第0章：吸光光度法

1、1第第1010章章 吸光光度法吸光光度法2化學(xué)分析化學(xué)分析：常量組分：常量組分(1%), Er 0.1%0.2% 依據(jù)化學(xué)反應(yīng)依據(jù)化學(xué)反應(yīng), 使用玻璃儀器使用玻璃儀器 化學(xué)分析與儀器分析方法比較化學(xué)分析與儀器分析方法比較儀器分析儀器分析：微量組分：微量組分(v vr r 9能級躍遷能級躍遷紫外紫外- -可見光譜屬于電子躍可見光譜屬于電子躍遷光譜。遷光譜。電子能級電子能級間躍遷的同時總伴間躍遷的同時總伴隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的隨有振動和轉(zhuǎn)動能級間的躍遷。即電子光譜中總包躍遷。即電子光譜中總包含有振動能級和轉(zhuǎn)動能級含有振動能級和轉(zhuǎn)動能級間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而間躍遷產(chǎn)生的若干譜線而呈現(xiàn)呈現(xiàn)寬譜帶寬譜帶

2、。10吸收光譜吸收光譜 Absorption Spectrum純純 電子能態(tài)電子能態(tài) 間躍遷間躍遷S2S1S0S3h E2E0E1E3S2S1S0h A h h h 分子內(nèi)電子躍遷分子內(nèi)電子躍遷帶狀光譜帶狀光譜 A111（1 1）轉(zhuǎn)動能級間的能量差）轉(zhuǎn)動能級間的能量差EEr r：0.0050.0050.050eV0.050eV，躍遷，躍遷產(chǎn)生吸收光譜位于遠(yuǎn)紅外區(qū)。遠(yuǎn)紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜；產(chǎn)生吸收光譜位于遠(yuǎn)紅外區(qū)。遠(yuǎn)紅外光譜或分子轉(zhuǎn)動光譜；1（2 2）振動能級的能量差）振動能級的能量差E Ev v約為：約為：0.050.05eVeV，躍遷產(chǎn)，躍遷產(chǎn)生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜

3、；生的吸收光譜位于紅外區(qū)，紅外光譜或分子振動光譜；1（3 3）電子能級的能量差）電子能級的能量差EEe e較大較大1 120eV20eV。電子躍遷產(chǎn)生。電子躍遷產(chǎn)生的吸收光譜在紫外的吸收光譜在紫外可見光區(qū)，紫外可見光區(qū)，紫外可見光譜或分子的電可見光譜或分子的電子光譜子光譜討論：討論：121 （4 4）吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級）吸收光譜的波長分布是由產(chǎn)生譜帶的躍遷能級間的能量差所決定，反映了分子內(nèi)部能級分布狀況，間的能量差所決定，反映了分子內(nèi)部能級分布狀況，是物質(zhì)定性的依據(jù)。是物質(zhì)定性的依據(jù)。1 （5 5）吸收譜帶強(qiáng)度與分子偶極矩變化、躍遷幾率有吸收譜帶強(qiáng)度與分子偶極矩變化、躍遷

4、幾率有關(guān)，也提供分子結(jié)構(gòu)的信息。通常將在最大吸收波長關(guān)，也提供分子結(jié)構(gòu)的信息。通常將在最大吸收波長處測得的摩爾吸光系數(shù)處測得的摩爾吸光系數(shù)maxmax也作為定性的依據(jù)。也作為定性的依據(jù)。不同不同物質(zhì)的物質(zhì)的maxmax有時可能相同，但有時可能相同，但maxmax不一定相同不一定相同；1 （6 6）吸收譜帶強(qiáng)度與該物質(zhì)分子吸收的光子數(shù)成正）吸收譜帶強(qiáng)度與該物質(zhì)分子吸收的光子數(shù)成正比，定量分析的依據(jù)。比，定量分析的依據(jù)。13 物質(zhì)對光的選擇性吸收及吸收曲線物質(zhì)對光的選擇性吸收及吸收曲線M + h M *M + 熱熱M + 熒光或磷光熒光或磷光基態(tài)基態(tài) 激發(fā)態(tài)激發(fā)態(tài)E1 （E） E2 E = E2

5、- E1 = h 量子化量子化 ；選擇性吸收；選擇性吸收; ; 分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長分子結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性使其對不同波長光的吸收程度不同；光的吸收程度不同； 用不同波長的單色光照射，測吸光用不同波長的單色光照射，測吸光度度 吸收曲線與最大吸收波長吸收曲線與最大吸收波長 maxmax； 光的互補光的互補：藍(lán)：藍(lán) 黃黃14 若兩種不同顏色的單色光按一定的強(qiáng)度比若兩種不同顏色的單色光按一定的強(qiáng)度比例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互例混合得到白光，那么就稱這兩種單色光為互補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。補色光，這種現(xiàn)象稱為光的互補。藍(lán)藍(lán)黃黃紫紅紫紅綠綠紫紫黃綠黃綠綠藍(lán)綠藍(lán)橙橙紅紅藍(lán)綠藍(lán)綠15

