB平板的準(zhǔn)備1. 固體LB培養(yǎng)基的配置：每100 mL液體LB培養(yǎng)基加入1.2 g瓊脂粉，pH 7.0，高溫滅菌；2. 固體LB培養(yǎng)基融化后，冷卻到50oC，加入氨芐青霉素（100g/mL），再倒入滅菌的平板內(nèi)；3.在LB固體培養(yǎng)基表面均勻投布4L IPTG (200 mg/mL)和40L x-gal (20mg/mL),吹干;四 實(shí)驗(yàn)步驟4. 從-70oC冰箱中取出感受態(tài)細(xì)胞,置冰上解凍；5. 在超凈臺(tái)上，取 10 l 連接產(chǎn)

43、物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，充分混勻，冰上放置30 min；6. 42oC熱激處理90 sec，熱擊后迅速置于冰上冷卻3-5 分鐘； 7.加入600800 l無(wú)抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37oC，5060 rpm溫育45 min，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因； 8.菌液均勻涂布到含有抗生素（Amp 100 g/ml,并均勻的涂布有IPTG和X-gal）的LB平板上吹干，將培養(yǎng)皿倒置于37oC，培養(yǎng)16 h； 思考題 觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，你的平板上出現(xiàn)單菌落沒(méi)有？分析總結(jié)一下影響轉(zhuǎn)化效率的因素。4.2.1 細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度 最好從-70甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的

44、菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5107個(gè)左右為佳。即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600控制。 4.2.2 質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但外源DNA的量過(guò)多時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。一般來(lái)說(shuō)，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低。此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線(xiàn)性重組質(zhì)粒高10100倍。 4.2.3 試劑的質(zhì)量 化合

45、物及無(wú)機(jī)離子的影響：所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，分裝保存于4。在Ca2+的基礎(chǔ)上聯(lián)合其他二價(jià)金屬離子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或還原劑等物質(zhì)處理細(xì)菌，可使轉(zhuǎn)化效率大大提高。 4.2.4 防止雜菌和雜DNA的污染 整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管、移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的制劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。實(shí)驗(yàn)七 陽(yáng)性克隆的鑒定和篩選 將目的基因與載體進(jìn)行連接形成重組子并轉(zhuǎn)化后，在連接產(chǎn)物中既有載體和目的基因的連接，也有載體的自連和目的基因的自連，更多

46、的是未發(fā)生連接反應(yīng)的載體和目的DNA片斷。這就需要我們對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行鑒定和篩選，將含有外源DNA的宿主細(xì)胞和不含外源DNA的宿主細(xì)胞分開(kāi)，將含有正確重組子的宿主細(xì)胞和含有其他外源DNA的宿主細(xì)胞分開(kāi)。一 實(shí)驗(yàn)原理 在我們的實(shí)驗(yàn)中，目的基因與T載體(pMD18-T)連接產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化E. coli DH5菌株。由于pMD18-T 上帶有Ampr 和lacZ 基因,故重組子的篩選首先采用Amp 抗性篩選與-互補(bǔ)現(xiàn)象篩選相結(jié)合的方法。pMD18-T Vector的結(jié)構(gòu) 因pMD18-T帶有Ampr 基因而外源片段上不帶該基因,故轉(zhuǎn)化受體菌后只有帶有pMD18-T DNA 的轉(zhuǎn)化子才能在含有Amp 的LB

47、 平板上存活下來(lái)（質(zhì)粒自身環(huán)化和重組載體）;而只帶有自身環(huán)化的外源片段的轉(zhuǎn)化子則不能存活。此為初步的抗性篩選。-互補(bǔ) pMD18-TpMD18-T上帶有上帶有-半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因(lacZ)(lacZ)的調(diào)控序列的調(diào)控序列和和-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N N 端端146 146 個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)個(gè)氨基酸的編碼序列。這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn), ,但并沒(méi)有破壞但并沒(méi)有破壞lacZ lacZ 的閱讀框架的閱讀框架, ,不影響其正常功能。不影響其正常功能。E. coli DH5E. coli DH5菌株菌株帶有帶有-半乳糖苷酶半乳糖苷酶C C 端部分序

