第二章生物制藥工藝技術基礎3ppt課件

1、二、動物細胞工程制藥技術根底二、動物細胞工程制藥技術根底一動物細胞的獲得一動物細胞的獲得 供消費生物技術藥物的動物細胞有供消費生物技術藥物的動物細胞有3類；類； 1、原代細胞、原代細胞 原代細胞是直接取自動物組織器官，經(jīng)過分散、原代細胞是直接取自動物組織器官，經(jīng)過分散、消化制得的細胞懸液。消化制得的細胞懸液。 2、二倍體細胞系、二倍體細胞系 原代細胞經(jīng)過傳代、挑選、克隆，從而由多種細原代細胞經(jīng)過傳代、挑選、克隆，從而由多種細胞成分的組織中挑選強化具有一定特性的細胞株。胞成分的組織中挑選強化具有一定特性的細胞株。 其特點是：其特點是： 染色體組織依然是染色體組織依然是2n的模型；的模型； 具有明

2、顯貼壁依賴和接觸抑制的特性：具有明顯貼壁依賴和接觸抑制的特性： 具有有限的增殖才干，普通可延續(xù)傳代培育具有有限的增殖才干，普通可延續(xù)傳代培育50代；代； 無致癌性。二倍體細胞通常由胚胎組織中獲取。無致癌性。二倍體細胞通常由胚胎組織中獲取。 3、轉(zhuǎn)化細胞系、轉(zhuǎn)化細胞系 這類細胞經(jīng)常因染色體的斷裂而變成異倍體，這類細胞經(jīng)常因染色體的斷裂而變成異倍體，從而失去了正常細胞的特點，而獲得無限繁衍的才從而失去了正常細胞的特點，而獲得無限繁衍的才干。這種轉(zhuǎn)化進程可以是自發(fā)的，也可以經(jīng)過人為干。這種轉(zhuǎn)化進程可以是自發(fā)的，也可以經(jīng)過人為的方法進展的轉(zhuǎn)化。的方法進展的轉(zhuǎn)化。 另外，從動物腫瘤組織中建立的細胞系也是

3、轉(zhuǎn)化細胞，轉(zhuǎn)化細胞具有無限生命力，倍增時間較短，培育條件要求較低，適于大規(guī)模消費培育 。二動物細胞培育條件 營養(yǎng)、pH及溫度是細胞生長所要求的重要條件，培育細胞的最適溫度為370.5，偏離此溫度，細胞的正常生長及代謝將會遭到影響。細胞培育的最適pH 7.27.4間。 細胞生長代謝離不開氣體，培育瓶中的O2與CO2 ，是以保證細胞體內(nèi)代謝活動的進展，但作為代謝產(chǎn)物CO2 在培育環(huán)境中還有調(diào)理pH的作用， CO2培育箱可以維持一定比例的CO2 ，使培育環(huán)境中的氫離子濃度堅持恒定。 在保證細胞浸透壓的情況下，培育液里的成分要滿足細胞進展代謝所需求的各種組成，如各種必需氨基酸和非必需氨基酸、維生素、碳

4、水化合物及無機鹽類等，只需滿足了這些根本條件，細胞才干在體外正常存活、生長。 另外，在單克隆抗體實驗培育中參與一些豢養(yǎng)細胞，或在換液時留一些原培育液，也有利于細胞生長。 各種合成培育基給細胞培育提供了方便，但單純采用合成培育基，細胞還不能很好地增殖，甚至細胞不貼壁生長，因此運用時常要添加510小牛血清，對雜交瘤細胞的培育添加胎牛血清要達l020， 其運用有幾方面：其運用有幾方面： 提供細胞生長所需的條件生長因子和激素。提供細胞生長所需的條件生長因子和激素。 提供細胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子；提供細胞貼壁所需的貼附因子和伸展因子； 提供識別金屬、激素、維生素和脂類的結(jié)合蛋提供識別金屬、激素、

5、維生素和脂類的結(jié)合蛋白；白； 提供細胞生長所需的脂肪酸和微量元素。提供細胞生長所需的脂肪酸和微量元素。 為順應大規(guī)模細胞培育，開展高技術生物制品，為順應大規(guī)模細胞培育，開展高技術生物制品，近代還大力研討無血清培育基。近代還大力研討無血清培育基。 無血清培育基具有以下優(yōu)點：無血清培育基具有以下優(yōu)點： 提高了細胞培育的可反復性，防止了由于血清提高了細胞培育的可反復性，防止了由于血清批之間差別的影響；批之間差別的影響； 減少了由血清帶來的病毒、真菌和支原體等微生物污染的危險； 供應充足、穩(wěn)定； 細胞產(chǎn)品易于純化； 防止了血清中某些要素對某些細胞的毒性； 減少了血清中蛋白對某些生物測定的干擾，便于實驗

6、結(jié)果的分析。 無血清培育基是以合成培育基為根底參與各種細胞生長所需的添加因子，有利于細胞生長的因子和微量元素等。三動物細胞大規(guī)模培育方法三動物細胞大規(guī)模培育方法 動物細胞培育的方法，普通可根據(jù)培育細胞的種動物細胞培育的方法，普通可根據(jù)培育細胞的種類分為原代細胞培育和傳代細胞培育；又可根據(jù)培育類分為原代細胞培育和傳代細胞培育；又可根據(jù)培育基的不同分為液體培育和固體培育；還可根據(jù)培育容基的不同分為液體培育和固體培育；還可根據(jù)培育容器和方式的不同分為靜止培育、旋轉(zhuǎn)培育、攪拌培育、器和方式的不同分為靜止培育、旋轉(zhuǎn)培育、攪拌培育、微載體培育、中空纖維培育、固定床或流化床培育等。微載體培育、中空纖維培育、

