HPLC培訓(xùn)技巧ppt

1、高效液相色譜（高效液相色譜（HPLC）簡介）簡介 一、什么是液相色譜一、什么是液相色譜?歷史概述和定義液相色譜的定義是二十世紀(jì)早期由俄羅斯植物學(xué)家 Mikhail S. 茨維特提出的。他最先嘗試在裝滿顆粒的柱子上使用溶劑來分離從植物中提取的化合物樹葉色素。一、什么是液相色譜一、什么是液相色譜?混合物最有效的分離、分析方法。u色譜法是一種分離技術(shù)。u 混合物分離過程：試樣中各組分在稱之為色譜分離柱中的兩相間不斷進(jìn)行著的分配。u 一相固定不動(dòng)，稱為固定相。u 另一相是攜帶試樣混合物流過固定相的流體(氣體或液體)，稱為流動(dòng)相。u 如果是氣體稱之為氣相色譜，那液體就是液相色譜。一、什么是液相色譜一、什

2、么是液相色譜?液相色譜的形式薄層色譜法 紙層析法 柱色譜法 一、什么是液相色譜一、什么是液相色譜?什么是高效液相色譜法HPLC?縮寫 HPLC, 高壓 (high-pressure) 早期的泵只能承受 500 psi 35bar。這就被稱為高壓液相色譜法HPLC隨著這一期間不斷的性能改進(jìn)更小顆粒，更高壓力, 字母縮寫保持一樣，但全稱變?yōu)楦咝?(high-performance) 液相色譜HPLC。高效液相色譜HPLC是目前分析化學(xué)最強(qiáng)大的工具之一。它能夠分離、定性和定量任何可以溶解在液體中的化合物?？s寫LC是指Liquid Chromatography 一、什么是液相色譜一、什么是液相色譜?H

3、PLC的特點(diǎn)的特點(diǎn)（一）（一） 項(xiàng)項(xiàng) 目目高效液相色譜法高效液相色譜法經(jīng)典液相色譜法經(jīng)典液相色譜法色譜柱：柱長色譜柱：柱長/cm/cm 柱內(nèi)徑柱內(nèi)徑/mm/mm101025252 21010101020020010105050固定相粒徑固定相粒徑/m/m5 550507575600600色譜柱柱效色譜柱柱效（理論塔板數(shù)）（理論塔板數(shù)）2 210103 35 510104 42 25050柱壓降柱壓降/MP/MPa a5 515150.0010.0010.30.3進(jìn)樣量進(jìn)樣量/g/g1010-6-61010-2-20.10.11010分析時(shí)間分析時(shí)間/h/h0.050.051.01.01 120

4、20一、什么是液相色譜一、什么是液相色譜?HPLC的特點(diǎn)（二）項(xiàng)項(xiàng) 目目高效液相色譜法高效液相色譜法氣相色譜法氣相色譜法進(jìn)樣方式進(jìn)樣方式樣品制成溶液樣品制成溶液樣品需氣化或裂解樣品需氣化或裂解流動(dòng)相流動(dòng)相溶液溶液惰性氣體惰性氣體分離原理分離原理吸附、分配、篩析、親和等吸附、分配、篩析、親和等吸附和分配吸附和分配檢測器檢測器UVUV、PDAPDA、RIDRID等等TCDTCD、FIDFID、ECDECD等等應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍低、中、高沸點(diǎn)有機(jī)化合物低、中、高沸點(diǎn)有機(jī)化合物離子型無機(jī)化合物離子型無機(jī)化合物熱不穩(wěn)定化合物熱不穩(wěn)定化合物生物活性分子生物活性分子低沸點(diǎn)有機(jī)化合物低沸點(diǎn)有機(jī)化合物永久性氣體永

5、久性氣體三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 高效液相色譜系統(tǒng)的各組成部分。 儲(chǔ)液瓶 、高壓泵 、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器 、數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng) 三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 高效液相色譜系統(tǒng)的各組成部分。 儲(chǔ)液瓶 、高壓泵 、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器 、數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng) 三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 高效液相色譜操作高效液相色譜操作一個(gè)簡單的方法來理解如何獲得樣品中化合物的分離，如下圖所示 三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 什么是檢測器什么是檢測器?當(dāng)分開的染料譜帶離開色譜柱后，它們馬上進(jìn)入檢測器。檢測器帶有可以在流動(dòng)相背景下看檢

6、測到每個(gè)分開的化合物譜帶的流通池如圖 H。 三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 幾個(gè)常見檢測器的類型幾個(gè)常見檢測器的類型紫外檢測器熒光檢測器蒸發(fā)光散射檢測器 示差檢測器光電二極管陣列檢測器質(zhì)譜儀MS三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 紫外檢測器紫外檢測器(UV) 應(yīng)用最廣，對(duì)大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。 特點(diǎn)： 靈敏度高； 線性范圍寬； 流通池可做得很小(1mm 10mm ，容積 8L)； 對(duì)流動(dòng)相的流速和溫度變化不敏感； 波長可選，易于操作； 可用于梯度洗脫。 三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 光電二極管陣列檢測器光電二極管陣列檢測器(PDA)