48、列的編碼信息。在各自端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下獨(dú)立的情況下, pMD18-T , pMD18-T 和和DH5DH5編碼的編碼的-半乳糖苷半乳糖苷酶的片段都沒(méi)有酶活性。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼酶的片段都沒(méi)有酶活性。當(dāng)這種載體轉(zhuǎn)入可編碼 半半乳糖苷酶乳糖苷酶C C端部分序列的宿主細(xì)胞中時(shí)，在異丙基端部分序列的宿主細(xì)胞中時(shí)，在異丙基- - -D-D硫代半乳糖苷（硫代半乳糖苷（IPTGIPTG）的誘導(dǎo)下，）的誘導(dǎo)下，宿主可同時(shí)合成這宿主可同時(shí)合成這兩種肽段，兩種肽段，雖然它們各自都沒(méi)有酶活性，但它們可以雖然它們各自都沒(méi)有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱(chēng)這種現(xiàn)象融為一體

49、形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。所以稱(chēng)這種現(xiàn)象為為 - -互補(bǔ)現(xiàn)象?；パa(bǔ)現(xiàn)象。 由互補(bǔ)產(chǎn)生的由互補(bǔ)產(chǎn)生的 半乳糖苷酶半乳糖苷酶( (LacLacZ)Z)能夠作用能夠作用于生色底物于生色底物5 5溴溴4 4氯氯3 3吲哚吲哚 D D半乳糖苷半乳糖苷(X-gal)(X-gal)而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所以利而產(chǎn)生藍(lán)色的菌落，所以利用這個(gè)特點(diǎn)，在載體的該基因編碼序列之間人用這個(gè)特點(diǎn)，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個(gè)多克隆位點(diǎn)，當(dāng)插入一個(gè)外源工放入一個(gè)多克隆位點(diǎn)，當(dāng)插入一個(gè)外源DNADNA片段時(shí)，會(huì)造成片段時(shí)，會(huì)造成LacLacZ(Z( ) )基因的失活，破壞基因的失活，破壞 - -互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活

50、性的酶。所以，互補(bǔ)作用，就不能產(chǎn)生具有活性的酶。所以，有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒(méi)有重組質(zhì)粒的有重組質(zhì)粒的菌落為白色，而沒(méi)有重組質(zhì)粒的菌落為藍(lán)色。菌落為藍(lán)色。重組重組DNADNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌過(guò)轉(zhuǎn)化細(xì)菌過(guò)程示意圖程示意圖菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆 并不是所有白斑菌落是含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落，存在假陽(yáng)性現(xiàn)象?？梢酝ㄟ^(guò)菌落PCR進(jìn)一步鑒定含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落。 常規(guī)的PCR鑒定需要進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取等多步操作后才能進(jìn)行基因擴(kuò)增，操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，為了簡(jiǎn)化操作程序，Gussow和Clackon提出菌落PCR方法，即用無(wú)菌牙簽挑取單菌落到TE緩沖液中，煮沸5min，渦旋振蕩后短暫離心，用12L裂解液作D

51、NA模板，這樣就省去了抽提模板DNA這一步，大大節(jié)省了時(shí)間和成本。 后來(lái)該方法進(jìn)一步改進(jìn)，利用牙簽直接沾取一點(diǎn)單菌落作為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)更大量節(jié)省了時(shí)間，簡(jiǎn)化了操作程序，單菌落PCR可以有效的篩選陽(yáng)性重組克隆。二 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?. 學(xué)習(xí)通過(guò)藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性重組菌落；2.學(xué)習(xí)菌落PCR技術(shù)及通過(guò)菌落PCR鑒定白斑菌落。儀器及耗材：培養(yǎng)皿、電熱恒溫培養(yǎng)箱、無(wú)菌工作臺(tái)、牙簽、PCR管、各種tip、PCR儀。材 料： 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化后的菌落平板三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑試 劑： LB 液體培養(yǎng)基 氨芐青霉素(100 mg/mL) 10PCR 反應(yīng)緩沖液; dNTP Mix(每種2.5mM