7、固定床或流化床培育等。 但從消費實踐看，動物細胞的大規(guī)模培育主要可但從消費實踐看，動物細胞的大規(guī)模培育主要可分為懸浮培育、貼壁培育和貼壁懸浮培育。分為懸浮培育、貼壁培育和貼壁懸浮培育。 1、懸浮培育、懸浮培育 顧名思義，所謂懸浮培育即讓細胞自在地懸浮于培顧名思義，所謂懸浮培育即讓細胞自在地懸浮于培育基內(nèi)生長增殖。它適用于一切種類的非貼壁依賴性育基內(nèi)生長增殖。它適用于一切種類的非貼壁依賴性細胞懸浮細胞，也適用于兼性貼壁細胞。細胞懸浮細胞，也適用于兼性貼壁細胞。 該培育方法的優(yōu)點是操作簡便，培育條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧較好，容易擴展培育規(guī)模，在培育設各的設計和實踐操作中可自創(chuàng)許多有關細菌發(fā)酵的閱歷

8、。 目前在消費中用于懸浮培育的設備主要是通氣攪拌罐式生物反響器和氣升式生物反響器。 2、貼壁培育 貼壁培育是必需讓細胞附在某種基質(zhì)上生長繁衍的培育方法：它適用于一切貼附依賴性細胞貼壁細胞，也適用于兼性貼壁細胞。 該方法優(yōu)點是適用的細胞種類廣由于消費中所運用的細胞絕大多數(shù)是貼壁細胞，較容易采用灌流培育的方式使細胞到達高密度；缺乏之處是操作比較費事。 需求適宜的貼附資料和足夠的面積，培育條件不易均一，傳質(zhì)和傳氧較差，這些缺乏經(jīng)常成為擴展培育的“瓶頸。 被普遍采用的貼壁培育方法是固定床式生物反響器，但由于該反響器中傳質(zhì)和傳氧常會出現(xiàn)梯度式不均一景象，故放大常遭到限制。 貼壁培育擴展培育時，經(jīng)常需求用

9、酶將其從基質(zhì)上消化下來。它們的作用主要是使細胞間質(zhì)和一些促進細胞貼附的蛋白因子水解，使細胞從基質(zhì)分別成單個細胞。 3、微載體培育 微載體培育是使細胞貼附在微小顆粒載體上，它發(fā)明了相當大的貼附面積，供細胞貼附生長、增殖。載體體積很小，比重較輕，在輕度攪拌下即可使細胞自在懸浮于培育基內(nèi)，充分發(fā)揚懸浮培育的優(yōu)點。 理想的微載體需具備如下一些條件： 微載體外表性質(zhì)與細胞有良好的相容性，適用細胞附著、伸展和增殖； 微載體的資料無毒性。不僅要求對細胞的生長無毒性，而且也不會產(chǎn)生影響產(chǎn)品和人體安康的有害因子； 微載體的資料是惰性的，不與培育基成分發(fā)生化學變化，也不會吸收培育基中的營養(yǎng)成分； 微載體的比重在1

10、.0301.045gml，使載體在低速攪拌下就可懸浮，而在靜止時又可很快沉降，便于換液和收獲； 粒徑在60250m溶脹后之間為好，并要盡能夠地均一，差別不大于20 m 。這樣有利于細胞均勻分布在各微載體外表； 具有良好的光學透明性，適用在倒置顯微鏡下察看細胞在載體上的生長情況； 基質(zhì)的性質(zhì)最好是軟性的，防止在攪拌中由于載體相互磨擦而損傷細胞； 可耐120高溫，便于采用高壓蒸汽滅菌； 經(jīng)簡單的適當處置后，可反復多次地運用； 原料充分，制造簡便，價廉。五動物細胞的種質(zhì)保管五動物細胞的種質(zhì)保管 動物細胞種質(zhì)保管的方式有組織塊、細胞懸浮物及動物細胞種質(zhì)保管的方式有組織塊、細胞懸浮物及細胞單層培育物等。

11、保管方式有常溫、低溫及超低溫細胞單層培育物等。保管方式有常溫、低溫及超低溫冰凍法冰凍法3種。種。 目前超低溫冰凍法是保管種質(zhì)細胞最有效和最重要目前超低溫冰凍法是保管種質(zhì)細胞最有效和最重要的方法。的方法。 常溫法是將特定種質(zhì)方式保管于常溫法是將特定種質(zhì)方式保管于2030的方法，的方法，如人腎及猴腎細胞單層于如人腎及猴腎細胞單層于2530可保管可保管1個月以上，個月以上，人二倍體細胞單層可保管兩周，中間換液可保管人二倍體細胞單層可保管兩周，中間換液可保管30d以以上，假設生長液中小牛血清減至上，假設生長液中小牛血清減至0.5l，于，于37培培育并有規(guī)律地改換培育基，那么可長期保管。育并有規(guī)律地改換

12、培育基，那么可長期保管。 低溫法是將特定種質(zhì)方式保管于4的方法，如原代猴腎細胞懸浮于4生長液中，可保管3周。 超低溫冰凍法系將種質(zhì)細胞保管于70以下冰箱或液氮中的保管方法。在此條件下，種質(zhì)可長期保管。但是本法需用維護劑，常用的維護劑有二甲亞砜DMSO及甘油等。 甘油運用濃度為520，DMSO運用濃度為512.5。DMSO因起作用更快，毒性及黏度更低，膜透性更高，抗凍傷才干更強而運用最多，細胞在DMSO中30s左右即到達內(nèi)外平衡，但在甘油中2h才干平衡。 在深凍過程中，先配制含8l0DMSO、1520小牛血清及適量NaHCO3的維護液，再將細胞培育物消化與分散，離心搜集細胞，按5106個細胞ml

