第三章 DNA復(fù)制

1、3 DNA復(fù)制復(fù)制3.1 DNA復(fù)制的基本原則復(fù)制的基本原則3.2 DNA復(fù)制的方式復(fù)制的方式3.3 DNA復(fù)制的酶類(lèi)體系復(fù)制的酶類(lèi)體系3.4 DNA復(fù)制過(guò)程復(fù)制過(guò)程3.5 端粒和端粒酶端粒和端粒酶3.1 DNA復(fù)制的基本原則復(fù)制的基本原則 3.1.1 DNA的半保留復(fù)制的半保留復(fù)制 概念：在復(fù)制時(shí)，以概念：在復(fù)制時(shí)，以DNA每條鏈為模板，合每條鏈為模板，合成互補(bǔ)鏈，形成的兩個(gè)子代成互補(bǔ)鏈，形成的兩個(gè)子代DNA分子與親代分子與親代DNA分子完全相同，各有一條鏈來(lái)自親本，一分子完全相同，各有一條鏈來(lái)自親本，一條鏈為新合成的。條鏈為新合成的。 DNA復(fù)制模式的提出：半保留復(fù)制模式、全復(fù)制模式的提出

2、：半保留復(fù)制模式、全保留復(fù)制模式和分散復(fù)制模式保留復(fù)制模式和分散復(fù)制模式 1958年，年，Meselson及及Stahl以大腸桿菌為以大腸桿菌為實(shí)驗(yàn)材料，借助放射性同位素（實(shí)驗(yàn)材料，借助放射性同位素（15N）標(biāo)記和）標(biāo)記和CsCl密度梯度離心（密度梯度離心（Density gradient centrifugation）等技術(shù)首次證明了）等技術(shù)首次證明了DNA的的半保留復(fù)制模型的正確性半保留復(fù)制模型的正確性 3.1.2 DNA復(fù)制的半不連續(xù)性復(fù)制的半不連續(xù)性 1968年，日本學(xué)者岡崎等用年，日本學(xué)者岡崎等用3H-脫氧胸苷標(biāo)記的脫氧胸苷標(biāo)記的噬菌體噬菌體T4感染大腸桿菌，再通過(guò)感染大腸桿菌，再通

3、過(guò)CsCl密度梯度離密度梯度離心分離出標(biāo)記的心分離出標(biāo)記的DNA產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)先合成的是產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)先合成的是1000個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的片段。 說(shuō)明說(shuō)明DNA復(fù)制中先合成較短片段，再由連接酶連復(fù)制中先合成較短片段，再由連接酶連成大分子成大分子DNA DNA復(fù)制是以半不連續(xù)方式進(jìn)行，一條鏈的合成按復(fù)制是以半不連續(xù)方式進(jìn)行，一條鏈的合成按53方向連續(xù)合成，其合成方向與復(fù)制叉的移動(dòng)方方向連續(xù)合成，其合成方向與復(fù)制叉的移動(dòng)方向一致，稱(chēng)為前導(dǎo)鏈（向一致，稱(chēng)為前導(dǎo)鏈（Leading strand），另一條鏈），另一條鏈的的DNA合成是在復(fù)制叉打開(kāi)到一定程度后才開(kāi)始的，合成是在復(fù)制叉打開(kāi)到一定程度

4、后才開(kāi)始的，先合成許多不連續(xù)的小片段（岡崎片段，先合成許多不連續(xù)的小片段（岡崎片段，Okazaki fragment ），最后合成一條完整的），最后合成一條完整的DNA鏈，稱(chēng)為后鏈，稱(chēng)為后滯鏈（滯鏈（Lagging strand）。）。 3.1.3 DNA復(fù)制的引物復(fù)制的引物 DNA的合成需要引物，的合成需要引物，RNA的合成不需要的合成不需要引物。引物。 實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)自實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)自M13噬菌體噬菌體DNA在大腸桿菌在大腸桿菌細(xì)胞中的復(fù)制過(guò)程被利福平（細(xì)胞中的復(fù)制過(guò)程被利福平（Rifampicin）抑制的實(shí)驗(yàn)。抑制的實(shí)驗(yàn)。 目的：保持目的：保持DNA復(fù)制的高度忠實(shí)性。復(fù)制的高度忠實(shí)性。 原因：原