6、/nm顏色顏色互補光互補光400-450紫黃綠450-480藍(lán)藍(lán)黃黃480-490綠藍(lán)綠藍(lán)橙橙490-500藍(lán)綠藍(lán)綠紅紅500-560綠綠紅紫紅紫560-580黃綠黃綠紫紫580-610黃黃藍(lán)藍(lán)610-650橙橙綠藍(lán)綠藍(lán)650-760紅紅藍(lán)綠藍(lán)綠不同顏色的可見光波長及其互補光不同顏色的可見光波長及其互補光16吸收曲線的討論：吸收曲線的討論： （1）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不）同一種物質(zhì)對不同波長光的吸光度不同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為同。吸光度最大處對應(yīng)的波長稱為最大吸收波長最大吸收波長max （2）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線）不同濃度的同一種物質(zhì)，其吸收曲線形狀相似形狀相似ma

7、x不變。而對于不同物質(zhì)，它們的不變。而對于不同物質(zhì)，它們的吸收曲線形狀和吸收曲線形狀和max則不同。則不同。 （3）吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)）吸收曲線可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并作為物質(zhì)定性分析的依據(jù)之一。之一。 （4）不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度不同濃度的同一種物質(zhì)，在某一定波長下吸光度 A 有差異，在有差異，在max處吸光度處吸光度A 的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。的差異最大。此特性可作為物質(zhì)定量分析的依據(jù)。 （5）在在max處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸處吸光度隨濃度變化的幅度最大，所以測定最靈敏。吸收曲線是定量

8、分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。收曲線是定量分析中選擇入射光波長的重要依據(jù)。定性、定量基礎(chǔ)定性、定量基礎(chǔ)17定性分析與定量分析的基礎(chǔ)定性分析與定量分析的基礎(chǔ)定性分析基礎(chǔ)定性分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)定量分析基礎(chǔ)物質(zhì)對光的選擇物質(zhì)對光的選擇吸收吸收ABA )(maxA)(maxB在一定的實驗條在一定的實驗條件下，物質(zhì)對光件下，物質(zhì)對光的吸收與物質(zhì)的的吸收與物質(zhì)的濃度成正比。濃度成正比。A C增增大大1810.1.2 10.1.2 光吸收的基本定律光吸收的基本定律 1.1.朗伯朗伯比耳定律比耳定律 布格布格(Bouguer(Bouguer) )和朗伯和朗伯(Lambert)(Lambert)先后于先后于

9、17291729年和年和17601760年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。年闡明了光的吸收程度和吸收層厚度的關(guān)系。A Ab b 18521852年比耳年比耳(Beer)(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物又提出了光的吸收程度和吸收物濃度之間也具有類似的關(guān)系。濃度之間也具有類似的關(guān)系。A A c c 二者的結(jié)合稱為朗伯二者的結(jié)合稱為朗伯比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：比耳定律，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為： 19朗伯朗伯比耳定律數(shù)學(xué)表達(dá)式比耳定律數(shù)學(xué)表達(dá)式 A Alglg（I I0 0/ /I It t)= )= b cb c 式中式中A A：吸光度；描述溶液對光的吸收程度；：吸光度；描述溶液對光的吸收程

10、度； b b：液層厚度：液層厚度( (光程長度光程長度) )，通常以，通常以cmcm為單位；為單位； c c：溶液的摩爾濃度，單位：溶液的摩爾濃度，單位molmolL L； ：摩爾吸光系數(shù)，單位：摩爾吸光系數(shù)，單位L Lmolmolcmcm； 或或: : A Alglg（I I0 0/ /I It t)= )= a b ca b c c c：溶液的濃度，單位：溶液的濃度，單位g gL L a a：吸光系數(shù)，單位：吸光系數(shù)，單位L Lg gcmcm a a與與的關(guān)系為：的關(guān)系為： a a = =/ /M M （M M為摩爾質(zhì)量）為摩爾質(zhì)量） 20吸光度與光程的關(guān)系吸光度與光程的關(guān)系 A = bc

11、 光源光源檢測器檢測器0.00吸光度吸光度檢測器檢測器b樣品樣品光源光源0.22吸光度吸光度光源光源檢測器檢測器0.44吸光度吸光度b樣品樣品b樣品樣品21吸光度與濃度的關(guān)系吸光度與濃度的關(guān)系 A = bc 吸光度吸光度0.00光源光源檢測器檢測器 吸光度吸光度0.22光源光源檢測器檢測器b 吸光度吸光度0.42光源光源檢測器檢測器b22透光度透光度( (透光率透光率)T)T透透光光度度T : 描述入射光透過溶液的程度描述入射光透過溶液的程度: T = I t / I0吸光度吸光度A與透光度與透光度T的關(guān)系的關(guān)系: A lg T 朗伯朗伯比耳定律是吸光光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的比耳定律是吸光

12、光度法的理論基礎(chǔ)和定量測定的依據(jù)。應(yīng)用于各種光度法的吸收測量；依據(jù)。應(yīng)用于各種光度法的吸收測量； 摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)在數(shù)值上等于濃度為在數(shù)值上等于濃度為1 mol/L、液層厚度、液層厚度為為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度；時該溶液在某一波長下的吸光度； 吸光系數(shù)吸光系數(shù)a(Lg-1cm-1）相當(dāng)于濃度為）相當(dāng)于濃度為1 g/L、液層厚度、液層厚度為為1cm時該溶液在某一波長下的吸光度。時該溶液在某一波長下的吸光度。232.2.摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)的討論的討論 （1 1）吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的吸收物質(zhì)在一定波長和溶劑條件下的特征常數(shù)特征常數(shù)； （2 2）不隨濃度不隨濃度c