13、濃度添加維護液，按lml支分裝于安瓿中，04放置24 h，移至70冰箱中或置于液氮中保管。保凍細胞在繼代培育前需復蘇，復蘇時將安瓿取出，包裹4層紗布浸入40水中，除去紗布后再浸入水中融化40s，混勻后立刻接種l2100ml培育瓶，并按12ml4ml8ml緩慢而依次參與生長液，最終加至20ml。 假設維護液含DMSO可直接用于接種，但其濃度應降至l以下。假設維護液含甘油，那么應離心除去甘油，以防影響細胞增殖，加生長液后可經(jīng)過臺酚藍染色法計算活細胞數(shù)，然后用于培育。六單克隆抗體技術六單克隆抗體技術 l、單克隆抗體的制備原理、單克隆抗體的制備原理 B細胞群受抗原刺激后能產(chǎn)生針對抗原決議簇的特細胞群受

14、抗原刺激后能產(chǎn)生針對抗原決議簇的特異性抗體，一個機體可產(chǎn)生多達異性抗體，一個機體可產(chǎn)生多達100萬種特異性不同萬種特異性不同的抗體。的抗體。 但一個但一個B細胞卻只能分泌一種特異性抗體。每個雜細胞卻只能分泌一種特異性抗體。每個雜交瘤細胞只分泌一種特異性抗體，培育單個雜交瘤細交瘤細胞只分泌一種特異性抗體，培育單個雜交瘤細胞，使之無性繁衍構(gòu)成細胞集落稱之為克隆。同胞，使之無性繁衍構(gòu)成細胞集落稱之為克隆。同一個克隆的雜交瘤細胞基因一樣，合成并分泌的特異一個克隆的雜交瘤細胞基因一樣，合成并分泌的特異性抗體質(zhì)地均一。這種抗體稱之為單克隆抗體。性抗體質(zhì)地均一。這種抗體稱之為單克隆抗體。 淋巴細胞雜交瘤技術

15、是將在體外不能長期生存的免疫淋巴細胞與在體外能迅速增殖的骨髓瘤細胞在聚乙二醇PEG作用下交融而產(chǎn)生雜交瘤細胞。 所得的雜交瘤細胞承襲了兩組親代細胞的遺傳性，既保管了骨髓瘤細胞在體外迅速增殖傳代的才干，又承繼了免疫淋巴細胞合成與分泌抗體和淋巴因子的才干。 T淋巴細胞主司細胞免疫，分泌淋巴因子。知有40多種淋巴因子。T細胞與骨髓瘤細胞交融可產(chǎn)生能分泌淋巴因子的T細胞雜交瘤細胞。 B細胞主司體液免疫，能分泌特異性免疫球蛋白抗體，B細胞與骨髓瘤細胞交融那么產(chǎn)生能分泌特異性抗體的B細胞雜交瘤細胞。 單克隆抗體有特異性強、免疫滴度高、質(zhì)地均一、反響靈敏、可規(guī)范化等特點，還可進展工業(yè)化大消費。 單克隆抗體可

16、用于疾病診斷、體內(nèi)顯像定位檢查、體內(nèi)治療或靶向治療、食品與環(huán)境監(jiān)測以及天然蛋白與基因工程產(chǎn)品的提純等。世界各國已制備萬種單克隆抗體?，F(xiàn)已有百余種診斷試劑和數(shù)種治療劑投放市場。2、單克隆抗體的工業(yè)化消費、單克隆抗體的工業(yè)化消費 單克隆抗體的消費包括細胞培育、提純和制劑等單克隆抗體的消費包括細胞培育、提純和制劑等工藝過程。工藝過程。1雜交瘤細胞的大規(guī)模培育雜交瘤細胞的大規(guī)模培育 單克隆抗體問世后，已研討了多種適宜于大規(guī)模單克隆抗體問世后，已研討了多種適宜于大規(guī)模培育雜交瘤細胞的生物反響器細胞培育罐及其培育雜交瘤細胞的生物反響器細胞培育罐及其培育基。目前比較成熟的發(fā)酵罐有氣升式或深層發(fā)培育基。目前比

17、較成熟的發(fā)酵罐有氣升式或深層發(fā)酵罐，中空纖維培育罐，微囊或滴珠發(fā)酵罐。酵罐，中空纖維培育罐，微囊或滴珠發(fā)酵罐。 牛淋巴液大規(guī)模培育技術牛淋巴液大規(guī)模培育技術mass culturing technique，MCT也是較成熟的適宜于雜交瘤細胞也是較成熟的適宜于雜交瘤細胞大規(guī)模培育的方法。大規(guī)模培育的方法。 用牛淋巴液體外循環(huán)法消費單克隆抗體的步驟： 在無菌條件下，自牛頸部引出牛胸導管、淋巴管至無菌室； 使淋巴細胞與淋巴液分開； 將濾出的細胞與部分淋巴液送回牛靜脈管內(nèi)，無細胞淋巴液經(jīng)超濾后進入培育罐進展循環(huán)，并按比例參與培育液培育液應經(jīng)過一層微孔半透膜過濾后再進入培育罐。 雜交瘤細胞培育產(chǎn)生的單克

