黃曲霉毒素的檢查方法

1、黃曲霉素的檢測方法黃曲霉素的檢測方法王慧王慧 由于黃曲霉素在自然界的由于黃曲霉素在自然界的廣泛存在廣泛存在和對人、畜等生物的和對人、畜等生物的巨巨 大危害性大危害性（主要為致癌性，（主要為致癌性，WHOWHO將其列為自然界最強的三將其列為自然界最強的三大致癌物之一），大致癌物之一），國際上國際上將其納入到嚴(yán)格控制的將其納入到嚴(yán)格控制的有害生物有害生物名單名單之中。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉素含量是國際上食品衛(wèi)生和農(nóng)產(chǎn)之中。農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉素含量是國際上食品衛(wèi)生和農(nóng)產(chǎn)品品貿(mào)易中的必檢指標(biāo)貿(mào)易中的必檢指標(biāo)。在我國加入。在我國加入WTOWTO后，黃曲霉素（后，黃曲霉素（A A flatoxinflatoxin）也常常

2、成為某些國家和組織）也常常成為某些國家和組織限制我國農(nóng)副產(chǎn)品限制我國農(nóng)副產(chǎn)品出口的綠色壁壘出口的綠色壁壘，我國已連續(xù)多次因為黃曲霉素被檢出而，我國已連續(xù)多次因為黃曲霉素被檢出而遭受農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易損失?；谏鲜鲞@些原因，我們必須加強遭受農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易損失。基于上述這些原因，我們必須加強農(nóng)副產(chǎn)品及飼料產(chǎn)品中各型黃曲霉素檢測的工作。農(nóng)副產(chǎn)品及飼料產(chǎn)品中各型黃曲霉素檢測的工作。 世界公認(rèn)的三大致癌物：黃曲霉菌、三四苯并芘、亞硝酸鹽世界公認(rèn)的三大致癌物：黃曲霉菌、三四苯并芘、亞硝酸鹽 黃曲霉毒主要存在于發(fā)霉的糧、油、花生中，它是黃黃曲霉毒主要存在于發(fā)霉的糧、油、花生中，它是黃曲霉及寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，毒性極強，

3、可致肝癌，由于曲霉及寄生曲霉的代謝產(chǎn)物，毒性極強，可致肝癌，由于黃曲霉素是一種熱穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)，所以在烹調(diào)過程中不黃曲霉素是一種熱穩(wěn)定的化學(xué)物質(zhì)，所以在烹調(diào)過程中不易破壞。預(yù)防措施主要是防霉。易破壞。預(yù)防措施主要是防霉。但如果食品已霉變產(chǎn)毒，則應(yīng)但如果食品已霉變產(chǎn)毒，則應(yīng)采取適當(dāng)去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾軋法及水采取適當(dāng)去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾軋法及水搓法；植物油可用加堿去毒法等。搓法；植物油可用加堿去毒法等。 目目前已分離鑒定出前已分離鑒定出1818種，主要是黃曲霉毒素種，主要是黃曲霉毒素B B1 1、B B2 2、G G1 1、G G2 2 以及由以及

4、由B B1 1、B B2 2在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物在體內(nèi)經(jīng)過羥化而衍生成的代謝產(chǎn)物M M1 1、M M2 2 等，等，B B1 1為毒性及致為毒性及致癌性癌性最強的物質(zhì)最強的物質(zhì)。其毒性為氰化鉀的其毒性為氰化鉀的1010倍、倍、砒霜的砒霜的6868倍倍, ,被列入嚴(yán)管的特劇毒物質(zhì)！被列入嚴(yán)管的特劇毒物質(zhì)！ 中藥材的采收、加工、銷售、直到使用需要一段相當(dāng)長中藥材的采收、加工、銷售、直到使用需要一段相當(dāng)長的時間，的時間，如果如果儲存環(huán)境不合理，儲存環(huán)境不合理，會會造成藥材或飲片發(fā)霉變造成藥材或飲片發(fā)霉變質(zhì)，特別是含油脂比較豐富的種子類藥材，更容易發(fā)生變質(zhì)，特別是含油脂比較豐富的種子類藥材