5、因：DNA聚合酶具有校正活性，而聚合酶具有校正活性，而RNA聚聚合酶沒(méi)有校正功能。在低保真引物完成功能合酶沒(méi)有校正功能。在低保真引物完成功能后將其刪除，而代之以后將其刪除，而代之以DNA聚合酶聚合酶指導(dǎo)合指導(dǎo)合成的高保真成的高保真DNA鏈。鏈。 結(jié)果：使結(jié)果：使DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性提高了復(fù)制的準(zhǔn)確性提高了105倍。倍。 3.1.4 DNA的雙向復(fù)制的雙向復(fù)制 大多數(shù)真核和原核生物的大多數(shù)真核和原核生物的DNA都進(jìn)行雙向都進(jìn)行雙向復(fù)制，即復(fù)制時(shí)兩個(gè)復(fù)制叉從復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始，復(fù)制，即復(fù)制時(shí)兩個(gè)復(fù)制叉從復(fù)制起點(diǎn)開(kāi)始，同時(shí)向兩個(gè)方向推進(jìn)。當(dāng)然也存在單向復(fù)制，同時(shí)向兩個(gè)方向推進(jìn)。當(dāng)然也存在單向復(fù)制，即僅有一個(gè)

6、復(fù)制叉運(yùn)動(dòng)，而另一個(gè)復(fù)制叉一即僅有一個(gè)復(fù)制叉運(yùn)動(dòng)，而另一個(gè)復(fù)制叉一直停留在復(fù)制的起點(diǎn)。直停留在復(fù)制的起點(diǎn)。 Gyurasits和和Wake通過(guò)對(duì)枯草桿菌通過(guò)對(duì)枯草桿菌DNA復(fù)復(fù)制的放射自顯影實(shí)驗(yàn)揭示了制的放射自顯影實(shí)驗(yàn)揭示了DNA的雙向復(fù)的雙向復(fù)制機(jī)制制機(jī)制 3.2 DNA3.2 DNA復(fù)制的方式復(fù)制的方式 DNA中發(fā)生一次復(fù)制的單位稱(chēng)為復(fù)制子中發(fā)生一次復(fù)制的單位稱(chēng)為復(fù)制子（Replicon）。）。 原核基因組中只含有一個(gè)環(huán)狀的復(fù)制子，在唯一原核基因組中只含有一個(gè)環(huán)狀的復(fù)制子，在唯一起始點(diǎn)啟動(dòng)會(huì)引發(fā)整個(gè)基因組的復(fù)制。大腸桿菌起始點(diǎn)啟動(dòng)會(huì)引發(fā)整個(gè)基因組的復(fù)制。大腸桿菌基因組從唯一的起始點(diǎn)基因組從

7、唯一的起始點(diǎn)OriC開(kāi)始進(jìn)行雙向復(fù)制，開(kāi)始進(jìn)行雙向復(fù)制，形成的兩個(gè)復(fù)制叉基本以相同速度推進(jìn)，其復(fù)制形成的兩個(gè)復(fù)制叉基本以相同速度推進(jìn)，其復(fù)制終點(diǎn)在終點(diǎn)在OriC正對(duì)面近乎正對(duì)面近乎180處。處。 真核細(xì)胞中的每條染色體的復(fù)制均是通過(guò)多個(gè)復(fù)真核細(xì)胞中的每條染色體的復(fù)制均是通過(guò)多個(gè)復(fù)制子完成的，通常也是進(jìn)行雙向復(fù)制，相鄰復(fù)制制子完成的，通常也是進(jìn)行雙向復(fù)制，相鄰復(fù)制叉相遇后發(fā)生融合，因此不存在明顯的終止位點(diǎn)。叉相遇后發(fā)生融合，因此不存在明顯的終止位點(diǎn)。 3.2.1 型復(fù)制型復(fù)制 原核生物原核生物DNA從起始點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制，隨著復(fù)從起始點(diǎn)開(kāi)始復(fù)制，隨著復(fù)制叉向前推進(jìn)，復(fù)制區(qū)域就像在非復(fù)制區(qū)制叉向前推進(jìn)，

8、復(fù)制區(qū)域就像在非復(fù)制區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生氣泡并不斷擴(kuò)大，形成域內(nèi)產(chǎn)生氣泡并不斷擴(kuò)大，形成結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。 Cairns揭示了大腸桿菌揭示了大腸桿菌DNA的的型復(fù)制過(guò)型復(fù)制過(guò)程。程。 3.2.2 滾環(huán)復(fù)制滾環(huán)復(fù)制 有些環(huán)狀有些環(huán)狀DNA以滾環(huán)模式復(fù)制，即雙鏈中以滾環(huán)模式復(fù)制，即雙鏈中的一條鏈產(chǎn)生一個(gè)缺口，的一條鏈產(chǎn)生一個(gè)缺口，DNA聚合酶從缺聚合酶從缺口上的口上的3端開(kāi)始，以另一條完整鏈為模板進(jìn)端開(kāi)始，以另一條完整鏈為模板進(jìn)行鏈的延伸，這樣新合成的鏈將替代原來(lái)行鏈的延伸，這樣新合成的鏈將替代原來(lái)的親本鏈，好象模板環(huán)在不斷滾動(dòng)。（的親本鏈，好象模板環(huán)在不斷滾動(dòng)。（圖圖3-7A ） 圖圖3-7B：噬菌體：噬菌體1