18、隆抗體培育液的20經(jīng)過另一端的半透膜流出培育罐，每日收獲單克隆抗體，其他80再循環(huán)。2單抗的分別純化單抗的分別純化 無論用動物腹水，還是用發(fā)酵罐消費單克隆抗體，無論用動物腹水，還是用發(fā)酵罐消費單克隆抗體，產(chǎn)品的分別純化均非常重要。目前常用的方法有超產(chǎn)品的分別純化均非常重要。目前常用的方法有超濾法、鹽析法，離子交換層析法、等電聚焦層析法、濾法、鹽析法，離子交換層析法、等電聚焦層析法、葡萄球菌蛋白葡萄球菌蛋白A層析法、層析法、HPLC、DEAF C層析法、層析法、葡聚糖或瓊脂糖法等。葡聚糖或瓊脂糖法等。3單克隆抗體的制劑技術單克隆抗體的制劑技術 即將純化的單克隆抗體制備成診斷試劑或新藥。即將純化的

19、單克隆抗體制備成診斷試劑或新藥。常用于制備單克隆抗體制劑的物質(zhì)有高聚物、脂質(zhì)常用于制備單克隆抗體制劑的物質(zhì)有高聚物、脂質(zhì)體、聚乙二醇、細胞膜等。導向高聚物是外表包裹體、聚乙二醇、細胞膜等。導向高聚物是外表包裹著特異單克隆抗體的高聚物小珠，可用于移植，癌著特異單克隆抗體的高聚物小珠，可用于移植，癌癥治療和體內(nèi)定位診斷。癥治療和體內(nèi)定位診斷。三、植物細胞工程制藥技術根底三、植物細胞工程制藥技術根底一植物組織和細胞培育的根本概念一植物組織和細胞培育的根本概念 1、植物組織細胞無菌培育技術類型、植物組織細胞無菌培育技術類型 植物組織和細胞是指在無菌和人工控制的營養(yǎng)植物組織和細胞是指在無菌和人工控制的營

20、養(yǎng)培育基及環(huán)境條件光照、溫度等下，研討培育基及環(huán)境條件光照、溫度等下，研討植物的細胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技植物的細胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術。術。 植物無菌培育技術有以下幾類：植物無菌培育技術有以下幾類： 幼苗及較大植株的培育，即為幼苗及較大植株的培育，即為“植物培育植物培育plant culture； 從植物各種器官的外植體增殖而構(gòu)成的愈傷組從植物各種器官的外植體增殖而構(gòu)成的愈傷組織的培育叫做織的培育叫做“愈傷組織培育愈傷組織培育 ； 可以堅持較好分散性的離體細胞或較小細胞團的液體培育，稱為“懸浮培育 ； 離體器官的培育，如莖尖、根尖、葉片、花器官各部分原基或未成熟的

21、花器官各部分以及未成熟果實的培育，稱為“器官培育 ； 未成熟或成熟的胚胎的離體培育，那么為“胚胎培育。 2、懸浮培育 懸浮培育是指在液體培育基中，可以堅持良好分散性的細胞和小的細胞聚集體的培育。在此培育條件下組織程度較低。 3、細胞培育、細胞培育 細胞培育是指利用單個細胞進展液體或固體培育，細胞培育是指利用單個細胞進展液體或固體培育，誘導其增殖及分化。其目的是為了得到單細胞無性誘導其增殖及分化。其目的是為了得到單細胞無性繁衍系。繁衍系。 4、分生組織培育、分生組織培育 分生組織培育又稱生長錐培育，是指在人工培育分生組織培育又稱生長錐培育，是指在人工培育基上培育莖端分生組織細胞。分生組織如莖尖分

22、生基上培育莖端分生組織細胞。分生組織如莖尖分生組織的部位僅限于頂端圓錐區(qū)，其長度不超越組織的部位僅限于頂端圓錐區(qū)，其長度不超越1mm。 研討闡明，經(jīng)過組織培育技術進展植物的快速繁研討闡明，經(jīng)過組織培育技術進展植物的快速繁衍實驗往往并沒有利用這么小的外植體，而是利用衍實驗往往并沒有利用這么小的外植體，而是利用較大的莖尖組織，通常包括較大的莖尖組織，通常包括l2個原基。個原基。5、外植體組織培育、外植體組織培育 外植體是指用于植物組織細胞培育的器官或外植體是指用于植物組織細胞培育的器官或組織的切段，植物的各部位如根、莖、葉、花、組織的切段，植物的各部位如根、莖、葉、花、果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花

23、粉等均可作為外植體果、穗、胚珠、胚乳、花藥和花粉等均可作為外植體進展組織培育。進展組織培育。6、器官構(gòu)成培育、器官構(gòu)成培育 器官構(gòu)成普通是指在組織培育或懸浮培育中芽、根器官構(gòu)成普通是指在組織培育或懸浮培育中芽、根或花等器官的分化與構(gòu)成?；蛘咴谙葮?gòu)成的小根基部或花等器官的分化與構(gòu)成。或者在先構(gòu)成的小根基部迅速構(gòu)成愈傷組織，然后再構(gòu)成芽；或者在不同部位迅速構(gòu)成愈傷組織，然后再構(gòu)成芽；或者在不同部位分別構(gòu)成芽和根之后，再構(gòu)成維管組織而將二者連成分別構(gòu)成芽和根之后，再構(gòu)成維管組織而將二者連成一個軸，最后構(gòu)成小植株。一個軸，最后構(gòu)成小植株。 假設在培育過程中小植株的發(fā)生途徑與正常的受精卵發(fā)育方式極為近似

24、時，通常稱為“胚胎構(gòu)成 。 當在體細胞或花藥培育中培育物是小孢子這樣的單倍體細胞，其所構(gòu)成的胚胎構(gòu)造叫做“胚狀體 或“不定胚 。二植物組織和細胞培育所用的培育基 培育基實踐上是植物離體器官、組織或細胞等的“無菌土壤，其特點是營養(yǎng)成分力可調(diào)控性。 植物組織和細胞培育所用培育基種類較多。但通常都含有無機鹽、碳源、有機氮源、植物生長激素、維生素等化學成分。運用最廣的是MS培育基和LS培育基。 MS培育基含兩類成分： 無機元素，如N、P、K、Ca、Fe、Mg、 Cu、Mn、Zn、B、Ho、I等； 有機元素，如維生素B1、B6 、煙酸、肌醇、氨基酸、蔗糖等， 在培育基中，一些必需元素，如N、P、K、Ca

