sanger測(cè)序培訓(xùn)PPT最終

1、上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司Shanghai Genechem Co., Ltd.上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司Shanghai Genechem Co., Ltd.sanger測(cè)序-基因檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)曹尚志曹尚志sanger測(cè)序原理Sanger測(cè)序的基本流程測(cè)序結(jié)果的分析 雙脫氧末端終止法 引物設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)流程 上機(jī)測(cè)序 怎樣分析結(jié)果 問(wèn)題峰圖分析ddNTP被加到正在合成的鏈上，由于它的3-OH已被氧化，下一個(gè)dNTP的5-磷酸基團(tuán)不能與之形成磷酸二酯鍵，使合成終止。在引物等延伸反應(yīng)過(guò)程中，ddNTP在不同位置摻入，產(chǎn)生了一系列不同長(zhǎng)度的新的DNA片段。5353一、Sanger測(cè)序原理雙脫氧末端終

2、止法一、Sanger測(cè)序原理雙脫氧末端終止法二、Sanger測(cè)序的實(shí)驗(yàn)基本流程（以MTHFR(RS1801133)檢測(cè)為例）1.根據(jù)rs號(hào)得到位點(diǎn)信息及目標(biāo)序列2.引物設(shè)計(jì)3.測(cè)序PCR模板的制備4. 測(cè)序樣品的制備5.上機(jī)測(cè)序 1.根據(jù)rs號(hào)得到位點(diǎn)信息及目標(biāo)序列+2.1 primer primer 5.02.引物設(shè)計(jì)2.2 引物特異性檢查 2.引物設(shè)計(jì)避免熒光標(biāo)記避免熒光標(biāo)記測(cè)序引物長(zhǎng)度測(cè)序引物長(zhǎng)度16-25bp，TM值值50-65為宜為宜,55最佳測(cè)序引物位置避免測(cè)序引物位置避免Poly（A.T）和高）和高GC結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)測(cè)序引物位置距離位點(diǎn)最多測(cè)序引物位置距離位點(diǎn)最多600bp，至少，至少

3、50bp不能使用兼并引物測(cè)序不能使用兼并引物測(cè)序引物純度（引物純度（PAGE純化方式）純化方式）2.3 設(shè)計(jì)引物還需注意3.測(cè)序PCR模板的制備根據(jù)合成回來(lái)的引物濃度稀釋，一般工作液10umol/ul(4保存)，母液100umol/ul（-20保存）1.PCR擴(kuò)增三步法：變性-退火-延伸2.退火溫度：(Ftm+Rtm)/2-53.延伸時(shí)間：1kb=1min根據(jù)設(shè)計(jì)好的參數(shù)，設(shè)置使用PCR儀器擴(kuò)增.3.1 PCR擴(kuò)增擴(kuò)增稀釋引物稀釋引物 設(shè)計(jì)方案設(shè)計(jì)方案pcr儀擴(kuò)增儀擴(kuò)增 依賴于依賴于PCR反應(yīng)的優(yōu)化程反應(yīng)的優(yōu)化程PCR產(chǎn)物的質(zhì)量產(chǎn)物的質(zhì)量 選擇最佳的純化方法選擇最佳的純化方法純化的意義純化的意

4、義純化（試劑盒）純化（試劑盒）方式選擇方式選擇1.柱純化：用于特異柱純化：用于特異PCR產(chǎn)物純化或存在產(chǎn)物純化或存在100bp的非特異產(chǎn)物的純化的非特異產(chǎn)物的純化 (如：引物二聚體如：引物二聚體)2.切膠回收：切膠回收：可用于任何質(zhì)量的可用于任何質(zhì)量的PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物純化切下條帶，去除非特異切下條帶，去除非特異PCR產(chǎn)物和引物二聚體產(chǎn)物和引物二聚體v3.2 PCR產(chǎn)物純化產(chǎn)物純化去除去除PCR反應(yīng)液的反應(yīng)液的殘留殘留1.殘留的引物：保證引物特異性，避免多重測(cè)殘留的引物：保證引物特異性，避免多重測(cè)序序2.殘留的殘留的dNTP:以保持以保持dNTPs / ddNTPs的最佳的最佳比例比例3.鹽成