7、紫外檢測器的重要進(jìn)展； 光電二極管陣列檢測器：1024個(gè)二極管陣列，不但能得到分析全過程的色譜圖，同時(shí)還能得到所有組分的光譜圖（3D譜圖）。 三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? c. 示差折光檢測器示差折光檢測器 除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器。 可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光指數(shù) 差值。差值與濃度成正比。 通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）。 靈敏度低，對(duì)溫度敏感，不能用于梯度洗脫，不適合做衡量分析。 三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 質(zhì)譜檢測器（質(zhì)譜檢測器（MS） 樣品在質(zhì)譜部分和流動(dòng)相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按

8、質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來。什么是色譜圖什么是色譜圖?色譜圖表示發(fā)生在高效液相色譜系統(tǒng)中的化學(xué)色譜分離。一系列從基線出現(xiàn)的峰以時(shí)間為坐標(biāo)。每個(gè)峰代表對(duì)不同化合物的檢測器反應(yīng)。色譜圖由計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)站描繪。如圖 H. 色譜峰色譜峰保留時(shí)間（分）保留時(shí)間（分）基線基線峰高峰高峰寬峰寬響應(yīng)值響應(yīng)值三、高效液相色譜如何工作三、高效液相色譜如何工作? 四、定性和定量化合物四、定性和定量化合物 定性和定量化合物 每一個(gè)洗脫物在一個(gè)特定的位置，時(shí)間段計(jì)算從進(jìn)樣零時(shí)到峰最高點(diǎn)洗脫出來為止。比較每個(gè)峰的保留時(shí)間tR和注入同一色譜系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

9、相同流動(dòng)相和固定相的保留時(shí)間，色譜工作者就可能鑒定每一個(gè)化合物。檢測器基本上反映化合物譜帶通過流通池的濃度。濃度越高，信號(hào)越強(qiáng)，峰面積越大。 五、等度和梯度液相系統(tǒng)操作五、等度和梯度液相系統(tǒng)操作等度和梯度液相系統(tǒng)操作等度和梯度液相系統(tǒng)操作高效液相色譜使用兩種基本的洗脫模式。第一種稱為等度洗脫等度洗脫。在這種模式下，流動(dòng)相，無論是純?nèi)軇┗蚧旌衔?，在整個(gè)操作過程中保持不變。第二種稱為梯度洗脫梯度洗脫，正如名稱所指，流動(dòng)相的組成在分離過程中發(fā)生變化。如20%甲醇20分鐘變?yōu)?0%甲醇。這種模式對(duì)含有多種不同色譜極性化合物的樣品非常有用。隨著分離的進(jìn)行，流動(dòng)相的洗脫強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)以洗脫出更強(qiáng)保留的樣品組

10、分。六、高效液相色譜柱硬件六、高效液相色譜柱硬件 色譜柱色譜柱 色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成，而且相對(duì)于分離系統(tǒng)樣品，流動(dòng)相和固定相來說具有化學(xué)惰性。為承受盡可能高的壓力，大多數(shù)色譜柱由不銹鋼制成。分離性能分離性能 - 分離度分離度 兩種化合物分離的程度稱為色譜分離度RS。 由色譜柱決定的總體分離能力或分離度的兩個(gè)主要的因素是，機(jī)械分離能力：由色譜柱長度，粒徑和填料床層的均一性決定；化學(xué)分離能力：由填料和流動(dòng)相對(duì)化合物的物化競爭決定。效率是衡量機(jī)械分離能力的指標(biāo)，選擇性是化學(xué)分離能力的指標(biāo)。機(jī)械分離能力機(jī)械分離能力 - 效率效率 如果色譜柱床穩(wěn)定均一地填充

11、，它的分離能力就由柱長度和顆粒大小決定。機(jī)械分離能力，也叫效率，通常以塔板數(shù)符號(hào)是N來測量和比較。較小顆粒色譜床有較高效率和反壓。對(duì)于固定的顆粒大小，增加色譜柱長度可獲得更強(qiáng)的機(jī)械分離能力。然而，代價(jià)是色譜運(yùn)行時(shí)間延長，更多溶劑消耗和更高反壓。減少色譜柱長度可以減小以上變量但也降低了機(jī)械分離能力。六、高效液相色譜柱硬件六、高效液相色譜柱硬件 色譜柱色譜柱色譜柱按用途可分為分析型和制備型兩類，尺寸規(guī)格也不同：常規(guī)分析柱（常量柱），內(nèi)徑25mm（常用4.6mm），柱長1030cm；窄徑柱（narrow bore，又稱細(xì)管徑柱、半微柱semi-microcolumn），內(nèi)徑12mm，柱長1020cm