25、、Mg等的參與與否及其濃度的高低與組分的相對濃度對培育基結(jié)果都有艱苦影響。 在植物組織培育過程中激素的作用非常重要，假設沒有激素存在，細胞就不能快速分裂甚至不分裂。 組織培育的優(yōu)勢就在于讓植物細胞快速分裂，在短期內(nèi)產(chǎn)生大量細胞，從而實現(xiàn)快速繁衍的目的。其次激素對于組織的器官和胚狀體構(gòu)成起著重要而明顯的調(diào)理作用。其中影響最顯著的是生長素和細胞分裂素。有時也運用赤霉素GA、零落酸ABA、乙烯以及其他人工合成的生長調(diào)理物質(zhì)。 其中生長素包括：吲哚乙酸IAA、萘乙酸NAA、2，4二氯乙氧苯酸2，4 D、吲哚丁酸IBA。 細胞分裂素包括：激動素KT、6芐基腺嘌呤6BA、玉米素ZT等。 普通以為構(gòu)成的器官

26、的類型受培育基中這兩種激素的相對濃度的控制，較高濃度的生長素有利于根的構(gòu)成而抑制芽的構(gòu)成；相反，較高濃度的細胞分裂素那么促進芽的構(gòu)成而抑制根的構(gòu)成。三培育資料與培育方式 植物的根、莖、葉、花、果實、種子、髓等組織或器官都可用來誘導愈傷組織。 在實踐任務中往往是在生長活潑的部位取材，進展愈傷組織的培育，此時可以進展各種培育基的選擇，經(jīng)過一段時間的培育，可以選擇出適當?shù)呐嘤鳛橐院笈嘤母九嘤５扔鷤M織長大后，轉(zhuǎn)移到液體培育基中進展振蕩，分別細胞。 普通愈傷組織不會很好地分散成理想的單細胞懸浮液，大多為50200個細胞組成的細胞團。 上述培育出來的細胞懸浮液是異源的，為了進一步得到均一的無

27、性細胞，可以在這種懸浮培育基的根底上，當細胞分散程度和迅速生長到達一定階段后，利用平板培育技術進展細胞無性系分別。 即細胞懸浮液通常經(jīng)過雙層不銹鋼網(wǎng)或尼龍網(wǎng)除去細胞聚集體，將濾過的細胞液與選定的瓊脂培育基在35左右下混合，澆到培育皿上使其構(gòu)成一薄層，當瓊脂冷卻凝固后，細胞就比較均勻地分布并固定在瓊脂培育基中。此方法也稱單細胞培育。在做平板培育基時一個關鍵的問題是細胞密度應以103/ml為宜。 小規(guī)模培育可選擇大小適當?shù)娜瞧?02000ml，里面有選定的培育基，把挑選好的細胞株接入以后，旋轉(zhuǎn)培育50l50rmin，4周后可進展繼代培育。假設采用固體培育，在培育基中參與0709瓊脂。 大規(guī)模培育

28、方式主要是液體懸浮培育法，培育容器用槳式攪拌罐、空氣氣升式反響器。 為了保證細胞系的消費穩(wěn)定，已研討了多種適宜的培育方式，簡介如下： 1二步法 從許多植物細胞培育與次消費物的構(gòu)成來看，生物合成作用往往在細胞生長的后期，據(jù)此提出二步培育法。第一步培育基稱為生長培育基，主要適宜于細胞的生長；第二步稱為合成培育基，用于次消費物的合成。 兩種培育基往往有所區(qū)別，后者通常具有較低含量的硝酸鹽或磷酸鹽，或兩者含量均較低。此外，通常也含有較低的糖分或少量可利用的碳源。 2固定化培育固定化培育 將懸浮培育的植物細胞包埋于固體將懸浮培育的植物細胞包埋于固體基質(zhì)中，成為一個固定的生物反響系統(tǒng)。包埋的基質(zhì)基質(zhì)中，成

29、為一個固定的生物反響系統(tǒng)。包埋的基質(zhì)可為多糖和多聚化合物，如褐藻酸鹽、瓊脂糖、可為多糖和多聚化合物，如褐藻酸鹽、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、角叉菜膠。聚丙烯酰胺、角叉菜膠。 由于這些支持物膠體本身的交聯(lián)方式，使之對養(yǎng)由于這些支持物膠體本身的交聯(lián)方式，使之對養(yǎng)料、水分及氣體有一定的通透性，在不同程度上維持料、水分及氣體有一定的通透性，在不同程度上維持細胞的生物活力，從而保證進展生化反響的酶系和輔細胞的生物活力，從而保證進展生化反響的酶系和輔助因子的存在。助因子的存在。 基于此原理，在細胞產(chǎn)生次消費物的時期，就將基于此原理，在細胞產(chǎn)生次消費物的時期，就將其固定化，加以營養(yǎng)介質(zhì)及底物進展反響，將其制成其固定