5、，更容易發(fā)生變質(zhì)質(zhì)，產(chǎn)生大量黃曲霉素產(chǎn)生大量黃曲霉素。 20102010版中國藥典，修改增加了很多項目，尤其是增版中國藥典，修改增加了很多項目，尤其是增加了安全性控制指標(biāo)，其中首次增加黃曲霉素控制加了安全性控制指標(biāo)，其中首次增加黃曲霉素控制。 20102010版藥典版藥典規(guī)定每規(guī)定每1000g1000g含黃曲霉素含黃曲霉素B B1 1不得過不得過5g5g，含黃曲霉素，含黃曲霉素G G2 2、黃曲霉素、黃曲霉素G G1 1、黃曲霉素、黃曲霉素B B2 2和和黃曲霉素黃曲霉素B B1 1的總量不得過的總量不得過10g10g。 在藥典一部中增加了僵蠶、酸棗仁、桃仁、在藥典一部中增加了僵蠶、酸棗仁、桃

6、仁、胖大海、陳皮等五個品種的黃曲霉素檢查。胖大海、陳皮等五個品種的黃曲霉素檢查。測定方法 測定黃曲霉毒素測定黃曲霉毒素B1B1的方法有薄層色譜法、高效液的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、熒光光度法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、相色譜法、熒光光度法、酶聯(lián)免疫吸附測定法、免疫親和層析柱免疫親和層析柱- -高效液相色譜法、免疫親和層析高效液相色譜法、免疫親和層析柱柱- -熒光光度計法等熒光光度計法等薄層分析法薄層分析法( ( TLCTLC) ) 最經(jīng)典最經(jīng)典、最常用最常用，至今仍為一些檢測機構(gòu)所用，也是一種至今仍為一些檢測機構(gòu)所用，也是一種國標(biāo)方法國標(biāo)方法 原理原理是用適宜的萃取溶劑將黃曲霉素從試樣中萃取

7、出來是用適宜的萃取溶劑將黃曲霉素從試樣中萃取出來，經(jīng)柱層析，經(jīng)柱層析（它利用吸附劑對不同物質(zhì)吸附能力的差異，用溶劑將混合物的組分逐一洗脫分離的一種分離方法）凈化后，再在薄板凈化后，再在薄板上展開后分離上展開后分離，利用黃曲霉素的熒光特性利用黃曲霉素的熒光特性, ,根據(jù)熒光斑點根據(jù)熒光斑點的強弱與標(biāo)準(zhǔn)比較確定其含量，對于一些組分很復(fù)雜的試的強弱與標(biāo)準(zhǔn)比較確定其含量，對于一些組分很復(fù)雜的試樣要雙向展開，才能獲得較高的靈敏度樣要雙向展開，才能獲得較高的靈敏度 TLCTLC法設(shè)備簡單，檢測費用低，但操作繁瑣費時，萃取和法設(shè)備簡單，檢測費用低，但操作繁瑣費時，萃取和凈化效果不理想，靈敏度差，對操作人員的

8、身體健康存在凈化效果不理想，靈敏度差，對操作人員的身體健康存在較大程度的危害較大程度的危害 液相色譜法液相色譜法( ( HPLCHPLC) ) 原理是在高效液相色譜儀上添加原理是在高效液相色譜儀上添加柱后衍生系統(tǒng)柱后衍生系統(tǒng)分離分離，再用再用熒光檢熒光檢測器測器測定測定。當(dāng)前，該方法大多用當(dāng)前，該方法大多用免疫親和柱免疫親和柱來凈化分離，凈化效果優(yōu)來凈化分離，凈化效果優(yōu)異異 該法能準(zhǔn)確地分離不同種類的黃曲霉素，檢測速度快且該法能準(zhǔn)確地分離不同種類的黃曲霉素，檢測速度快且定性與定量定性與定量準(zhǔn)確，檢測限低準(zhǔn)確，檢測限低，可作為仲裁法使用，但儀器設(shè)備價格昂貴前處理方可作為仲裁法使用，但儀器設(shè)備價格

9、昂貴前處理方法相對繁瑣，若用到免疫親和柱則會使試樣檢測費用增加，法相對繁瑣，若用到免疫親和柱則會使試樣檢測費用增加，對操作人對操作人員的身體健康仍存在一定的危害員的身體健康仍存在一定的危害柱后衍生柱后衍生：利用衍生反應(yīng)使被測物與相應(yīng)的試劑分析反應(yīng)，以改變其物理或化學(xué)性質(zhì)，使其被檢測到。例如將發(fā)色基團或熒光基團鍵合到樣品中去，多極放大檢測靈敏度柱后衍生系統(tǒng)柱后衍生系統(tǒng)：有碘衍生化法、溴衍生化法及較為先進(jìn)的電化學(xué)衍生化法和光化學(xué)衍生化法免疫親和柱免疫親和柱：基于抗原抗體反應(yīng)，特異性抗體連接在柱體內(nèi)，選擇性吸附樣品中的待檢物，雜質(zhì)不被吸附，流出柱外，柱上結(jié)合的目標(biāo)物再被特定的洗脫液洗下來，可以用于液