13、 c和光程長度和光程長度b b的改變而改變的改變而改變。在溫度和波長在溫度和波長等條件一定時，等條件一定時，僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物僅與吸收物質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)，與待測物濃度無關(guān)；濃度無關(guān)； （3 3）可作為可作為定性鑒定的參數(shù)定性鑒定的參數(shù)； （4）同一吸收物質(zhì)在不同波長下的同一吸收物質(zhì)在不同波長下的值是不同的。在最大值是不同的。在最大吸收波長吸收波長max處的摩爾吸光系數(shù)，常以處的摩爾吸光系數(shù)，常以max表示。表示。max表明了表明了該該吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力吸收物質(zhì)最大限度的吸光能力，也反映了光度法測定該物也反映了光度法測定該物質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度。質(zhì)可能達(dá)到的最大靈敏度

14、。 24 （5 5）max越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測定越大表明該物質(zhì)的吸光能力越強(qiáng)，用光度法測定該物質(zhì)的靈敏度越高。該物質(zhì)的靈敏度越高。105：超高靈敏；：超高靈敏； =(610）104 ：高靈敏；：高靈敏； 2104 ：不靈敏。：不靈敏。 （6）在數(shù)值上等于濃度為在數(shù)值上等于濃度為1mol/L、液層厚度為、液層厚度為1cm時該時該溶液在某一波長下的吸光度。溶液在某一波長下的吸光度。摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)的討論的討論253.3.偏離朗伯偏離朗伯比耳定律的原因比耳定律的原因 標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃標(biāo)準(zhǔn)曲線法測定未知溶液的濃度時，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)生彎曲度時，發(fā)現(xiàn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線常發(fā)

15、生彎曲（尤其當(dāng)溶液濃度較高時），這種（尤其當(dāng)溶液濃度較高時），這種現(xiàn)象稱為對朗伯現(xiàn)象稱為對朗伯比耳定律的偏離。比耳定律的偏離。 引起這種偏離的因素（兩大類）：引起這種偏離的因素（兩大類）： （1 1）物理性因素，即儀器的非理想引起的；物理性因素，即儀器的非理想引起的； （2 2）化學(xué)性因素?；瘜W(xué)性因素。26（1）物理性因素物理性因素 難以獲得真正的純單色光難以獲得真正的純單色光。 朗朗比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。比耳定律的前提條件之一是入射光為單色光。 分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)分光光度計只能獲得近乎單色的狹窄光帶。復(fù)合光可導(dǎo)致對朗伯致對朗伯比耳定律的正或負(fù)偏

16、離。比耳定律的正或負(fù)偏離。 非單色光、雜散光、非平行入射非單色光、雜散光、非平行入射光都會引起對朗伯光都會引起對朗伯比耳定律的偏離，比耳定律的偏離，最主要的是非單色光作為入射光引起最主要的是非單色光作為入射光引起的偏離。的偏離。 27非單色光作為入射光引起的偏離非單色光作為入射光引起的偏離 假設(shè)由波長為假設(shè)由波長為1和和2的兩單色光的兩單色光組成的入射光通過濃度為組成的入射光通過濃度為c的溶液，則：的溶液，則： A 1lg（o1 /t1 ）1bc A 2lg(o2 /t2 ）2bc故：故：cbcbIIII22111O2tOt10;10式中：式中：o1、o2分別為分別為1、2 的入射光強(qiáng)度；的入

17、射光強(qiáng)度； t1、t2分別為分別為1、2 的透射光強(qiáng)度；的透射光強(qiáng)度； 1、2分別為分別為1、2的摩爾吸光系數(shù)；的摩爾吸光系數(shù)；因?qū)嶋H上只能測總吸光度因?qū)嶋H上只能測總吸光度A總總，并不能分別測得，并不能分別測得A1和和A2，故，故28 因?qū)嶋H上只能測總吸光度因?qū)嶋H上只能測總吸光度A A總總，并不能分別測得，并不能分別測得A A1 1和和A A2 2，故：，故： A總總 lg（o總總/t總總 ) lg(Io1+o2)/(t1+t2） lg(Io1+o2)/(o110-1bc +o210-2bc ）令：令： 1-2 ；設(shè)：設(shè)： o1 o2 A總總 lg(2Io1)/t1(110 - bc ） A

18、1 + lg2 - lg(110 - bc ) 討論討論: :29討論討論: : A總總 =A1 + lg2 - lg(110 bc ) (1) = 0； 即：即： 1= 2 = 則：則： A總 lg（o/t） bc(2) 0 若若 0 ；即；即 20, lg(110 bc )值隨值隨c c值增大而增大，則標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離值增大而增大，則標(biāo)準(zhǔn)曲線偏離直線向直線向c c 軸彎曲，即負(fù)偏離；反之，則向軸彎曲，即負(fù)偏離；反之，則向A A 軸彎曲，即正偏軸彎曲，即正偏離。離。30討論討論: : A總總 =A1 + lg2 - lg(110 bc ) (3) 很小時，即很小時，即12： 可近似認(rèn)為是單色光。