30、化，加以營養(yǎng)介質(zhì)及底物進展反響，將其制成顆粒狀，注入柱式反響器，就可以進展延續(xù)循環(huán)反響。顆粒狀，注入柱式反響器，就可以進展延續(xù)循環(huán)反響。經(jīng)過固定化細胞進展延續(xù)培育是實現(xiàn)商業(yè)化消費的有經(jīng)過固定化細胞進展延續(xù)培育是實現(xiàn)商業(yè)化消費的有效途徑。效途徑。3代謝產(chǎn)物胞外釋放代謝產(chǎn)物胞外釋放 由于大部分有用的次生代謝由于大部分有用的次生代謝物并不釋放到培育基中，而是儲存于液泡中，傳統(tǒng)的物并不釋放到培育基中，而是儲存于液泡中，傳統(tǒng)的提取藥用次生代謝物的方法始于破碎細胞，使細胞只提取藥用次生代謝物的方法始于破碎細胞，使細胞只能一次性的運用。處理儲存液泡中的次生代謝物使之能一次性的運用。處理儲存液泡中的次生代謝物

31、使之釋放到胞外，也是經(jīng)過固定化細胞進展延續(xù)培育要處釋放到胞外，也是經(jīng)過固定化細胞進展延續(xù)培育要處理的一個主要問題。理的一個主要問題。 已開展出了化學試劑法、改動離子強度法、已開展出了化學試劑法、改動離子強度法、pH擾動擾動法、電擊法等。法、電擊法等。4兩相培育技術兩相培育技術 即在培育基中引入第二相，細胞即在培育基中引入第二相，細胞產(chǎn)物在原培育系統(tǒng)合成后，向第二相富集，從而減少產(chǎn)物在原培育系統(tǒng)合成后，向第二相富集，從而減少了產(chǎn)物的反響抑制，不僅提高了產(chǎn)量，而且簡化了后了產(chǎn)物的反響抑制，不僅提高了產(chǎn)量，而且簡化了后處置。處置。四植物細胞大規(guī)模培育的生物反響器特點四植物細胞大規(guī)模培育的生物反響器特

32、點 反響器的選擇取決于消費細胞的密度、通氣量以反響器的選擇取決于消費細胞的密度、通氣量以及營養(yǎng)成分的分散程度。常用的反響器及營養(yǎng)成分的分散程度。常用的反響器 3種類型。種類型。 1、搖瓶、搖瓶 氣體和營養(yǎng)成分的均勻分布經(jīng)過振蕩而實現(xiàn)攪拌氣體和營養(yǎng)成分的均勻分布經(jīng)過振蕩而實現(xiàn)攪拌目的。目的。 2、攪拌型生物反響器、攪拌型生物反響器 經(jīng)過不同類型攪拌器的靈敏運用有利于植物培育經(jīng)過不同類型攪拌器的靈敏運用有利于植物培育的高度混合，反響器內(nèi)的溫度、溶氧以及營養(yǎng)物濃度的高度混合，反響器內(nèi)的溫度、溶氧以及營養(yǎng)物濃度易控制，實驗結(jié)果顯示漿型攪拌器適用于植物細胞培易控制，實驗結(jié)果顯示漿型攪拌器適用于植物細胞培

33、育。育。 3 鼓泡塔生物反響器與氣升式生物反響器鼓泡塔生物反響器與氣升式生物反響器 這類反響器經(jīng)過外部循環(huán)泵或緊縮空氣作為動力，這類反響器經(jīng)過外部循環(huán)泵或緊縮空氣作為動力，使反響器內(nèi)的培育物上下混合。使反響器內(nèi)的培育物上下混合。 1鼓泡塔生物反響器鼓泡塔生物反響器 鼓泡塔生物反響器是經(jīng)過反鼓泡塔生物反響器是經(jīng)過反響器底部的噴嘴及多孔板而實氣體分散。響器底部的噴嘴及多孔板而實氣體分散。 鼓泡塔生物反響器主要優(yōu)點是：沒有運動部件，鼓泡塔生物反響器主要優(yōu)點是：沒有運動部件，操作不易染菌，在無機械能輸入情況下，提供了較高操作不易染菌，在無機械能輸入情況下，提供了較高的熱量和質(zhì)量傳送；適用于對剪切敏感性

34、細胞的培育，的熱量和質(zhì)量傳送；適用于對剪切敏感性細胞的培育，放大相對容易。缺陷是混合不勻，缺乏有關反響器內(nèi)放大相對容易。缺陷是混合不勻，缺乏有關反響器內(nèi)的非牛頓流體的流動與傳送特性的數(shù)據(jù)等。的非牛頓流體的流動與傳送特性的數(shù)據(jù)等。 2氣升式生物反響器氣升式生物反響器 氣升式生物反響器有內(nèi)循環(huán)氣升式生物反響器有內(nèi)循環(huán)式和外循環(huán)式兩種類型。其培育物流動性比鼓泡塔式和外循環(huán)式兩種類型。其培育物流動性比鼓泡塔更為均勻。氣升式生物反響器是植物細胞培育最適更為均勻。氣升式生物反響器是植物細胞培育最適宜的反響器之一，可以在低剪切下到達較好的混合宜的反響器之一，可以在低剪切下到達較好的混合和較高的氧傳送效果。而

35、且不易污染，操作費用也和較高的氧傳送效果。而且不易污染，操作費用也較低。較低。4、轉(zhuǎn)鼓式生物反響器、轉(zhuǎn)鼓式生物反響器 轉(zhuǎn)鼓式生物反響器是經(jīng)過轉(zhuǎn)動促進反響器內(nèi)的氧轉(zhuǎn)鼓式生物反響器是經(jīng)過轉(zhuǎn)動促進反響器內(nèi)的氧及營養(yǎng)物的混合，設置擋板有助于提高氧的傳送，及營養(yǎng)物的混合，設置擋板有助于提高氧的傳送，在高密度培育時有高的傳氧才干，在高密度培育時，在高密度培育時有高的傳氧才干，在高密度培育時，轉(zhuǎn)鼓式優(yōu)于攪拌式。其缺陷是難于大規(guī)模放大。轉(zhuǎn)鼓式優(yōu)于攪拌式。其缺陷是難于大規(guī)模放大。四、酶工程制藥技術根底四、酶工程制藥技術根底一酶工程技術一酶工程技術 酶工程酶工程 是酶學與工程學相互浸透結(jié)合，開展構(gòu)成是酶學與工程學