9、74的單鏈的單鏈DNA首先形成首先形成雙鏈的復(fù)制型（雙鏈的復(fù)制型（Replicative form），在），在DNA正鏈的復(fù)制起始點(diǎn)上進(jìn)行單鏈切斷，正鏈的復(fù)制起始點(diǎn)上進(jìn)行單鏈切斷，5端與端與A蛋白相連，蛋白相連，DNA聚合酶聚合酶以未切斷的負(fù)鏈為以未切斷的負(fù)鏈為模板，從正鏈的模板，從正鏈的3端開(kāi)始不斷延伸進(jìn)行復(fù)制，端開(kāi)始不斷延伸進(jìn)行復(fù)制，5端卻不斷地脫離環(huán)狀模板被剝離出來(lái)，成為端卻不斷地脫離環(huán)狀模板被剝離出來(lái)，成為越來(lái)越長(zhǎng)的游離單鏈。當(dāng)復(fù)制回到起始點(diǎn)時(shí)，越來(lái)越長(zhǎng)的游離單鏈。當(dāng)復(fù)制回到起始點(diǎn)時(shí)，具有內(nèi)切酶活性的具有內(nèi)切酶活性的A蛋白切割起始點(diǎn)并結(jié)合于蛋白切割起始點(diǎn)并結(jié)合于新的新的5端，被替代的正

10、鏈以環(huán)狀形式釋放。端，被替代的正鏈以環(huán)狀形式釋放。 3.2.3 D環(huán)復(fù)制環(huán)復(fù)制 線粒體和葉綠體的雙鏈環(huán)狀線粒體和葉綠體的雙鏈環(huán)狀DNA從特殊位點(diǎn)從特殊位點(diǎn)開(kāi)始解鏈，但兩條親代鏈中只有一條作為模板開(kāi)始解鏈，但兩條親代鏈中只有一條作為模板（H鏈）合成新鏈，開(kāi)始復(fù)制出一小段鏈）合成新鏈，開(kāi)始復(fù)制出一小段DNA，取代了原來(lái)的互補(bǔ)鏈（取代了原來(lái)的互補(bǔ)鏈（L鏈），這樣一條單鏈鏈），這樣一條單鏈和一條雙鏈組成的結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為置換環(huán)和一條雙鏈組成的結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為置換環(huán)（Displacement loop）或）或D環(huán)。隨著復(fù)制的環(huán)。隨著復(fù)制的繼續(xù)進(jìn)行，繼續(xù)進(jìn)行，D環(huán)不斷擴(kuò)大，環(huán)不斷擴(kuò)大，L鏈被不斷置換，鏈被不斷置換，直

11、至直至L鏈上的起始位點(diǎn)暴露，開(kāi)始新的鏈上的起始位點(diǎn)暴露，開(kāi)始新的H鏈的鏈的合成。因此雙鏈合成。因此雙鏈DNA的兩條鏈分別有自己不的兩條鏈分別有自己不同的同的Ori。 3.3 DNA3.3 DNA復(fù)制的酶類(lèi)體系復(fù)制的酶類(lèi)體系 3.3.1 原核生物原核生物DNA復(fù)制的酶及蛋白質(zhì)復(fù)制的酶及蛋白質(zhì)3.3.1.1 DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerases） 大腸桿菌中至少具有大腸桿菌中至少具有5種種DNA聚合酶，其中聚合酶，其中DNA聚合酶聚合酶是復(fù)制過(guò)程中最重要的酶，是復(fù)制過(guò)程中最重要的酶，DNA聚合酶聚合酶在復(fù)制、重組以及其他修復(fù)過(guò)程在復(fù)制、重組以及其他修復(fù)過(guò)程中起清除作用。而中起清除作

12、用。而DNA聚合酶聚合酶、則均則均與與DNA的損傷修復(fù)有關(guān)。的損傷修復(fù)有關(guān)。 表表3-1 大腸桿菌大腸桿菌DNA聚合酶的比較聚合酶的比較 DNA聚合酶聚合酶主要作用是在主要作用是在DNA復(fù)制的過(guò)程復(fù)制的過(guò)程中負(fù)責(zé)清除中負(fù)責(zé)清除RNA引物，該功能依賴(lài)于其引物，該功能依賴(lài)于其5 3外切酶活性。外切酶活性。 DNA聚合酶聚合酶的的“缺口平移缺口平移”過(guò)程可用于制過(guò)程可用于制備放射性標(biāo)記核酸探針。備放射性標(biāo)記核酸探針。 DNA聚合酶聚合酶經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生經(jīng)枯草桿菌蛋白酶處理后產(chǎn)生的大片段稱(chēng)為的大片段稱(chēng)為Klenow片段，失去了原來(lái)的片段，失去了原來(lái)的53外切酶活性。外切酶活性。 DNA聚合酶