10、相色譜(HPLC)分析或者ELISA含量測定，是一種高效的前處理柱。 原理是根據(jù)抗體和抗原之間特異性原理是根據(jù)抗體和抗原之間特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，最后用測定酶活力的的免疫學(xué)反應(yīng)，最后用測定酶活力的方法來增加測定的靈敏度方法來增加測定的靈敏度 ELISA ELISA法將已知的待測法將已知的待測AFBAFB1 1抗原抗原( (或抗體或抗體) )吸附于固定載體的免疫吸附吸附于固定載體的免疫吸附劑上，洗滌未吸附的其他抗原和雜質(zhì)劑上，洗滌未吸附的其他抗原和雜質(zhì), ,加入酶標(biāo)記的加入酶標(biāo)記的AFBAFB1 1 抗體抗體( (或抗原或抗原) )與與樣品中的待測物樣品中的待測物( (抗原或抗體抗原或抗體) )發(fā)

11、生特發(fā)生特異免疫學(xué)反應(yīng)，形成異免疫學(xué)反應(yīng)，形成酶標(biāo)記的抗原一抗體復(fù)合物，洗滌后，加入酶底物，洗滌后，加入酶底物，進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過顏色的深淺來測進(jìn)行顯色反應(yīng)，通過顏色的深淺來測定定AFBAFB1 1抗原或抗體的含量?？乖蚩贵w的含量。 酶聯(lián)免疫法酶聯(lián)免疫法( (ELISAELISA ) ) ELISA ELISA法相對于法相對于HPLCHPLC具具有特異性強、干擾小，樣品的預(yù)有特異性強、干擾小，樣品的預(yù)處理簡便，且快速、靈敏、高效等特點，而且回收率高，處理簡便，且快速、靈敏、高效等特點，而且回收率高，提取方法簡單，可以進(jìn)行提取方法簡單，可以進(jìn)行定性和定量測定定性和定量測定，并且對設(shè)備裝，并且對

12、設(shè)備裝置的投資比置的投資比H HPLCPLC降低了許多，大大節(jié)約了測試的成本，因降低了許多，大大節(jié)約了測試的成本，因而而ELISAELISA已已用于食品中黃曲霉毒素的測定。用于食品中黃曲霉毒素的測定。 一種常用的國標(biāo)方法一種常用的國標(biāo)方法 原理是利用黃曲霉素各種毒素的原理是利用黃曲霉素各種毒素的熒光特性熒光特性，用熒光光度計，用熒光光度計測定樣品中黃曲霉素的含量。大致過程是：試樣先經(jīng)甲醇測定樣品中黃曲霉素的含量。大致過程是：試樣先經(jīng)甲醇水水提取提取，提取液經(jīng)，提取液經(jīng)過濾、稀釋過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉素特殊抗體的素特殊抗體的免疫親和柱凈化免疫親和柱凈化（生物免疫學(xué)

13、原理，此抗體對黃（生物免疫學(xué)原理，此抗體對黃曲霉素具有專一識別功能）曲霉素具有專一識別功能），黃曲霉素鍵合在免疫親和小柱的，黃曲霉素鍵合在免疫親和小柱的抗體上，用蒸餾水將柱上的雜質(zhì)除去后，以甲醇將目標(biāo)化抗體上，用蒸餾水將柱上的雜質(zhì)除去后，以甲醇將目標(biāo)化合物洗脫下來，加顯色劑于專用的熒光光度計中測定樣品合物洗脫下來，加顯色劑于專用的熒光光度計中測定樣品中的黃曲霉素含量中的黃曲霉素含量 該方法對檢測人員身體健康無危害該方法對檢測人員身體健康無危害, ,檢測速度迅速，靈敏檢測速度迅速，靈敏度高，適用于度高，適用于大量試樣檢測大量試樣檢測，且，且定量定量準(zhǔn)確，但檢測費用較準(zhǔn)確，但檢測費用較高，需要配置