19、在低濃度范圍內(nèi)，不發(fā)生偏離。若可近似認(rèn)為是單色光。在低濃度范圍內(nèi)，不發(fā)生偏離。若濃度較高，即使?jié)舛容^高，即使 很小，很小， A總總 1 ，且隨著且隨著c c值增大值增大， A A總總 與與A A 1 1的差異愈大，在圖上則表現(xiàn)為的差異愈大，在圖上則表現(xiàn)為A Ac c曲線上部曲線上部( (高濃度區(qū)高濃度區(qū)) )彎曲愈嚴(yán)重。彎曲愈嚴(yán)重。故朗伯故朗伯比耳定律只適用于稀溶液比耳定律只適用于稀溶液。 (4) 為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色為克服非單色光引起的偏離，首先應(yīng)選擇比較好的單色器。此外還應(yīng)將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波長且吸器。此外還應(yīng)將入射波長選定在待測物質(zhì)的最大吸收波

20、長且吸收曲線較平坦處。收曲線較平坦處。31(2) (2) 化學(xué)性因素化學(xué)性因素 朗朗比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互比耳定律的假定：所有的吸光質(zhì)點之間不發(fā)生相互作用；作用；假定只有在稀溶液假定只有在稀溶液(c10 2 mol/L 時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合時，吸光質(zhì)點間可能發(fā)生締合等相互作用，直接影響了對光的吸收。等相互作用，直接影響了對光的吸收。 故：朗伯故：朗伯比耳定律只適用于稀溶液比耳定律只適用于稀溶液。 溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等溶液中存在著離解、聚合、互變異構(gòu)、配合物的形成等化學(xué)平衡時。使吸光質(zhì)點的濃度發(fā)生變化，影響吸光度?；瘜W(xué)平衡時。使吸光質(zhì)點的濃

21、度發(fā)生變化，影響吸光度。 例：例： 鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡：鉻酸鹽或重鉻酸鹽溶液中存在下列平衡： CrO42- 2H = Cr2O72- H2O 溶液中溶液中CrOCrO4 42-2-、 CrCr2 2O O7 72-2-的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相的顏色不同，吸光性質(zhì)也不相同。故此時溶液同。故此時溶液pH pH 對測定有重要影響。對測定有重要影響。32偏離朗伯偏離朗伯-比爾定律的原因比爾定律的原因1. 非單色光引起的偏離非單色光引起的偏離 2. 介質(zhì)不均勻引起的偏離介質(zhì)不均勻引起的偏離3. 由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏由于溶液本身的化學(xué)反應(yīng)引起的偏離離 解離、絡(luò)合反應(yīng)、其他反應(yīng)解

22、離、絡(luò)合反應(yīng)、其他反應(yīng)4. 顯色反應(yīng)的干擾顯色反應(yīng)的干擾33朗伯朗伯-比爾定律的適用條件比爾定律的適用條件1. 單色光單色光 應(yīng)選用應(yīng)選用 max處或肩峰處測定處或肩峰處測定2. 吸光質(zhì)點形式不變吸光質(zhì)點形式不變 離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系離解、絡(luò)合、締合會破壞線性關(guān)系 應(yīng)控制條件應(yīng)控制條件(酸度、濃度、介質(zhì)等酸度、濃度、介質(zhì)等)3. 稀溶液稀溶液 濃度增大，分子之間作用增強(qiáng)濃度增大，分子之間作用增強(qiáng)34吸光度的加和性與吸光度的測量吸光度的加和性與吸光度的測量 A = A1 + A2 + +An 用參比溶液調(diào)用參比溶液調(diào)T=100%（A=0），再測樣品溶），再測樣品溶液的吸光度，即消除了吸

23、收池對光的吸收、反射，液的吸光度，即消除了吸收池對光的吸收、反射，溶劑、試劑對光的吸收等溶劑、試劑對光的吸收等。3510.2 10.2 紫外紫外可見分光光度計可見分光光度計363710.2.110.2.1基本組成基本組成光源單色器樣品室檢測器顯示1. 1. 光源光源 在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。有足夠的輻射強(qiáng)度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。 可見光區(qū)：鎢燈作可見光區(qū)：鎢燈作為光源，其輻射波長范為光源，其輻射波長范圍在圍在3203202500 nm2500 nm。 紫外區(qū)：氫、氘燈。

24、紫外區(qū)：氫、氘燈。發(fā)射發(fā)射185185400 nm400 nm的連續(xù)的連續(xù)光譜。光譜。38 2.2.單色器單色器 將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任將光源發(fā)射的復(fù)合光分解成單色光并可從中選出一任波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。波長單色光的光學(xué)系統(tǒng)。 入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器；入射狹縫：光源的光由此進(jìn)入單色器； 準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；準(zhǔn)光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束； 色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；色散元件：將復(fù)合光分解成單色光；棱鏡或光柵棱鏡或光柵； 聚焦裝置：透鏡或聚焦裝置：透鏡或凹面反射鏡，將分光凹面反射鏡，將分光后所得單色光聚焦至后所得單色光聚