13、聚合酶至少包含至少包含10個(gè)亞基。個(gè)亞基。 、三個(gè)亞基構(gòu)成的催化核心，三個(gè)亞基構(gòu)成的催化核心，亞基具有亞基具有53聚合酶活性，聚合酶活性，亞基具有亞基具有35外切酶活性，外切酶活性，亞基負(fù)責(zé)激活外切酶活性。亞基負(fù)責(zé)激活外切酶活性。 兩個(gè)兩個(gè)亞基形成亞基形成“夾鉗夾鉗”（Clamp），套在），套在DNA模板上，在復(fù)制時(shí)沿著模板滑動(dòng)，防止聚合酶從模板上，在復(fù)制時(shí)沿著模板滑動(dòng)，防止聚合酶從DNA上脫離。上脫離。 二聚化亞基二聚化亞基使兩個(gè)催化核心連接在一起。使兩個(gè)催化核心連接在一起。 由由2組成的組成的復(fù)合體作為夾鉗裝載機(jī)復(fù)合體作為夾鉗裝載機(jī)（Clamp loader），負(fù)責(zé)將），負(fù)責(zé)將亞基結(jié)合到亞

14、基結(jié)合到DNA上。上。 因此，因此，DNA聚合酶聚合酶是一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的二聚體，每是一個(gè)不對(duì)稱(chēng)的二聚體，每個(gè)單體都具有一個(gè)催化核心、一個(gè)二聚化亞基、個(gè)單體都具有一個(gè)催化核心、一個(gè)二聚化亞基、一個(gè)具有前進(jìn)能力的亞基，能同時(shí)催化兩條一個(gè)具有前進(jìn)能力的亞基，能同時(shí)催化兩條DNA鏈的合成鏈的合成3.3.1.2 解旋酶解旋酶（Helicase） 解旋酶解旋酶能利用水解能利用水解ATP產(chǎn)生的能量使產(chǎn)生的能量使DNA解解鏈。鏈。 在大腸桿菌中，有在大腸桿菌中，有12種不同的解旋酶。種不同的解旋酶。 解旋酶通常是多聚體，典型的是六聚體結(jié)構(gòu)。解旋酶通常是多聚體，典型的是六聚體結(jié)構(gòu)。3.3.1.3 單鏈結(jié)合蛋白單鏈結(jié)

15、合蛋白 （Single-strand binding protein, SSB） 單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合并保護(hù)單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合并保護(hù)DNA單鏈，阻止單鏈，阻止其恢復(fù)成雙鏈體狀態(tài)。其恢復(fù)成雙鏈體狀態(tài)。 SSB一般以單體形式結(jié)合，但結(jié)合具有協(xié)一般以單體形式結(jié)合，但結(jié)合具有協(xié)同性。同性。 大腸桿菌的大腸桿菌的SSB是一個(gè)四聚體。是一個(gè)四聚體。3.3.1.4 DNA連接酶（連接酶（DNA ligase） 大腸桿菌的大腸桿菌的DNA連接酶分子量為連接酶分子量為 74000，能，能催化雙鏈催化雙鏈DNA中單鏈切口處的中單鏈切口處的5-磷酸和磷酸和3-羥羥基形成磷酸二酯鍵?；纬闪姿岫ユI。 連接反應(yīng)需要能量，大

16、腸桿菌和其他細(xì)菌的連接反應(yīng)需要能量，大腸桿菌和其他細(xì)菌的DNA連接酶是以連接酶是以NAD+作為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)作為能量來(lái)源，動(dòng)物細(xì)胞和噬菌體則是以胞和噬菌體則是以ATP作為能量來(lái)源。作為能量來(lái)源。3.3.1.4 拓?fù)洚悩?gòu)酶（拓?fù)洚悩?gòu)酶（Topoisomerase） DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，受超螺旋結(jié)構(gòu)所限制。的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，受超螺旋結(jié)構(gòu)所限制。 拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠調(diào)控拓?fù)洚悩?gòu)酶能夠調(diào)控DNA分子超螺旋水平，通過(guò)分子超螺旋水平，通過(guò)斷裂和再連接斷裂和再連接DNA鏈，改變鏈，改變DNA連接數(shù)。連接數(shù)。 類(lèi)型：類(lèi)型：型拓?fù)洚悩?gòu)酶斷裂一條型拓?fù)洚悩?gòu)酶斷裂一條DNA鏈，連接數(shù)鏈，連接數(shù)每次改變每次改變1，