52、); 5和3引物（10mM）; Taq DNA 聚合酶 2.5U/l; 無(wú)菌去離子水；1.建立PCR體系 (總體積20l ) 可以以小組為單位，現(xiàn)將上述各試劑混合，再分裝，如小組為4人，就在EP管中加入4倍體積的上述各組分（除菌液），在分裝到PCR管，這樣便于試劑取樣。 ddH2O 16.4 82l 10Buffer (Including MgCl2) 2.0 10l dNTP mix （各10 mM ） 0.4 2l 5上游引物 （ 10M ） 0.4 2l 3下游引物 （ 10M ） 0.4 2l Taq DNA聚合酶 0.4 2l2. 用牙簽從LB固體平板上挑取白斑單菌落在PCR管中攪拌

53、。四 實(shí)驗(yàn)步驟3. 將PCR管放置到PCR儀中，蓋好蓋子；4. 用94oC預(yù)變性3-5分鐘；94oC變性1分鐘，58oC退火1 分鐘, 72oC延伸2 分鐘, 32個(gè)循環(huán)；最后一輪循環(huán)結(jié)束后, 于72oC下保溫10 分鐘；5. 終止反應(yīng)，從PCR儀取出PCR管，放置4oC存。五 注意事項(xiàng)1. X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖以半乳糖苷酶水解后生成的吲哚衍生物顯藍(lán)色。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。3. 在含有X-gal、IPTG的篩選培養(yǎng)基上，攜帶載體DNA的轉(zhuǎn)化子為藍(lán)色菌落，而攜帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落，平板如在37培

54、養(yǎng)后放于冰箱3-4小時(shí)可使顯色反應(yīng)充分，藍(lán)色菌落明顯。思考題 簡(jiǎn)述利用藍(lán)白斑篩選重組子的原理一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 從細(xì)菌中分離質(zhì)粒DNA 方法包括3 個(gè)基本步驟: 1.培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增； 2.收集和裂解細(xì)胞; 3.分離和純化質(zhì)粒DNA。1. 細(xì)菌培養(yǎng) 質(zhì)粒的擴(kuò)增與質(zhì)粒在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的拷貝數(shù)和細(xì)菌個(gè)數(shù)正相關(guān)。 質(zhì)?？截悢?shù)是指在正常生長(zhǎng)條件下，每個(gè)細(xì)菌細(xì)胞所對(duì)應(yīng)的平均質(zhì)粒數(shù)。在質(zhì)粒復(fù)制子調(diào)控下，質(zhì)粒拷貝數(shù)可隨細(xì)菌培養(yǎng)條件變化而在較窄的范圍波動(dòng)，生長(zhǎng)條件恒定，質(zhì)粒增殖速度與宿主細(xì)胞增殖速度完全一致，拷貝數(shù)保持不變。2.細(xì)菌的收獲與裂解 細(xì)菌的收獲可以通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行； 細(xì)菌的裂解可以采用多種方法，

55、這些方法包括非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及加熱處理等。 采用何種方法取決于三個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、大腸桿菌菌株和裂解后用于純化質(zhì)粒DNA技術(shù)。 大質(zhì)粒（15kb）采用溫和方法 小質(zhì)粒（15kb ）可采用較劇烈方法 有些大腸桿菌菌株不能采用加熱的方法裂解；3. 分離和純化質(zhì)粒DNA 當(dāng)用強(qiáng)熱或酸、堿處理時(shí)，細(xì)菌的線(xiàn)性染色體DNA 變性,而共價(jià)閉合環(huán)狀DNA的兩條鏈不會(huì)相互分開(kāi)，當(dāng)外界條件恢復(fù)正常時(shí)，線(xiàn)狀染色體DNA 片段難以復(fù)性,而是與變性的蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片纏繞在一起,而質(zhì)粒DNA 雙鏈又恢復(fù)原狀,重新形成天然的超螺旋分子,并以溶解狀態(tài)存在于液相中。 在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),共價(jià)閉環(huán)質(zhì)粒以超