25、焦至出射狹縫；出射狹縫； 出射狹縫。出射狹縫。39棱鏡：棱鏡：依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同依據(jù)不同波長光通過棱鏡時折射率不同單色器單色器入射狹縫入射狹縫準(zhǔn)直透鏡準(zhǔn)直透鏡棱鏡棱鏡聚焦透鏡聚焦透鏡出射狹縫出射狹縫白光白光紅紅紫紫1 12 2800 600 50040040光柵：光柵：在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的在鍍鋁的玻璃表面刻有數(shù)量很大的等寬度等寬度等間距等間距條痕條痕(600、1200、2400條條/mm )。M1M2出出射射狹狹縫縫光屏光屏透透鏡鏡平面透平面透射光柵射光柵光柵衍射示意圖光柵衍射示意圖原理原理：利用光通過光柵時利用光通過光柵時發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而發(fā)生衍射和干涉現(xiàn)象而分光

26、分光.413. 3. 樣品室樣品室 樣品室放置各種類型的吸收池樣品室放置各種類型的吸收池（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸（比色皿）和相應(yīng)的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池兩種。收池主要有石英池和玻璃池兩種。在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一般用玻璃池。般用玻璃池。4. 4. 檢測器檢測器 利用光電效應(yīng)將透過吸收池的利用光電效應(yīng)將透過吸收池的光信號變成可測的電信號，常用的光信號變成可測的電信號，常用的有光電池、光電管或光電倍增管。有光電池、光電管或光電倍增管。5. 5. 結(jié)果顯示記錄系統(tǒng)結(jié)果顯示記錄系統(tǒng) 檢流計、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行檢流計、數(shù)字顯示、微機(jī)進(jìn)行儀器自動控制

27、和結(jié)果處理儀器自動控制和結(jié)果處理42光電管光電管紅敏管紅敏管 625-1000 nm藍(lán)敏管藍(lán)敏管 200-625 nmNi環(huán)（片）環(huán)（片）堿金屬堿金屬光敏陰極光敏陰極h 43光電倍增管光電倍增管待掃描160-700 nm1個光電子可產(chǎn)生個光電子可產(chǎn)生106107個電子個電子4410.2.210.2.2分光光度計的類型分光光度計的類型1.1.單光束單光束 簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高的穩(wěn)定性。的穩(wěn)定性。2.2.雙光束雙光束 自動記

28、錄，快速全波自動記錄，快速全波段掃描?？上庠床环€(wěn)段掃描。可消除光源不穩(wěn)定、檢測器靈敏度變化等定、檢測器靈敏度變化等因素的影響，特別適合于因素的影響，特別適合于結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價結(jié)構(gòu)分析。儀器復(fù)雜，價格較高。格較高。453.3.雙波長雙波長 將不同波長的兩束單色光將不同波長的兩束單色光( (1 1、2 2) ) 快束交替通過同快束交替通過同一吸收池而后到達(dá)檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池。一吸收池而后到達(dá)檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池。 = =1 12nm2nm。兩波長同時掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。兩波長同時掃描即可獲得導(dǎo)數(shù)光譜。46多通道儀器多通道儀器（Multichannel Inst

29、ruments） 光電二極管陣列光電二極管陣列(通常具有通常具有316個硅二極管個硅二極管) photodiode arrays (PDAs) 同時測量同時測量200820nm范圍內(nèi)的整個光譜范圍內(nèi)的整個光譜, 比單個比單個檢測器快檢測器快316倍倍,信噪比增加信噪比增加 316 1/2 倍倍. 其他類型分光光度計其他類型分光光度計將光度計放入樣品中將光度計放入樣品中, , 原位測量原位測量. . 對環(huán)境和對環(huán)境和過程監(jiān)測非常重要過程監(jiān)測非常重要. .纖維光度計纖維光度計47鍍鋁反射鏡鍍鋁反射鏡纖維光度計示意圖纖維光度計示意圖48纖維光度計纖維光度計4910.3 10.3 顯色反應(yīng)及其影響因素

30、顯色反應(yīng)及其影響因素10.3.1顯色反應(yīng)和顯色劑顯色反應(yīng)和顯色劑1.1.選擇顯色反應(yīng)時，應(yīng)考慮的因素選擇顯色反應(yīng)時，應(yīng)考慮的因素 靈敏度高靈敏度高，選擇性好選擇性好； 有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式；有色化合物的組成恒定，符合一定的化學(xué)式； 生成物穩(wěn)定生成物穩(wěn)定； 顯色劑在測定波長處無明顯吸收顯色劑在測定波長處無明顯吸收，兩種有色物最大吸收兩種有色物最大吸收波長之差波長之差要求要求 60nm, 60nm,對照性好對照性好。 50： ：助色團(tuán)助色團(tuán)NH2，OH，X （孤對電子）（孤對電子）neO生色團(tuán)生色團(tuán)：NN，NO，OC=S,N （共軛雙鍵）（共軛雙鍵）e無機(jī)顯色劑無機(jī)顯色劑: SC