17、反應(yīng)無(wú)需供給能量；，反應(yīng)無(wú)需供給能量；型拓?fù)洚悩?gòu)酶型拓?fù)洚悩?gòu)酶則斷裂兩條則斷裂兩條DNA鏈，連接數(shù)每次改變鏈，連接數(shù)每次改變2，反應(yīng)需，反應(yīng)需要由要由ATP提供能量。提供能量。3.3.2 真核生物真核生物DNA復(fù)制的酶及蛋白質(zhì)復(fù)制的酶及蛋白質(zhì) 真核細(xì)胞擁有多種真核細(xì)胞擁有多種DNA聚合酶，在復(fù)制和修復(fù)過(guò)聚合酶，在復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中起主要作用的有程中起主要作用的有DNA聚合酶聚合酶、。 復(fù)制作用的酶一般是多亞基的，而負(fù)責(zé)修復(fù)的酶復(fù)制作用的酶一般是多亞基的，而負(fù)責(zé)修復(fù)的酶則通常只有一個(gè)亞基。其中則通常只有一個(gè)亞基。其中DNA聚合酶聚合酶復(fù)制線粒復(fù)制線粒體體DNA，DNA聚合酶聚合酶則是一種高保真的堿

18、基切除則是一種高保真的堿基切除修復(fù)酶修復(fù)酶 。 細(xì)胞核細(xì)胞核DNA的復(fù)制主要涉及的復(fù)制主要涉及DNA聚合酶聚合酶、和和。 DNA聚合酶聚合酶具有引物酶的活性和聚合酶活性，具有引物酶的活性和聚合酶活性，但不具備校正活性，因此現(xiàn)在認(rèn)為但不具備校正活性，因此現(xiàn)在認(rèn)為DNA聚合酶聚合酶起始前導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成，之后由起始前導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成，之后由DNA聚合酶聚合酶繼續(xù)鏈的延伸工作。繼續(xù)鏈的延伸工作。DNA聚合酶聚合酶不僅是具有校不僅是具有校正活性的高保真聚合酶，而且具有高度的前進(jìn)能正活性的高保真聚合酶，而且具有高度的前進(jìn)能力。力。 DNA聚合酶聚合酶有時(shí)能取代有時(shí)能取代DNA聚合酶聚合酶延伸后滯延伸

19、后滯鏈，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)鏈，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)DNA聚合酶聚合酶具有別的活性，比如具有別的活性，比如它也能去除岡崎片段上的引物。它也能去除岡崎片段上的引物。表表3-2 真核生物主要真核生物主要DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)及功能聚合酶的結(jié)構(gòu)及功能 3.4 DNA3.4 DNA復(fù)制過(guò)程復(fù)制過(guò)程 3.4.1 原核生物原核生物DNA復(fù)制的過(guò)程復(fù)制的過(guò)程3.4.1.1 起始起始 大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)為大腸桿菌的復(fù)制起點(diǎn)為ori C，由，由245 bp組組成，關(guān)鍵序列：成，關(guān)鍵序列：3個(gè)個(gè)13bp重復(fù)序列（堿基組重復(fù)序列（堿基組成：成：GATCTNTTNTTTT）和）和4個(gè)個(gè)9bp重復(fù)序重復(fù)序列（堿基組成：列（堿基組成：TTATN

20、CANA）。）。 4個(gè)個(gè)9bp重復(fù)序列為重復(fù)序列為DnaA蛋白提供起始結(jié)合位點(diǎn)，蛋白提供起始結(jié)合位點(diǎn)，大約大約24個(gè)個(gè)DnaA蛋白各帶蛋白各帶1個(gè)個(gè)ATP結(jié)合在此位點(diǎn)結(jié)合在此位點(diǎn)上，并聚集在一起形成核心，上，并聚集在一起形成核心，DNA纏繞其上。纏繞其上。HU蛋白與蛋白與DNA結(jié)合，促使雙鏈結(jié)合，促使雙鏈DNA彎曲，使彎曲，使DnaA蛋白作用于鄰近蛋白作用于鄰近3個(gè)成串排列的、富含個(gè)成串排列的、富含AT的的13bp序列。在序列。在ATP存在的條件下，存在的條件下，3個(gè)個(gè)13bp序列序列被變性，成為首先解鏈的位點(diǎn)。緊接著，被變性，成為首先解鏈的位點(diǎn)。緊接著，2個(gè)個(gè)DnaB-DnaC復(fù)合體進(jìn)一步結(jié)

