CRISPR系統(tǒng)在植物研究中的應用

1、修豆北農林年裝大學植物保物研究方法論文題目：現(xiàn)代技術在植物病理學中的應用學院（系）：植物保護學院專業(yè)年級：植物病理學學生姓名：杜友偉學號：2016050129CRISPR/cas基因編輯系統(tǒng)在植物病理學中的應用摘要：基因組定點編輯是利用人工核酸酶，對復雜生物基因組特定位點快速而精確地進行遺傳改造的一項新技術。尤其是最近從細菌和古細菌的獲得性免疫防御反應中改造而來的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，因其簡單、廉價、高效以及通用的特性，目前已經廣泛地應用于植物、動物、微生物等各種生物體和細胞的基因功能和應用研究中。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的原理在于其攜帶的Cas9核酸酶RNA導向的dsDNA結合蛋白，

2、能夠在靶位點對雙鏈DNA進行定點切割，隨后引發(fā)的非同源末端連接或者同源重組修復，導致了靶位點DNA的缺失、插入、替換甚至染色體大片段重排。關鍵詞：基因，CRISPR,植物病理Abstract:Theclustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPRassociatedproteins(Cas9)systemisarecentlydevelopedgroundbreakingtechnologywhichenablestheproductionofhighlyspecificgenomemodificatio

3、nwithhighefficiencyandspecificity.TheCRISPR/Cas9systemisderivedfromtheadaptiveimmunitysysteminbacteriaandarchaeas,itusesCas9,aRNA-guidednuclease,tocreatedouble-strandbreaksinthegenomiclociofinterest.Therepairofbreaksthrougheithernon-homologousendjoiningorhomonlogousrecombinationleadstoinsertions,del

4、etions,replacementsorlargerchromosomalrearrangementsatthedesiredsitesofgenome.TheCRISPR/Cas9systemisfacile,highlyefficientandwidelyusedindiversecellsandorganisms,includingthespeciesthathavetraditionallybeenachallengeintheirgeneticmanipulations.Keywords:Gene,CRISPR,Plantdisease1 .CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)1.1

5、CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯技術，即一種由RNA介導的切割特異DNA片段的基因編輯系統(tǒng)引起了科學家們的注意。它依靠RNA引導序列與靶標DNA序列互補識別目標位點，僅需變化約20個核甘酸的序列就能靶向不同基因1-3。CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)源自于對細菌的免疫系統(tǒng)的研究，最早是日本科學家Nakata等4在研究大腸桿菌時發(fā)現(xiàn)的一種特定的重復序列，但當時他們還不清楚其具體功能。后來人們發(fā)現(xiàn)這種重復序列廣泛存在于細菌和古細菌中，隨后科學家正式將其定義為CRISPRo2005年，多個研究團隊發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列與噬菌體或質粒等外源DNA序列高

6、度同源5-7。2007年，Barrangou等8發(fā)現(xiàn)改變CRISPR中的重復序列能調節(jié)嗜熱鏈球菌(StreptococcusThermophilus)對噬菌體的抗性，證實CRISPR/Cas系統(tǒng)使細菌通過獲取噬菌體DNA片段形成“記憶”，從而使細菌獲得再次遭到同一噬菌體入侵時對其免疫的能力。1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)基本結構特征CRISPR/Cas系統(tǒng)主要由CRISPR序列元件與CAS基因家族蛋白組成。CRISPR序列元件是一類獨特的DNA重復序列家族，由一些高度保守的重復序列和間隔序列相間排列組成。而CAS基因家族蛋白是CRISPR序列附近一些高度保守的相關基因編碼的蛋白酶，具有核酸酶

7、和切口酶活性，能對DNA序列進行特異剪切和修復9。隨著基因組學的迅速發(fā)展，CRISPR基本結構也逐漸為人知曉。人們發(fā)現(xiàn)已測序的細菌基因組中約有40%包含CRISPR位點10。不同物種間CRISPR位點數(shù)目與重復序列白數(shù)目也有所不同11,但均包括4種序列(重復序列、間隔序列、Cas基因編碼序列、前導序列)。CRISPR中的重復序列是一組長度約2550個堿基對組成的短小回文序列，能形成發(fā)卡結構，重復次數(shù)最高可達數(shù)百次。間隔序列約為2672個堿基對，它的位置在2個重復序列之間12。CRISPR位點一般在細胞染色體上，也有的在質粒中10。在CRISPR位點附近還存在一系列CRISPR相關基因，Cas基