5、分：避免抑制測(cè)序酶活性鹽成分：避免抑制測(cè)序酶活性4.非特異非特異PCR產(chǎn)物：避免擴(kuò)增出同源性區(qū)域產(chǎn)物：避免擴(kuò)增出同源性區(qū)域測(cè)序測(cè)序PCR 酒精/EDTA/NaAc法：去除殘留的BigDye Terminator(染料峰) 測(cè)序產(chǎn)物脫鹽 純化好的測(cè)序產(chǎn)物比較穩(wěn)定測(cè)序產(chǎn)物測(cè)序產(chǎn)物純化純化4.測(cè)序樣品制備測(cè)序PCR（以回收PCR產(chǎn)物為模板）：96 1 min -(96 10 sec - 50 5 sec - 60 4 min) x 25循環(huán)-4 保溫測(cè)序測(cè)序PCR與普通與普通PCR的區(qū)別的區(qū)別5. 上機(jī)測(cè)序pcr擴(kuò)增儀器中擴(kuò)增儀器中95變性變性4min4min。.5.1 測(cè)序樣品變性測(cè)序樣品變性5.

6、2 上機(jī)操作上機(jī)操作三、 測(cè)序結(jié)果分析怎樣怎樣看測(cè)序結(jié)果看測(cè)序結(jié)果怎樣得到位點(diǎn)基因型怎樣得到位點(diǎn)基因型常見(jiàn)峰圖介紹常見(jiàn)峰圖介紹保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性保證測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性峰圖判斷三要素：電泳圖(Electropherogram)、峰圖(Raw)、QV值峰圖 電泳圖/QV值1.怎么看峰圖（分析軟件Sequence Analysis）Raw：峰圖Electropherogram：電泳圖QV值QV值越高，讀圖越準(zhǔn)確。QV值為藍(lán)色，表示可信。QV值為黃色，表示不準(zhǔn)確，需要人工判讀。QV值為紅色，表示不可信QV值根據(jù)得到位點(diǎn)信息，將位點(diǎn)3保守序列（10個(gè)堿基左右），在軟件中Chromas查找，前面即為突變基

7、因型。PS:如果是反向引物測(cè)序需要將測(cè)序結(jié)果反向互補(bǔ)2.怎樣得到位點(diǎn)基因型（分析軟件Chromas）正常及無(wú)信號(hào)、信號(hào)弱測(cè)序峰圖樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測(cè)序峰圖測(cè)序儀器影響及測(cè)序峰圖純化因素影響及測(cè)序峰圖引物質(zhì)量影響及測(cè)序峰圖3.常見(jiàn)峰圖介紹及分析正常峰圖（有完整峰型、單一峰尖銳獨(dú)立、QV值基本上為藍(lán)色)Electropherogram：Raw：無(wú)信號(hào)（無(wú)完整峰型、無(wú)信號(hào)或信號(hào)值較低、峰圖雜亂無(wú)章、絕大部分不可信）Raw：Electropherogram：信號(hào)弱（有較完整峰型、信號(hào)值較低、峰圖部分可信）Raw：Electropherogram：正常及無(wú)信號(hào)測(cè)序峰圖樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測(cè)序峰圖測(cè)序儀器影

8、響及測(cè)序峰圖純化因素影響及測(cè)序峰圖引物質(zhì)量影響及測(cè)序峰圖3.常見(jiàn)峰圖介紹及分析poly（A、T）結(jié)構(gòu)導(dǎo)致后雙峰返回Electropherogram：Raw：測(cè)序信號(hào)中斷（二級(jí)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致）返回Electropherogram：Raw：序列結(jié)構(gòu)高GC導(dǎo)致信號(hào)衰減返回Electropherogram：Raw：正常及無(wú)信號(hào)測(cè)序峰圖樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測(cè)序峰圖測(cè)序儀器影響及測(cè)序峰圖純化因素影響及測(cè)序峰圖引物質(zhì)量影響及測(cè)序峰圖3.常見(jiàn)峰圖介紹及分析峰圖出現(xiàn)斷層（可先重跑看是否解決，需要換Buffer）Electropherogram（電泳圖、QV正常）Raw：毛細(xì)管堵塞導(dǎo)致拖尾（可先重跑看是否解決，或者清理毛細(xì)管）Electropherogram（展開(kāi)圖正常）Raw：毛細(xì)管堵塞導(dǎo)致寬峰（可先重跑看是否解決，或者清理毛細(xì)管）Electropherogram：Raw：正常及無(wú)信號(hào)測(cè)序峰圖樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)影響及測(cè)序峰圖測(cè)序儀器影響及測(cè)序峰圖純化因素影響及測(cè)序峰圖引物質(zhì)量影響及測(cè)序峰圖3.常見(jiàn)峰圖介紹及分析染料峰（純化操作不規(guī)范或者ddntp過(guò)量）返回Electropherogram：Raw：正常及無(wú)信號(hào)測(cè)序