21、合到解鏈區(qū)上并取代復(fù)合體進(jìn)一步結(jié)合到解鏈區(qū)上并取代DnaA對(duì)對(duì)13bp序列的結(jié)合，復(fù)合體分別結(jié)合于解序列的結(jié)合，復(fù)合體分別結(jié)合于解鏈區(qū)的兩端，各自包含鏈區(qū)的兩端，各自包含1個(gè)個(gè)DnaB六聚體和六聚體和6個(gè)個(gè)DnaC單體。單體。DnaB利用其解旋酶活性繼續(xù)擴(kuò)大解利用其解旋酶活性繼續(xù)擴(kuò)大解鏈區(qū)，每個(gè)鏈區(qū)，每個(gè)DnaB進(jìn)一步激活一個(gè)進(jìn)一步激活一個(gè)DnaG引發(fā)酶，引發(fā)酶，在兩個(gè)復(fù)制叉上分別開(kāi)始進(jìn)行前導(dǎo)鏈和后滯鏈上在兩個(gè)復(fù)制叉上分別開(kāi)始進(jìn)行前導(dǎo)鏈和后滯鏈上RNA引物的合成，并開(kāi)始引物的合成，并開(kāi)始DNA的復(fù)制的復(fù)制 在細(xì)菌的在細(xì)菌的ori C中，共有中，共有11個(gè)個(gè)GATC序列，序列，Dam甲甲基化酶能

22、使其中的腺嘌呤基化酶能使其中的腺嘌呤N6被甲基化。被甲基化。 當(dāng)當(dāng)DNA完成復(fù)制后，完成復(fù)制后，ori C是半甲基化狀態(tài)。是半甲基化狀態(tài)。 半甲基化的起點(diǎn)不能發(fā)生復(fù)制的起始，直到新鏈半甲基化的起點(diǎn)不能發(fā)生復(fù)制的起始，直到新鏈的的ori C被完全甲基化。被完全甲基化。 起點(diǎn)處的起點(diǎn)處的GATC的半甲基化持續(xù)時(shí)間（的半甲基化持續(xù)時(shí)間（13min）大大超過(guò)基因組其余部位的大大超過(guò)基因組其余部位的GATC的半甲基化持的半甲基化持續(xù)時(shí)間（續(xù)時(shí)間（1.5min）。只有與）。只有與ori C靠近的靠近的dna A基基因啟動(dòng)子的再甲基化需要相同的延遲期。當(dāng)因啟動(dòng)子的再甲基化需要相同的延遲期。當(dāng)dna A啟動(dòng)子

23、處于半甲基化時(shí)，轉(zhuǎn)錄被阻遏，啟動(dòng)子處于半甲基化時(shí)，轉(zhuǎn)錄被阻遏，Dna A蛋白濃度降低。即當(dāng)關(guān)鍵性起始蛋白蛋白濃度降低。即當(dāng)關(guān)鍵性起始蛋白Dna A的合的合成受到阻遏時(shí)，起點(diǎn)也是無(wú)活性。成受到阻遏時(shí)，起點(diǎn)也是無(wú)活性。 3.4.1.2 延伸延伸 延伸階段同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成，前者延伸階段同時(shí)進(jìn)行前導(dǎo)鏈和后滯鏈的合成，前者持續(xù)合成，后者分段合成持續(xù)合成，后者分段合成 前導(dǎo)鏈開(kāi)始合成后就一直繼續(xù)下去，保持與復(fù)制前導(dǎo)鏈開(kāi)始合成后就一直繼續(xù)下去，保持與復(fù)制叉處叉處DNA的解旋同步。的解旋同步。 后滯鏈的合成則是分段進(jìn)行的，需要不斷合成岡后滯鏈的合成則是分段進(jìn)行的，需要不斷合成岡崎片段的崎片段的RN

24、A引物，然后由引物，然后由DNA聚合酶聚合酶延長(zhǎng)。延長(zhǎng)。 由于由于DNA的兩條互補(bǔ)鏈方向相反，又由同一個(gè)聚的兩條互補(bǔ)鏈方向相反，又由同一個(gè)聚合酶的不對(duì)稱(chēng)二聚體所催化，即二者的合成應(yīng)該合酶的不對(duì)稱(chēng)二聚體所催化，即二者的合成應(yīng)該是協(xié)調(diào)一致的。因此，后滯鏈必須繞成一個(gè)突環(huán)是協(xié)調(diào)一致的。因此，后滯鏈必須繞成一個(gè)突環(huán)（Loop） DnaB具有激活引物酶具有激活引物酶DnaG的功能，二者組合形成的功能，二者組合形成引發(fā)體（引發(fā)體（Primosome）。引發(fā)體由）。引發(fā)體由ATP提供能量沿提供能量沿復(fù)制叉方向運(yùn)動(dòng)，復(fù)制叉方向運(yùn)動(dòng)，DNA聚合酶聚合酶的一個(gè)催化核心連續(xù)的一個(gè)催化核心連續(xù)合成前導(dǎo)鏈，同時(shí)另一個(gè)催