8、因編碼一類高度保守的核酸相關的蛋白13。此外，在Cas基因和CRISPR位點第一個重復片段之間存在著CRISP所導序列，該序列負責啟動CRISPR轉錄。traerRNALeadersequence圖1CRISPR基本結構Fig.1ThebasicstructureofCRISPR1.3CRISPR/Cas系統(tǒng)工作機理CRISPR系統(tǒng)是細菌為了對抗噬菌體和其他病毒的侵染而進化出的一套免疫系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)作用大致如下：噬菌體或其他病毒入侵后，宿主CRISPR系統(tǒng)識別外源DNA中特定的前間隔序列和前間隔序列鄰近基序。宿主將重復片段和這一段新的間隔序列整合進入CRISPR系統(tǒng)，插入在前導序列和原

9、先第一個重復序列之間8,14,形成“記憶”。加工前間隔序列的具體機制尚不明確。當同一噬菌體或病毒再次侵染時，CRISPR序列在前導序列引導下轉錄出前crRNA,前crRNA接著被加工成小crRNA。這些crRNA與反式激活crRNA形成一種嵌合分子，被稱為sgRNA(SingleguideRNA)。最后，在sgRNA的作用下，Cas蛋白復合體干擾入侵噬菌體DNA序列，從而使得宿主免受同一噬菌體的侵害8。CRISPR位點的間隔序列與細菌對特定噬菌體的抗性相關。圖2CRISPR系統(tǒng)作用機制Fig.2ThemechanismofCRISPRSystem2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的應用Jiang等1

10、52014年構建了一個靶向人工合成的無功能的GFP基因的Cas9/sgRNA載體，無功能的GFP基因經修飾后成為有功能的GFP基因，從而轉化成功的T1代植物中能觀察到葉片組織中的綠色熒光信號。對6個T1代單株后分離的42個T2代植株的分析表明，50%的T2代為單拷貝插入。這項研究還發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯是在遺傳發(fā)育早期時完成的，并且完成修飾的位點能穩(wěn)定遺傳至T2和T3代中。Brooks等16首次利用CRISPR/Cas系統(tǒng)建構2個sgRNAs來敲除番茄SlAGO7基因，通過根癌農桿菌法侵染番茄子葉獲得轉基因突變植株，對轉基因后代分析CRISPR/Cas在番茄中誘導的突變能夠穩(wěn)定遺

11、傳給后代，但不排除存在脫靶效應。Jiang等17利用水稻原生質體轉化Cas9/sgRNA建構靶向細菌性疫病的易感基因，OsSWEET14和OsSWEET11的啟動子區(qū)域，測序結果顯示靶標位點發(fā)生突變。有學者研究了2種水稻白葉枯病菌株(Xanthomonasoryzae)的CRISPR盒序列，發(fā)現(xiàn)其中1個菌系的CRISPR盒中雖然包含1段匹配Xop411基因組的間隔片段，但依舊對Xop411噬菌體敏感。深入研究發(fā)現(xiàn)Xop411中與X.oryzaeCRISPR間隔區(qū)段匹配的原初間隔區(qū)段發(fā)生突變，這與之前在嗜熱鏈球菌及其噬菌體中觀察到的結果相似18。3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的展望CRISPR/C

12、as9等新型基因編輯技術開啟了合成生物學時代19,20。包才CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)在內的新型生物技術有著廣闊的應用前景。雖然這些技術本身不是問題，但如何用好這些新技術將是社會各界需要清醒認識的重要問題。在植物育種方面最大的問題在于通過這些技術產生的植物和相關產物是否受轉基因相關法律約束。從科學角度來講，新型植物育種方法產生的植物同經典方法產生的植物可能是不可分辨的，且不會帶來更高的健康與環(huán)境風險，這為監(jiān)管工作帶來更大的挑戰(zhàn)21。此外，這些新型基因組編輯技術也引發(fā)了對專利等知識產權保護和社會倫理、法律等更多領域問題的思考22。參考文獻1 MahfouzMM,PiatekA,Stewar

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