14、專用設(shè)備，且不能對單一的毒素進(jìn)行檢測高，需要配置專用設(shè)備，且不能對單一的毒素進(jìn)行檢測熒光光度法熒光光度法( (IAC/SFBIAC/SFB ) )幾種黃曲霉素檢測方法的特點免疫親和層析凈化高效液相色譜法 試樣經(jīng)過甲醇一水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有試樣經(jīng)過甲醇一水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素此抗體對黃曲霉毒素B B1 1，B B2 2,G,G1 1，G G2 2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水或吐溫或吐溫-2

15、0/PBS-20/PBS將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析將免疫親和柱上雜質(zhì)除去，以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生柱洗脫，洗脫液通過帶熒光檢測器的高效液相色譜儀柱后碘溶液衍生測定黃曲霉毒素的含量測定黃曲霉毒素的含量。 將免疫親和柱與高效液相色譜法結(jié)合應(yīng)用是目前采用較多的一種將免疫親和柱與高效液相色譜法結(jié)合應(yīng)用是目前采用較多的一種方法方法 這些新方法新手段的快速應(yīng)用這些新方法新手段的快速應(yīng)用 為黃曲霉毒素的檢測提供了更廣為黃曲霉毒素的檢測提供了更廣泛的選擇余地適應(yīng)了不同的檢測目的和要求泛的選擇余地適應(yīng)了不同的檢測目的和要求免疫親和層析

16、凈化熒光光度法免疫親和層析凈化熒光光度法 黃曲霉毒素速測儀 農(nóng)業(yè)部油料及制品質(zhì)檢中心中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所根據(jù) GB/T18979-2003研制成042NYART型黃曲霉毒素速測儀 , 本儀器采用的是免疫親和層析凈化熒光光度法 試樣經(jīng)過甲醇一水提取，提取液經(jīng)過濾、稀釋后，濾液經(jīng)過含有黃曲霉毒素特異抗體的免疫親和層析凈化，此抗體對黃曲霉毒素B B1 1，B B2 2,G,G1 1，G G2 2具有專一性，黃曲霉毒素交聯(lián)在層析介質(zhì)中的抗體上。用水將免疫親和柱上雜質(zhì)除去.以甲醇通過免疫親和層析柱洗脫，加入溴溶液衍生，以提高測定靈敏度。洗脫液通過熒光光度計測定黃曲霉毒素(B B1 1+B B2

17、2+G G1 1+G G2 2)總量。 該方法準(zhǔn)確、簡單、快速、安全。該方法準(zhǔn)確、簡單、快速、安全。毛細(xì)管電泳法毛細(xì)管電泳法( (CECE) ) 是一種新發(fā)展起來的分析黃曲霉素的方法是一種新發(fā)展起來的分析黃曲霉素的方法 該方法與激光減弱熒光檢測器該方法與激光減弱熒光檢測器( (LIFLIF) ) 連用可很好地提高靈連用可很好地提高靈敏度等敏度等 用毛細(xì)管電泳激光減弱熒光檢測器測定用毛細(xì)管電泳激光減弱熒光檢測器測定AFBAFB1 1、AFBAFB2 2和和 AFGAFG1 1 、AFGAFG2 2 ，取得了較為理想的分離效果，其中對取得了較為理想的分離效果，其中對AFBAFB2 2的測定的測定最為靈敏最為靈敏 , ,但但CECE法的法的成本較高成本較高，操作復(fù)雜，不適宜在試樣，操作復(fù)雜，不適宜在試樣檢測中廣泛應(yīng)用檢測中廣泛應(yīng)用生物傳感器法生物傳感器法 是使用是使用固定化技術(shù)固定化技術(shù)將具有將具有分子識別能力的生物活性物質(zhì)分子識別能力的生物活性物質(zhì)與與物理化學(xué)換能器物理化學(xué)換能器結(jié)合，可以用來探測生物體內(nèi)外的環(huán)境化結(jié)合，可以用來探測生物體內(nèi)外的環(huán)境化學(xué)物質(zhì)或與之起特異性交互作用后產(chǎn)生響應(yīng)的一種裝置學(xué)物質(zhì)或與之起特異性交互作用后產(chǎn)生響應(yīng)的一種裝置。其中利用其中利用分子間特異親和性制備的親和型生物傳感器分子間特