36、相互浸透結(jié)合，開展構(gòu)成的生物技術，它研討酶和運用酶的特異催化功能，并的生物技術，它研討酶和運用酶的特異催化功能，并經(jīng)過工程化過程將相應原料轉(zhuǎn)化成所需產(chǎn)物的技術。經(jīng)過工程化過程將相應原料轉(zhuǎn)化成所需產(chǎn)物的技術。 除了第一代酶酶制劑和第二代酶一固定化酶的除了第一代酶酶制劑和第二代酶一固定化酶的廣泛運用外，第三代酶，即包括輔助因子再生系統(tǒng)在廣泛運用外，第三代酶，即包括輔助因子再生系統(tǒng)在內(nèi)的多酶反響器也已獲得迅速開展。內(nèi)的多酶反響器也已獲得迅速開展。 酶工程的主要內(nèi)容包括酶的消費、分別、純化、酶工程的主要內(nèi)容包括酶的消費、分別、純化、酶的固定化、酶與固定化酶的反響器以及酶與固定化酶的固定化、酶與固定化酶

37、的反響器以及酶與固定化酶的運用等。酶的運用等。 隨著生物技術與生物制造業(yè)的深化開展，當前酶工程技術的主要研討方向是： 酶的分別、純化和工業(yè)化消費以及新酶的發(fā)現(xiàn)與運用； 酶和細胞的固定化技術與酶反響器包括酶傳感器的研討； 基因工程與蛋白質(zhì)工程技術在酶的分子設計與酶消費中的運用； 有機相中酶促反響的研討與運用； 酶的抑制劑，激活劑的開發(fā)與運用研討； 抗體酶與核酶的研討與運用；抗體酶與核酶的研討與運用； 模擬酶、合成酶及酶分子的人工設計、合成研模擬酶、合成酶及酶分子的人工設計、合成研討。討。二固定化酶的概念和優(yōu)點二固定化酶的概念和優(yōu)點 固定化酶固定化酶 是指借助于物理和化學的方法把酶束是指借助于物理

38、和化學的方法把酶束縛在一定空間內(nèi)并具有催化活性的酶制劑，是近代縛在一定空間內(nèi)并具有催化活性的酶制劑，是近代酶工程技術的主要研討領域。廣義的固定化酶又包酶工程技術的主要研討領域。廣義的固定化酶又包括固定化酶和固定化細胞兩類。括固定化酶和固定化細胞兩類。三固定化酶的制備方法三固定化酶的制備方法 酶的固定化方法有下述酶的固定化方法有下述4種：種：吸附法；吸附法；包埋包埋法；法；交聯(lián)法；交聯(lián)法；共價鍵結(jié)合法。共價鍵結(jié)合法。 1、吸附法、吸附法 吸附法分為物理吸附法和離子吸附法。用物理吸吸附法分為物理吸附法和離子吸附法。用物理吸附法制成固定化酶，酶活力損失很少。但附著在載附法制成固定化酶，酶活力損失很少

39、。但附著在載體上的酶，易于零落，適用價值少。體上的酶，易于零落，適用價值少。 離子吸附法是將酶與含有離子交換劑的非水溶性載體相結(jié)合，酶吸附于載體上較為結(jié)實，在工業(yè)上用途頗廣。離子吸附法常用的載體有： 陰離子交換劑；陽離子交換劑 用于物理吸附法的載體有高嶺土 磷酸鈣凝膠、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠 羥基磷灰石、纖維素、膠原、淀粉等。 2、包埋法 包埋法又分為凝膠包埋法及微囊化包埋法兩類。 凝膠包埋法是將酶或細胞限制于高聚物網(wǎng)格中；微囊化法是將酶或細胞定位于不同構(gòu)型膜外殼內(nèi)。六固定化酶生物反響器的主要類型六固定化酶生物反響器的主要類型 反響器的方式很多，根據(jù)進料和出料的方式，可反響器的方式很多，根據(jù)進

40、料和出料的方式，可概括分為間歇式和延續(xù)式兩大類，后者又有兩種根本概括分為間歇式和延續(xù)式兩大類，后者又有兩種根本方式：延續(xù)流動攪拌罐式反響器和填充床反響器；方式：延續(xù)流動攪拌罐式反響器和填充床反響器； 還有一些衍生方式：延續(xù)流動攪拌罐超濾膜反還有一些衍生方式：延續(xù)流動攪拌罐超濾膜反響器、循環(huán)反響器和流化床反響器等。響器、循環(huán)反響器和流化床反響器等。第四節(jié)第四節(jié) 生物制藥中試放大工藝設計生物制藥中試放大工藝設計 一、生物制藥中試放大工藝特點一、生物制藥中試放大工藝特點一中試放大實驗的目的一中試放大實驗的目的 當實驗室研討任務進展到一定階段，就應思索中當實驗室研討任務進展到一定階段，就應思索中試放大

41、，以驗證明驗室工藝道路的可行性以及在實驗試放大，以驗證明驗室工藝道路的可行性以及在實驗室階段難以處理或尚未發(fā)現(xiàn)的問題。室階段難以處理或尚未發(fā)現(xiàn)的問題。 經(jīng)過中試研討要到達三個根本要求：經(jīng)過中試研討要到達三個根本要求： 建立穩(wěn)定的制造規(guī)程為正式消費提供多種必要的建立穩(wěn)定的制造規(guī)程為正式消費提供多種必要的工藝條件與參數(shù)；工藝條件與參數(shù)； 為臨床前研討與臨床實驗的評價提供足量的合格為臨床前研討與臨床實驗的評價提供足量的合格產(chǎn)品；產(chǎn)品； 擬定符合GMP要求的制造規(guī)程與檢定規(guī)程，保證有足量的合格受試藥物衡定供應臨床實驗，而且用于臨床前實驗和臨床實驗的受試藥物該當具有完全一樣的質(zhì)量。 還要確定采用與臨床實