25、化核心在后滯鏈突環(huán)上從合成前導(dǎo)鏈，同時(shí)另一個(gè)催化核心在后滯鏈突環(huán)上從一個(gè)岡崎片段滑動(dòng)到另一個(gè)岡崎片段，無(wú)需從聚合酶一個(gè)岡崎片段滑動(dòng)到另一個(gè)岡崎片段，無(wú)需從聚合酶復(fù)合體上解離下來(lái)。其基本過(guò)程如下：在復(fù)合體上解離下來(lái)。其基本過(guò)程如下：在DnaB解旋解旋時(shí)，與之結(jié)合的時(shí)，與之結(jié)合的DnaG合成一小段岡崎片段的引物，合成一小段岡崎片段的引物，合成的方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反。一個(gè)新的合成的方向與復(fù)制叉移動(dòng)方向相反。一個(gè)新的夾鉗夾鉗在此處被裝配，使在此處被裝配，使DNA聚合酶聚合酶的一個(gè)催化核心被定的一個(gè)催化核心被定位在該引物上。接著，位在該引物上。接著，DNA聚合酶聚合酶在引物在引物3-OH端端延伸片段

26、，直到遇到上一個(gè)岡崎片段的引物為止，可延伸片段，直到遇到上一個(gè)岡崎片段的引物為止，可能正是此停頓成為合成下一個(gè)岡崎片段能正是此停頓成為合成下一個(gè)岡崎片段RNA引物的信引物的信號(hào)，開(kāi)始又一個(gè)岡崎片段的起始合成。隨即號(hào)，開(kāi)始又一個(gè)岡崎片段的起始合成。隨即夾鉗解夾鉗解離，釋放催化核心和離，釋放催化核心和DNA鏈。催化核心再與下一個(gè)起鏈。催化核心再與下一個(gè)起始位置上的始位置上的夾鉗連接，開(kāi)始下一個(gè)岡崎片段的合成夾鉗連接，開(kāi)始下一個(gè)岡崎片段的合成 3.4.1.3 終止終止 細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個(gè)復(fù)制叉一般以近似相同細(xì)菌環(huán)狀染色體的兩個(gè)復(fù)制叉一般以近似相同的速度一起向前推移，最后在的速度一起向前推移，最后在

27、oriC的對(duì)面相遇，的對(duì)面相遇，此為復(fù)制的終止區(qū)域（此為復(fù)制的終止區(qū)域（Terminus region）。）。 大腸桿菌有大腸桿菌有5個(gè)終止位點(diǎn)，分別以個(gè)終止位點(diǎn)，分別以terAterE表表示，每個(gè)示，每個(gè)ter的終止作用都是不對(duì)稱(chēng)的，即不的終止作用都是不對(duì)稱(chēng)的，即不讓對(duì)側(cè)的復(fù)制叉超過(guò)中點(diǎn)后繼續(xù)復(fù)制。讓對(duì)側(cè)的復(fù)制叉超過(guò)中點(diǎn)后繼續(xù)復(fù)制。 ter位點(diǎn)上的位點(diǎn)上的23bp保守序列是保守序列是Tus（Terminus utilization substance，終止利用物質(zhì)）蛋白的，終止利用物質(zhì)）蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合位點(diǎn)。Tus-ter復(fù)合體能阻礙復(fù)合體能阻礙DnaB的解旋酶的解旋酶活性，使復(fù)制叉的移

28、動(dòng)停止，有效避免復(fù)制過(guò)量活性，使復(fù)制叉的移動(dòng)停止，有效避免復(fù)制過(guò)量情況的發(fā)生。情況的發(fā)生。 兩個(gè)復(fù)制叉匯合之后，復(fù)制停止。此時(shí)兩環(huán)狀染兩個(gè)復(fù)制叉匯合之后，復(fù)制停止。此時(shí)兩環(huán)狀染色體相互纏繞，成為連鎖體（色體相互纏繞，成為連鎖體（Catenane）。連鎖）。連鎖體的分離需要拓?fù)洚悩?gòu)酶體的分離需要拓?fù)洚悩?gòu)酶參與作用，從而使兩參與作用，從而使兩個(gè)連鎖體的閉環(huán)雙鏈個(gè)連鎖體的閉環(huán)雙鏈DNA彼此解開(kāi)，在細(xì)胞分裂彼此解開(kāi)，在細(xì)胞分裂時(shí)分別進(jìn)入子細(xì)胞時(shí)分別進(jìn)入子細(xì)胞 3.4.2 真核生物真核生物DNA復(fù)制的要點(diǎn)復(fù)制的要點(diǎn)3.4.2.1 起始起始真核染色體具有多個(gè)復(fù)制子，每個(gè)復(fù)制子都擁有真核染色體具有多個(gè)復(fù)制子

