纖維素降解菌的分離與鑒定

1、環(huán)境中纖維素降解菌的篩選和初步鑒定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?從環(huán)境中篩選出能降解纖維素的菌株 初步鑒定出菌株所屬的類型 纖維素酶酶系組成及降解機(jī)理 纖維素酶酶系包括內(nèi)切葡聚糖酶(Cx酶）、外切葡聚糖酶(Cl酶)，來自真菌簡稱CBH，來自細(xì)菌簡稱Cex)和B葡聚糖苷酶l，也稱纖維二糖酶，簡稱BG)。濾紙酶(FPase)活力代表了三種酶協(xié)同作用后的總酶活力。 纖維素是有許多葡萄糖分子通過-1，4一糖苷鍵連接起來的大分子物質(zhì)，對其的水解需要上述三種酶的共同作用。酶的種類完整性、各種酶之間的比例關(guān)系等都會(huì)影響到纖維素酶的整體活力。 纖維素酶的來源 自然界中存在大量可以產(chǎn)生纖維素酶的微生物，真菌、細(xì)菌、放線菌等。 咀纖

2、維素為食的反芻動(dòng)物，牛，驢等，其胃腸內(nèi)就存在大量的產(chǎn)纖維素酶的微生物。 一些昆蟲，如白蟻的腸道也可咀產(chǎn)生纖維素酶。 來源不同的纖維素酶其特點(diǎn)也不盡相同，由此構(gòu)成了各具特色的纖維素降解酶系。 真菌所產(chǎn)的纖維素酶特點(diǎn)： 胞外酶、往往酶活較高、易于收集檢測，對于天然纖維索的降解也有較好效果。以絲狀真苗中的木霉屬作為產(chǎn)酶真菌被研究最為透徹。 細(xì)菌所產(chǎn)的纖維素酶特點(diǎn)： 纖維素酶量較少，大多為胞內(nèi)酶，對于天然纖維素的降解能力也較弱。細(xì)菌中如芽孢桿菌可以產(chǎn)生堿性纖維素酶。 放線菌所產(chǎn)的纖維素酶特點(diǎn)： 往往具有耐堿的特性，部分菌株產(chǎn)生的纖維素酶活力也較高，結(jié)構(gòu)簡單。 培養(yǎng)基原理纖維素培養(yǎng)基 作為初篩時(shí)的富集培

3、養(yǎng)基，得到各種類型的纖維素降解菌。纖維素剛果紅培養(yǎng)基 剛果紅培養(yǎng)基能使產(chǎn)纖維素酶的菌株在平板上形成水解圈。 纖維素是由葡萄糖殘基以 -1, 4糖苷鍵連接而成的線狀大分子物質(zhì), 纖維素水解酶能水解此糖苷鍵, 使其變?yōu)槔w維二糖和葡萄糖,水解后的糖類同剛果紅染料形成紅色沉淀,顏色濃郁,厚重,所以此水解圈在菌落生長過程中清晰可見,不易發(fā)生錯(cuò)誤識(shí)別。 培養(yǎng)基：纖維素培養(yǎng)基、纖維素 剛果紅培養(yǎng)基 樣品：含腐葉的土壤。 儀器及其他用品：酒精燈、載玻片、蓋玻片、顯微鏡、滴管、試管、培養(yǎng)皿、錐形瓶、槍頭、涂布器、濾紙。2. 物品準(zhǔn)備3. 滅菌4. 鋪試管斜面，倒平板6. 分離7. 纖維素降解菌的純化8. 形態(tài)觀

4、察及初步鑒定5.初篩1.培養(yǎng)基的配制及分裝培養(yǎng)基的配置和分裝纖維素瓊脂培養(yǎng)基： (NH4)2SO4 2 g , MgSO4 7g， H2O 1 g , NaCl 1 g , CaCO3 2 g , 水 500mL , 121 滅菌20 min，倒平板后,蓋上與平板大小一致的無菌濾紙（注意：濾紙要用稀醋酸浸泡一夜 ，用碘液檢查是否有淀粉 ，若已去除完全 ， 則用 2蘇打水沖洗至中性，干熱滅菌后備用 ）。 物品準(zhǔn)備 盛有9 mL水的試管，6支（試管用膠塞塞住） 在容積為250 mL的三角瓶內(nèi)加入玻璃珠，以蓋住瓶底為宜（作用：打散土壤結(jié)塊），再加入90 mL蒸餾水，1瓶 試管斜面 8支 平板9個(gè) 1

5、 mL槍頭盒，1盒 涂布器8支 濾紙9個(gè)培養(yǎng)基的配置和分裝 纖維素剛果紅培養(yǎng)基： K2HPO4 0 . 5 g , CMC- N a 1. 88 g , M gSO47H2O 0 . 25 g , 明膠 2 g , 剛果紅 0. 2 g , 瓊脂 14 g , 土壤浸出液 100mL（滅菌后加） , H2O 900mL, pH值為 6 7。初篩以下各步驟均在無菌條件下進(jìn)行。（1）稱取土壤樣品10 g，倒入含有90 mL水和玻璃珠的三角瓶中振蕩5 min，使土樣充分打散。（注意：等水冷卻了再倒入土樣。）（2）取 5 mL懸液加入盛有 50 mL富集培養(yǎng)基 (纖維素瓊脂培養(yǎng)基 )的三角瓶,在 28

6、 和 150 r/min下, 振蕩培養(yǎng) 3 5 d后移取 5mL培養(yǎng)液至另一盛有新鮮富集培養(yǎng)基的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。分離（1）無菌條件下，取富集后的培養(yǎng)液將土壤懸液稀釋成10-110-7系列濃度。（2）分別用移液器精確地吸取各稀釋菌液0.2 0.3 mL，對號先后涂布于編好號剛果紅培養(yǎng)基平板,（涂布時(shí)涂布棒要從濃度小的梯度開始，將加入平板培養(yǎng)基上的土壤稀釋液在整個(gè)平板表面涂勻，涂完一個(gè)平板用酒精燈滅菌）。置于 30 培養(yǎng)箱中，倒置培養(yǎng)一周。 （3）分別挑選出透明圈大的菌落,即為分解能力較強(qiáng)的菌纖維素降解菌的純化(1)在無菌條件下，挑取單菌落的孢子“之”字劃線于試管的斜面上，在上方蓋上一條濾紙。(2)將試管置于2830oC的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周。形態(tài)觀察與鑒定直接觀察：在培養(yǎng)基中，整體觀察菌落特征及其顏色，確定其所屬類型。印片觀察：取一小塊帶培養(yǎng)基的菌落正放于載玻片上，然后用另一載玻片加熱后按壓，注意不要滑動(dòng)玻片。取上面的印片，有印跡的一面朝上，在40 x物鏡下觀察。如需染色，先將有印跡的載玻片通過火焰23次固定，再用美藍(lán)染色觀察（染色1 min，水洗，干燥后觀察），對細(xì)菌可進(jìn)行革蘭氏染色, 在顯微鏡下觀察其菌株形態(tài), 并初步鑒定其種類。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 在纖維素分解菌的篩選過程中, 本試驗(yàn)采用了2種分離纖維素分解菌的培養(yǎng)