56、螺旋形式存在。在提取質(zhì)粒過(guò)程中，除了超螺旋DNA 外，還會(huì)產(chǎn)生其它形式的質(zhì)粒DNA。如果質(zhì)粒DNA 兩條鏈中有一條鏈發(fā)生一處或多處斷裂,分子就能旋轉(zhuǎn)而消除鏈的張力,形成松馳型的環(huán)狀分子,稱(chēng)開(kāi)環(huán)DNA；如果質(zhì)粒DNA 的兩條鏈在同一處斷裂,則形成線(xiàn)狀DNA。當(dāng)提取的質(zhì)粒DNA 電泳時(shí),同一質(zhì)粒DNA 其超螺旋形式的泳動(dòng)速度要比開(kāi)環(huán)和線(xiàn)狀分子的泳動(dòng)速度快。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?、?shí)驗(yàn)?zāi)康?1 了解質(zhì)粒各種提取方法了解質(zhì)粒各種提取方法2 2 通過(guò)堿法提取重組質(zhì)粒通過(guò)堿法提取重組質(zhì)粒儀器及耗材：三角瓶、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式離心機(jī)、微量移液器及吸頭、EP管、DNA振蕩器。材 料： 含有重組質(zhì)粒的培養(yǎng)細(xì)菌三、實(shí)驗(yàn)儀器

57、、材料和試劑三、實(shí)驗(yàn)儀器、材料和試劑 堿法提取質(zhì)粒需要的試劑： 溶液：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液配制后高壓滅菌15 分鐘,儲(chǔ)存于4冰箱。 溶液：0.2 mol/L NaOH， 1 SDS(臨用前用10 mol/L NaOH 和10 SDS現(xiàn)配)。 溶液：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高壓滅菌。試 劑（一）、 堿法1. 接種少許通過(guò)PCR鑒定含有重組質(zhì)粒DH5菌液到液體LB 培養(yǎng)基(含100 g/ml Amp)中, 37

58、 振蕩培養(yǎng)約12 小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期；。2、取菌液于1.5mlEP,4，12,000 rpm, 1min;3、棄上清,將管倒置于吸水紙上數(shù)分鐘,使液體流盡；4、每管菌體沉淀重懸浮于100l 溶液中(吸打混勻，務(wù)必充分)；5、每管加入新配制的溶液200l,輕柔上下顛倒EP管數(shù)次,以混勻內(nèi)容物(不要振蕩),冰浴5 分鐘。6、每管加入150l 預(yù)冷的溶液,輕柔上下顛倒EP管數(shù)次，可見(jiàn)白色絮狀沉淀出現(xiàn)，冰浴中5分鐘,4，12,000 rpm, 10 min;四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟7. 上清液（每管400l）移入干凈EP 管中,加0.8倍體積5M LiCl（每管320l）,混勻,-20, 20 min

59、;8. 4,12,000 rpm，5 min9. 將水相（約700l）移入干凈EP 管中,加入0.6 倍體積的異丙醇（420l）,振蕩混勻后，室溫放置5分鐘，然后4,12,000 rpm，5 min；10. 棄上清,將管口敞開(kāi)倒置于吸水紙上使所有液體流出,加入70乙醇洗沉淀一次, 4,12,000 rpm，5 min；11. 吸除上清液,將管倒置于吸水紙上使液體流盡, 室溫干燥。12. 將沉淀溶于20l ddH2O 中,加入1-2l RNaseA, 37水浴中溫育2-3 h.思考題 質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)中，溶液，溶液，溶液各起什么作用？一、實(shí)驗(yàn)原理一、實(shí)驗(yàn)原理 限制性?xún)?nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱(chēng)為限制

60、性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上,并切割雙鏈DNA。 限制性?xún)?nèi)切酶可分為三類(lèi): 類(lèi)和III酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴(lài)于ATP 的存在。類(lèi)酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的距離切割識(shí)別位點(diǎn)一定距離的DNA；III類(lèi)酶在特定的非識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA 分子,然后從底物上解離。類(lèi)由兩種酶組成: 一種為限制性?xún)?nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列; 另一種為獨(dú)立的甲基化酶,它修飾同一識(shí)別序列。 分子克隆中廣泛應(yīng)用的是：類(lèi)中的限制性?xún)?nèi)切酶。 絕大多數(shù)類(lèi)限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4 至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱(chēng)特異核苷酸序列(如EcoR識(shí)別六個(gè)核苷酸序列:5- GAATTC-3)