29、，每個(gè)復(fù)制子都擁有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)釀酒酵母的自主復(fù)制序列（釀酒酵母的自主復(fù)制序列（Autonomously replication sequence，ARS）可能相當(dāng)于復(fù)制的）可能相當(dāng)于復(fù)制的真正起點(diǎn)。真正起點(diǎn)。 ARS以不同的概率被使用以不同的概率被使用 不同不同ARS元件均具有元件均具有11bp的保守序列，富含的保守序列，富含AT堿堿基對(duì)，其臨近序列也富含基對(duì)，其臨近序列也富含AT，但不具有保守性。，但不具有保守性。 所有真核生物所有真核生物DNA復(fù)制的起始都需要蛋白質(zhì)復(fù)制的起始都需要蛋白質(zhì)ORC（Origin recognition complex），），ORC相對(duì)分相對(duì)

30、分子質(zhì)量約子質(zhì)量約400103，由，由6種蛋白質(zhì)組成。種蛋白質(zhì)組成。 在整個(gè)復(fù)制過(guò)程中，在整個(gè)復(fù)制過(guò)程中，ORC與與ARS的的11bp共同序共同序列及臨近序列結(jié)合，說(shuō)明復(fù)制的啟動(dòng)可能依賴(lài)其列及臨近序列結(jié)合，說(shuō)明復(fù)制的啟動(dòng)可能依賴(lài)其條件變化，而不是重新與起始點(diǎn)的結(jié)合。條件變化，而不是重新與起始點(diǎn)的結(jié)合。 執(zhí)照因子（執(zhí)照因子（Licensing factor）MCM2 MCM7的的存在則是復(fù)制起始所必須的。在復(fù)制前與染色體存在則是復(fù)制起始所必須的。在復(fù)制前與染色體物質(zhì)結(jié)合，但在復(fù)制后可能被快速降解，只有在物質(zhì)結(jié)合，但在復(fù)制后可能被快速降解，只有在下次細(xì)胞分裂后才能重新進(jìn)入細(xì)胞核下次細(xì)胞分裂后才能重

31、新進(jìn)入細(xì)胞核 真核生物真核生物DNA復(fù)制的模型：解旋酶在某一特定復(fù)復(fù)制的模型：解旋酶在某一特定復(fù)制原點(diǎn)上使雙螺旋解螺旋，具有啟動(dòng)功能的制原點(diǎn)上使雙螺旋解螺旋，具有啟動(dòng)功能的DNA聚合酶聚合酶在在2個(gè)復(fù)制叉上合成約個(gè)復(fù)制叉上合成約10個(gè)核苷酸的個(gè)核苷酸的RNA引物和隨后約引物和隨后約2030個(gè)核苷酸的個(gè)核苷酸的DNA，之后，之后，酶被其他酶被其他DNA聚合酶取代而進(jìn)行延伸反應(yīng)，這就聚合酶取代而進(jìn)行延伸反應(yīng)，這就是所謂的是所謂的“聚合酶開(kāi)關(guān)聚合酶開(kāi)關(guān)”（Polymerase switch）。在）。在DNA復(fù)制延伸的過(guò)程中，三種聚合復(fù)制延伸的過(guò)程中，三種聚合酶分別行使功能，前導(dǎo)鏈由具有高度前進(jìn)性能力酶分別行使功能，前導(dǎo)鏈由具有高度前進(jìn)性能力的的DNA聚合酶聚合酶繼續(xù)復(fù)制，此時(shí)繼續(xù)復(fù)制，此時(shí)DNA聚合酶聚合酶繼續(xù)繼續(xù)在后滯鏈上合成引物和一小段在后滯鏈上合成引物和一小段DNA岡崎片段，然岡崎片段，然后這段岡崎片段由第三種后這段岡崎片段由第三種DNA聚合酶（聚合酶（或或）完）完成合成。各種輔助蛋白組分如成合成。各種輔助蛋白組分如PCNA、RFA、RFC及其及其DNA解旋酶等其它蛋白可能參與轉(zhuǎn)變解旋酶等其它蛋白可能參與轉(zhuǎn)變DNA聚