31、N- Fe(SCN)2+ H2O2 TiOH2O22+有機(jī)顯色劑有機(jī)顯色劑:2.2.顯色劑顯色劑51有機(jī)顯色劑有機(jī)顯色劑CH3CCCH3 HON NOH NNOHCOOHSO3HOO型：型：NNNOH OHON型型：PARNH NHNSNS型型：雙硫腙雙硫腙NN型：型：丁二丁二酮肟酮肟鄰二鄰二氮菲氮菲磺基水楊酸磺基水楊酸5210.3.2 10.3.2 影響顯色反應(yīng)的因素影響顯色反應(yīng)的因素1.1.顯色劑用量顯色劑用量 吸光度吸光度A A與顯色劑用量與顯色劑用量C CR R的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的幾種的關(guān)系會出現(xiàn)如圖所示的幾種情況。選擇曲線變化平坦處。情況。選擇曲線變化平坦處。2.2.溶液的酸度溶液

32、的酸度3.3.顯色反應(yīng)時間顯色反應(yīng)時間4.4.顯色反應(yīng)溫度顯色反應(yīng)溫度5.5.溶劑溶劑 一般盡量采用水相測定一般盡量采用水相測定6.6.干擾離子的影響干擾離子的影響53c(R)c(R)c(R) 顯色劑用量顯色劑用量（c(M)、pH一定）一定）Mo(SCN)32+ 淺紅淺紅Mo(SCN)5 橙紅橙紅Mo(SCN)6- 淺紅淺紅Fe(SCN)n3-n54 顯色反應(yīng)酸度顯色反應(yīng)酸度（c(M)、 c(R)一定）一定）pH1pH2.2.控制適宜的吸光度（讀數(shù)范圍）控制適宜的吸光度（讀數(shù)范圍）60控制適宜的吸光度（讀數(shù)范圍）控制適宜的吸光度（讀數(shù)范圍） 不同的透光度讀數(shù)，產(chǎn)生的誤差大小不同：不同的透光度讀

33、數(shù)，產(chǎn)生的誤差大小不同： A=lgT=bc微分：微分：dA=dlgT0.434dlnT = - 0.434T -1 dT =b dc兩式相除得：兩式相除得： dA/A= （ 0.434 / TlgT ）dT =dc/c 以有限值表示可得：以有限值表示可得： A/A = c/c =（0.434/TlgT）T 濃度測量值的相對誤差（濃度測量值的相對誤差（c c/ /c c）不僅與儀器的透光度）不僅與儀器的透光度誤差誤差T T 有關(guān)，而且與其透光度讀數(shù)有關(guān)，而且與其透光度讀數(shù)T T 的值也有關(guān)。的值也有關(guān)。 是否存在最佳讀數(shù)范圍？何值時誤差最??？是否存在最佳讀數(shù)范圍？何值時誤差最??？ 61最佳讀數(shù)范

34、圍與最佳值最佳讀數(shù)范圍與最佳值 設(shè)：設(shè)：T =1%，則可繪出溶液濃度，則可繪出溶液濃度相對誤差相對誤差c/c與其透光度與其透光度T 的關(guān)系曲線的關(guān)系曲線。如圖所示：。如圖所示： 當(dāng)：當(dāng)：T =1%，T 在在15%65%之之間時，濃度相對誤差較小，最佳讀數(shù)間時，濃度相對誤差較小，最佳讀數(shù)范圍。范圍。 用儀器測定時應(yīng)盡量使溶液透光度值在用儀器測定時應(yīng)盡量使溶液透光度值在T %=1565% (吸光度吸光度 A =0.800.20)。 可求出濃度相對誤差最小時的透光度可求出濃度相對誤差最小時的透光度Tmin為：為： Tmin36.8%, Amin0.4346210.5 10.5 吸光光度法吸光光度法1

35、0.5.1 10.5.1 普通吸光光度法普通吸光光度法1.1.單組分的測定單組分的測定 目視比色法目視比色法 通常采用通常采用 A-C 標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量測定。2.2.多組分的同時測定多組分的同時測定 若各組分的吸收曲線互不重疊，則可若各組分的吸收曲線互不重疊，則可在各自最大吸收波長處分別進(jìn)行測定。這在各自最大吸收波長處分別進(jìn)行測定。這本質(zhì)上與單組分測定沒有區(qū)別。本質(zhì)上與單組分測定沒有區(qū)別。 若各組分的吸收曲線互有重疊，則若各組分的吸收曲線互有重疊，則可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組可根據(jù)吸光度的加合性求解聯(lián)立方程組得出各組分的含量。得出各組分的含量。 A1= a1bca b

36、1bcb A2= a2bca b2bcb 目視比色法目視比色法未知樣品未知樣品特點特點利用自然光利用自然光比較吸收光的互補色光比較吸收光的互補色光準(zhǔn)確度低（半定量）準(zhǔn)確度低（半定量）不可分辨多組分不可分辨多組分方法簡便，靈敏度高方法簡便，靈敏度高標(biāo)準(zhǔn)系列標(biāo)準(zhǔn)系列64 光電比光電比色法色法通過濾光片得一窄范圍的光通過濾光片得一窄范圍的光(幾十幾十nm)光電比色計結(jié)構(gòu)示意圖光電比色計結(jié)構(gòu)示意圖靈敏度和準(zhǔn)靈敏度和準(zhǔn)確度較差確度較差6510.5.210.5.2、示差吸光光度法（示差法）、示差吸光光度法（示差法） 普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當(dāng)待測組分含普通分光光度法一般只適于測定微量組分，當(dāng)