42、驗所用藥品的一樣制造工藝，以保證在日后消費中的產(chǎn)品與供臨床實驗所用藥品的質(zhì)量一樣。 由于消費工藝的任何變卦都能夠潛在性地改動最新產(chǎn)品的特性包含有效成分和雜質(zhì)的變化。二進入中試應具備的條件二進入中試應具備的條件 實驗進展到什么階段才干進入中試？尚難制定一實驗進展到什么階段才干進入中試？尚難制定一個規(guī)范。但除了人為要素外，至少以下一些內(nèi)容在進個規(guī)范。但除了人為要素外，至少以下一些內(nèi)容在進入中試前應該根本具備。入中試前應該根本具備。 收率穩(wěn)定，質(zhì)量可靠；收率穩(wěn)定，質(zhì)量可靠； 操作條件曾經(jīng)確定；產(chǎn)品，中間體及原料的分操作條件曾經(jīng)確定；產(chǎn)品，中間體及原料的分析方法曾經(jīng)指定；析方法曾經(jīng)指定； 生物資料的資

43、源包括菌種、細胞株等已確生物資料的資源包括菌種、細胞株等已確定并已系統(tǒng)鑒定；定并已系統(tǒng)鑒定； 進展過物料平衡，進展過物料平衡，“三廢問題己有初步的處三廢問題己有初步的處置方法；置方法； 提出中試規(guī)模及所需原輔料的規(guī)格和數(shù)量； 提出平安消費的要求。 根據(jù)上述要求，在調(diào)查工藝條件的研討階段中，必需留意和處理以下問題。 1、原輔資料規(guī)格的過渡實驗、原輔資料規(guī)格的過渡實驗 在小試后，普通采用的原輔資料如原料、試劑、在小試后，普通采用的原輔資料如原料、試劑、溶劑、純化載體等規(guī)格較高，目的是為了排除原料溶劑、純化載體等規(guī)格較高，目的是為了排除原料中所含雜質(zhì)的不良影響，從而保證明驗結(jié)果的準確性。中所含雜質(zhì)的

44、不良影響，從而保證明驗結(jié)果的準確性。但是當工藝各線確定之后，在進一步調(diào)查工藝條件時，但是當工藝各線確定之后，在進一步調(diào)查工藝條件時，應盡量改用大規(guī)模消費時容易得到的原輔資料。應盡量改用大規(guī)模消費時容易得到的原輔資料。 為此，應調(diào)查某些工業(yè)規(guī)格的原輔資料所含雜質(zhì)為此，應調(diào)查某些工業(yè)規(guī)格的原輔資料所含雜質(zhì)對反響收率和產(chǎn)質(zhì)量量的影響，制定原輔資料質(zhì)量規(guī)對反響收率和產(chǎn)質(zhì)量量的影響，制定原輔資料質(zhì)量規(guī)范，規(guī)定各種雜質(zhì)的允許限制。范，規(guī)定各種雜質(zhì)的允許限制。2、設備選型與資料質(zhì)量實驗、設備選型與資料質(zhì)量實驗 在小試階段，大部分實驗是在小型玻璃儀器中進在小試階段，大部分實驗是在小型玻璃儀器中進展，但在工業(yè)消

45、費中，物料要接觸到各種設備資料，展，但在工業(yè)消費中，物料要接觸到各種設備資料， 有時某種材質(zhì)對某一反響有極大影響，甚至使整有時某種材質(zhì)對某一反響有極大影響，甚至使整個反響無法進展。故在中試時，要對設備資料的質(zhì)量個反響無法進展。故在中試時，要對設備資料的質(zhì)量及設備的選型進展實驗，為工業(yè)化消費提供數(shù)據(jù)。及設備的選型進展實驗，為工業(yè)化消費提供數(shù)據(jù)。3、反響條件限制實驗、反響條件限制實驗 反響條件限制實驗可以找到最適宜的工藝條件反響條件限制實驗可以找到最適宜的工藝條件如培育基種類、反響溫度、壓力、如培育基種類、反響溫度、壓力、pH等，普通均等，普通均有一個答應范圍。有些反響對工藝條件要求很嚴，超有一個

46、答應范圍。有些反響對工藝條件要求很嚴，超越一定限制后，就會呵斥艱苦損失。在這種情況下，越一定限制后，就會呵斥艱苦損失。在這種情況下，應進展工藝條件的限制實驗，以全面掌握反響規(guī)律。應進展工藝條件的限制實驗，以全面掌握反響規(guī)律。4、原輔資料，中間體及產(chǎn)質(zhì)量量分析方法研討、原輔資料，中間體及產(chǎn)質(zhì)量量分析方法研討 在生物制藥工藝研討中，有許多原輔資料，尤其在生物制藥工藝研討中，有許多原輔資料，尤其是中間體和新產(chǎn)品均無現(xiàn)成分析方法，因此，必需研是中間體和新產(chǎn)品均無現(xiàn)成分析方法，因此，必需研討它們的鑒定方法，以便制定簡便易行，準確可靠的討它們的鑒定方法，以便制定簡便易行，準確可靠的檢驗方法。檢驗方法。5、下游工藝的研討、下游工藝的研討 在生物制藥工藝中，上游工藝固然非常重要，如在生物制藥工藝中，上游