HCV病毒分子分型方法_海口丙肝醫(yī)院

1、HCV分子分型方法海南中醫(yī)藥研究所附屬瓊島醫(yī)院肝病中心 丙肝病毒HCV1975年, 英國Lancet雜志首次使用非甲非乙型肝炎這個名詞1989 年, HCV cDNA 克隆成功, 并正式命名HCV1991年國際病毒命名委員會( ICTV ) 將HCV 歸為病毒科丙型肝炎病毒屬 HCV全球分布情況 HCV基因其基因組為單股正鏈RNA, 易變異。全長9. 6 kb341 b的5非編碼區(qū)( 5NTR, NCR, UTR )27b的3非編碼區(qū)( 3NRT )。在病毒復(fù)制中, 氨基酸有三個蛋白( C、E1、E2 /NS1) 羧基端有4個蛋白( NS2、NS3、NS4、NS5) HCV 基因分型分類系統(tǒng)不

2、同的研究者建立并使用各自的HCV 分類系統(tǒng)主要的命名系統(tǒng)有: Chan系統(tǒng)、Simmonds 系統(tǒng)、Okamoto 分類系統(tǒng)、Kanazawa命名系統(tǒng)第二屆HCV 與相關(guān)病毒國際討論會議上, 制定了統(tǒng)一的命名系統(tǒng)-Simmonds系統(tǒng),目前認為主要有6種HCV基因型及不同亞型,以阿拉伯?dāng)?shù)字表示HCV 基因型, 以小寫的英文字母表示基因的亞型(如1 a、2 b、3 c等)。HCV 基因型分布基因型分布北美北美: 1, 3, 2南美南美: 1, 2, 3歐洲歐洲: 1, 3, 2非洲非洲: 2, 1, 3, 4, 5, 6亞洲亞洲: 2, 1, 3, 4, 6中東中東: 4中國：中國：1b，2，6

3、 HCV 基因分型區(qū)域的選擇最準確的方法就是對基因組的某個區(qū)進行PCR 擴增、測序及進化樹分析, 選擇的區(qū)有NS5、Core、E1和5UTR通常建立在5 UTR, 因為該區(qū)是HCV RNA 診斷實驗的常用區(qū)域 基因分型的分子學(xué)方法（1）測序法：測全長或片段 金標準 費時費力 不適于臨床 （2）基因型特異性引物PCR法Okamoto等首先采用分型的效果仍比較差需使用7對引物Okamoto H et al. J Gen Virol. (1992) Typing hepatitis C virus by polymerase chain reaction with type-specific pri

4、mers: application to clinical surveys and tracing infectious sources. ( 3)型特異性探針雜交( LIPA ) 將生物素或熒光素標記型特異性探針固化相化在膜或芯片與RT- PCR擴增的病毒產(chǎn)物進行雜交是建立在5非編碼區(qū)基礎(chǔ)上有5% 10%的1 a、1 b 型不能鑒別, 也不能區(qū)別2 a 和2 c 型。Stuyver L，Wyseau A，Maertens G，et al. Second generadon line probe assay for hepatim C virus genotyping Jjourhal of

5、Clinical Microbiology，1996；34：2259HCV genotypes in Northern Italy: a survey of 1368 histologically proven chronic hepatitis C patients ( 4)限制性片段長度多態(tài)性分析( RFLP)法:用能識別特定酶切位點的限制性內(nèi)切酶將PCR 擴增的片段切割成不同長度的片段該方法常用的酶為HaeIII、RsaI 、Mva I 、Hinf I、Scrf I該方法檢測基因型的精確度為97不能區(qū)分所有的HCV基因亞型也不能識別在泰國和越南發(fā)現(xiàn)的變異基因型，Davidson F, S

6、immonds P, Ferguson JC, et al. Survey of major genotypes and subtypes of hepatitis C virus using RFLP of sequences amplified from the 5non-coding region. J Gen Virol, 1995, 76:1197-1204. ( 5)遺傳發(fā)育關(guān)系進化樹對一定區(qū)域的樣本測序結(jié)束后可將序列互相比較分析樣本間序列的進化距離, 畫出該區(qū)域內(nèi)HCV 流行的關(guān)系進化樹,觀察HCV 在區(qū)域內(nèi)的分子流行情況及特點 （6）特異引物錯配延伸法(PSMEA)：利用taq

7、酶在引物3末端發(fā)生錯配時無法繼續(xù)延伸借助熒光測量儀檢出錯配峰出現(xiàn)的頻率達到分型目的該方法成為檢測混合HCV基因型感染的方法比直接測序靈敏度高20倍Antonishyn NA, Ast VM, McDonald RR. et al.Rap id genotyping of hepatitis C virus by primer- specific extension analysis J. Clin Microbio,l 2005, 43: 5158- 5563. （7）異源分子遷移率法（HMA）：用已知不同型的HCV 參比DNA 與未知基因型的HCV 的DNA 分子混合、變性、退火, 形成同源

8、、異源分子,這些分子在PA GE 中遷移率不同, 并同異源DNA 中不同堿基的數(shù)目成比例, 來鑒定基因型 王林, 徐東平, 張靈霞. 丙型肝炎病毒基因型分型及臨床意義 J. 肝臟2006, 12: 416- 417. （8）COMA基因分型法：原理是基于長異源雙鏈的解鏈特性不同用已知的序列順序的參考DNA捕獲液相中未知的DNA兩者形成異源雙鏈雜交體，由這個雜交體的兩條單鏈間解鏈曲線的差異可以推斷出其序列差異Genotyping HIV-1 and HCV strains by a combinatorial DNA melting assay (COMA).Kostrikis LG et al. Mol Med.