37、待測組分含量較高時，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。即提高入射量較高時，將產(chǎn)生較大的誤差。需采用示差法。即提高入射光強(qiáng)度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比光強(qiáng)度，并采用濃度稍低于待測溶液濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作參比溶液。溶液。 設(shè)：待測溶液濃度為設(shè)：待測溶液濃度為c cx x，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為c cs s( (c cs s c cx x) )。則：。則： Ax= b cx As = b cs x s =b(cx cs ）=bc 測得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸測得的吸光度相當(dāng)于普通法中待測溶液與標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度之差光度之差。 示差法測得的吸光度與示差法測得的吸

38、光度與c呈直線關(guān)系呈直線關(guān)系,由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查由標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的得相應(yīng)的c值，則待測溶液濃度值，則待測溶液濃度cx ：cx = cs + c 66示差法標(biāo)尺擴(kuò)展原理：示差法標(biāo)尺擴(kuò)展原理： 普通法：普通法： cs的的T=10%；cx的的T=5% 示差法：示差法： cs 做參比，調(diào)做參比，調(diào)T=100% 則：則： cx的的T=50% ；標(biāo)尺擴(kuò)展；標(biāo)尺擴(kuò)展10倍倍67例題例題已知已知 dT = 0.01, 樣品樣品Tx = 2.00 %, 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) Ts = 10.0 %示差法示差法sxrIIT %0 .200 .1000. 2xxTxcTTdcdxln02. 0lg02. 0434. 001.

39、0%8 .12xrTxcTTdcdxln常規(guī)法誤差常規(guī)法誤差示差法誤差示差法誤差02. 0lg20. 0434. 001. 0%28. 1已知已知 dT = 0.01, 樣品樣品Tx = 2.00 %, 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn) Ts = 5.00 %0IITxr%0 .4000. 500. 2xrTxcTTdcdxln%64. 0sxTT6810.5.310.5.3、雙波長分光光度法、雙波長分光光度法 不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色不需空白溶液作參比；但需要兩個單色器獲得兩束單色光光( (1 1和和2 2) )；以參比波長；以參比波長1 1處的吸光度處的吸光度A A11作為參比，來作為參比

40、，來消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時顯示出消除干擾。在分析渾濁或背景吸收較大的復(fù)雜試樣時顯示出很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單很大的優(yōu)越性。靈敏度、選擇性、測量精密度等方面都比單波長法有所提高。波長法有所提高。 A A A22 A A11 ( (22 11) )b cb c 兩波長處測得的吸光度差值兩波長處測得的吸光度差值A(chǔ)與待測組分濃度成正比與待測組分濃度成正比。11和和22分別表示待測組分在分別表示待測組分在1 1和和2 2處的摩爾吸光系處的摩爾吸光系數(shù)。數(shù)。69關(guān)鍵問題關(guān)鍵問題: : 測量波長測量波長2 2和參比波長和參比波長1 1的選擇與組合的選擇與組

41、合 以兩組分以兩組分x x和和y y的雙波長法測定為例：的雙波長法測定為例：設(shè)：設(shè)：x x為待測組分，為待測組分，y y為干擾組分，二者的吸光度差分別為為干擾組分，二者的吸光度差分別為: : Ax和和Ay，則該體系的總吸光度差，則該體系的總吸光度差A(yù)x+y為：為： Ax+y = A x + A y 如何選擇波長如何選擇波長1 、2有一定的要求。有一定的要求。70選擇波長組合選擇波長組合1 1 、2 2的基本要求是：的基本要求是： 選定的波長選定的波長1 1和和2 2處干擾組分應(yīng)具有相同吸光度，處干擾組分應(yīng)具有相同吸光度，即：即： Ay = y = A y y22 A y y11 = 0 = 0

42、故：故： Ax+y = x+y = A x=(x=(x x22x x11) )bcbcx x此時：測得的吸光度差此時：測得的吸光度差A(yù)只與待測組分只與待測組分x x的濃度呈線性關(guān)系的濃度呈線性關(guān)系，而與干擾組分，而與干擾組分y y無關(guān)。若無關(guān)。若x x為干擾組分，則也可用同樣的方為干擾組分，則也可用同樣的方法測定法測定y y組分。組分。 在選定的兩個波長在選定的兩個波長1 1和和2 2處待測組分的吸光度應(yīng)具有處待測組分的吸光度應(yīng)具有足夠大的差值。足夠大的差值。 可采用作圖法選擇符合上可采用作圖法選擇符合上述兩個條件的波長組合述兩個條件的波長組合。7110.5.410.5.4、導(dǎo)數(shù)光度分析法、導(dǎo)

43、數(shù)光度分析法 導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時測定、渾濁樣品分析、消導(dǎo)數(shù)分光光度法在多組分同時測定、渾濁樣品分析、消除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等除背景干擾、加強(qiáng)光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜光譜的辨析等方面，顯示了很大的優(yōu)越性。方面，顯示了很大的優(yōu)越性。 利用吸光度利用吸光度( (或透光度或透光度) )對波長的導(dǎo)數(shù)曲線來進(jìn)行分析：對波長的導(dǎo)數(shù)曲線來進(jìn)行分析： 0 0 e e-bcbc假定入射光強(qiáng)度假定入射光強(qiáng)度0 0 在整個波長范圍內(nèi)保持恒定：在整個波長范圍內(nèi)保持恒定： d dI I 0 0 /d /d0 0則則：d dI I/d/d0 0 bcbc e e -bc-bc d d/d/

44、d bcbc d d/d/d 72 d dI I/d/d bcbc d d/d/d 一階導(dǎo)數(shù)信號與試樣濃度呈一階導(dǎo)數(shù)信號與試樣濃度呈線性關(guān)系；線性關(guān)系； 測定靈敏度依賴于摩爾吸光測定靈敏度依賴于摩爾吸光系數(shù)對波長的變化率系數(shù)對波長的變化率d d/d/d。吸。吸收曲線的拐點處收曲線的拐點處d d/d/d最大，故最大，故其靈敏度最高其靈敏度最高( (見圖）。見圖）。 同理可以導(dǎo)出其二階和三階導(dǎo)同理可以導(dǎo)出其二階和三階導(dǎo)數(shù)光譜（略）數(shù)光譜（略） 7310.6 吸光光度分析法的應(yīng)用吸光光度分析法的應(yīng)用1. 單一組分測定單一組分測定1) 金屬離子金屬離子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟丁二酮肟, C

45、o-鈷試劑鈷試劑2) 磷的測定磷的測定: DNA中含中含P9.2%, RNA中含中含P9.5%, 可得核酸量可得核酸量.H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3=(NH4)3PO412MoO3+12NH4NO3+12H2O磷鉬黃磷鉬黃( 小小)磷鉬磷鉬(V)藍(lán)藍(lán)( 大大)Sn2+743) 蛋白質(zhì)測定蛋白質(zhì)測定溴甲酚綠、考馬司亮藍(lán)等溴甲酚綠、考馬司亮藍(lán)等4) 氨基酸測定氨基酸測定茚三酮茚三酮(紫色化合物紫色化合物)5) 水質(zhì)檢測水質(zhì)檢測: NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、SO42-、Hg2+-6) 藥物含量測定藥物含量測定比吸光系數(shù)定量；荷移比吸光系數(shù)定量；荷移光譜法測定光譜法

46、測定.7) 紫外吸收紫外吸收(UV): NO2-、NO3-、SO42-、SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋白質(zhì)等。苯丙氨酸、蛋白質(zhì)等。752. 多組分的測定多組分的測定 x 1, y 1, x 2, y 2由由x,y標(biāo)液標(biāo)液 在在 1, 2處分別測得處分別測得a) 在 1處測組分處測組分x, 在 2處測組分處測組分yb) 在 1處測組分處測組分x; 在在 2處測總吸處測總吸收收,扣除扣除x吸收吸收,可求可求yc) x,y組分不能直接測定組分不能直接測定A1= x 1bcx+ y 1bcy(在 1處測得處測得A1) A2 = x 2bcx+ y 2bc

47、y(在 2處測得處測得A2)76 3. 3. 光度滴定光度滴定NaOH滴定滴定 對硝基酚對硝基酚 pKa=7.15 間硝基酚間硝基酚 pKa=8.39 pKa =1.24V1V2V(NaOH)/mL對硝基酚對硝基酚間硝基酚間硝基酚酸形均酸形均無色無色. .堿形均堿形均黃色黃色77典型的光度滴定曲線典型的光度滴定曲線依據(jù)滴定過程中溶液吸光度變化來確定終點的滴定分析方法。依據(jù)滴定過程中溶液吸光度變化來確定終點的滴定分析方法。Vsp滴定劑吸收滴定劑吸收Vsp被滴物吸收被滴物吸收Vsp滴定劑與待滴定劑與待測物均吸收測物均吸收Vsp產(chǎn)物吸收產(chǎn)物吸收784. 4. 絡(luò)合物組成的測定絡(luò)合物組成的測定(1)(

48、1)摩爾比法摩爾比法: : 固定固定cM , ,改變改變c cR R 1:13:1c(R)/c(M)A1.0 2.0 3,0 79(2)(2)等摩爾連續(xù)變化法等摩爾連續(xù)變化法: :M:R=1:10.50.33cM/ccM/cM:R=1:2MRMRnn MR(ccc）常數(shù)常數(shù)80表觀形成常數(shù)的測定表觀形成常數(shù)的測定 (設(shè)設(shè)M、R均無吸收均無吸收)0.5cM/cM:R=1:1A0A00-=A AA c(M)=c(R)=c)2MR(1-1-=M R cKccc MmRn型型 ?815.5.一元弱酸離解常數(shù)的測定一元弱酸離解常數(shù)的測定 HL HLHLHLL=HL+LKccAKK +L+aaa(HL)H (HL)=+H +H KaH+L/HL高酸度下，幾乎全部以高酸度下，幾乎全部以HL存在，可測得存在，可測得AHLHLc(HL)；低酸度下，幾乎全部以低酸度下，幾乎全部以L存在，可測得存在