12、；毛細(xì)管柱（又稱微柱microcolumn），內(nèi)徑0.20.5mm；半制備柱，內(nèi)徑5mm；實(shí)驗(yàn)室制備柱，內(nèi)徑2040mm，柱長1030cm；生產(chǎn)制備柱內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。 六、高效液相色譜柱硬件六、高效液相色譜柱硬件 色譜柱的發(fā)展方向色譜柱的發(fā)展方向1. 因強(qiáng)調(diào)分析速度而發(fā)展出短柱，柱長310cm，填料粒徑23m。為提高 分析靈敏度，與質(zhì)譜（MS）聯(lián)接，而發(fā)展出窄徑柱、毛細(xì)管柱和內(nèi)徑小于0.2mm的微徑柱（microbore）。細(xì)管徑柱的優(yōu)點(diǎn)是：節(jié)省流動(dòng)相；靈敏度增加；樣品量少；能使用長柱達(dá)到高分離度；容易控制柱溫；易于實(shí)現(xiàn)LC-MS聯(lián)用。2. 但由于柱體積越來越小，柱外效應(yīng)的影響就更加顯著，需

13、要更小池體積的檢測器（甚至采用柱上檢測），更小死體積的柱接頭和連接部件。配套使用的設(shè)備應(yīng)具備如下性能：輸液泵能精密輸出1100l/min的低流量，進(jìn)樣閥能準(zhǔn)確、重復(fù)地進(jìn)樣微小體積的樣品。且因上樣量小，要求高靈敏度的檢測器，電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜儀在這方面具有突出優(yōu)點(diǎn)。七、高效液相色譜分離模式七、高效液相色譜分離模式 總的來說，化合物的三種主要的性質(zhì)可以用來產(chǎn)生高效液相色譜分離。它們是： 極性極性 電荷電荷 分子大小分子大小七、高效液相色譜分離模式七、高效液相色譜分離模式 基于極性的分離基于極性的分離 結(jié)構(gòu)經(jīng)常決定這個(gè)分子是極性還是非極性。有機(jī)分子根據(jù)結(jié)構(gòu)經(jīng)常決定這個(gè)分子是極性還是非極性。有機(jī)分子根

14、據(jù)它含有的主要官能團(tuán)來分類。使用基于極性的分離模式，不同它含有的主要官能團(tuán)來分類。使用基于極性的分離模式，不同分子的相對(duì)色譜保留時(shí)間大都由這些官能團(tuán)的本性和位置決定。分子的相對(duì)色譜保留時(shí)間大都由這些官能團(tuán)的本性和位置決定?；跇O性的色譜分離是根據(jù)相似物的相互吸引和不同物質(zhì)的相基于極性的色譜分離是根據(jù)相似物的相互吸引和不同物質(zhì)的相互排斥。互排斥。 設(shè)計(jì)一套色譜分離系統(tǒng)設(shè)計(jì)一套色譜分離系統(tǒng)如圖如圖Q，我們通過選擇流動(dòng)相和固，我們通過選擇流動(dòng)相和固定相制造樣品中各種化合物的競爭。這樣，樣品中和固定相定相制造樣品中各種化合物的競爭。這樣，樣品中和固定相柱柱填料填料極性相似的化合物將被延遲因?yàn)樗鼈兏鼜?qiáng)地

15、被顆粒吸引。極性相似的化合物將被延遲因?yàn)樗鼈兏鼜?qiáng)地被顆粒吸引。而和流動(dòng)相極性相似的化合物將優(yōu)先被吸引而移動(dòng)較快。而和流動(dòng)相極性相似的化合物將優(yōu)先被吸引而移動(dòng)較快。 基于基于極性的分離極性的分離 極性分子非極性分子這樣，基于流動(dòng)相和固定相對(duì)極性分子非極性分子這樣，基于流動(dòng)相和固定相對(duì)不同化合物的相對(duì)吸引力不同而產(chǎn)生了分離。不同化合物的相對(duì)吸引力不同而產(chǎn)生了分離。圖 Q: 適當(dāng)流動(dòng)相和固定相的組合影響基于極性的分離七、高效液相色譜分離模式七、高效液相色譜分離模式 基于極性的分離基于極性的分離常用流動(dòng)相極性：常用流動(dòng)相極性：石油醚汽油庚烷己烷二硫化碳二甲苯甲苯氯丙烷苯溴乙烷溴化苯二氯乙烷三氯甲烷異丙

16、醚硝基甲烷乙酸丁酯乙醚乙酸乙酯正戊烷正丁醇苯酚甲乙醇叔丁醇四氫呋喃二氧六環(huán)丙酮乙醇甲醇乙腈甲酰胺水固定相顆粒色譜極性：固定相顆粒色譜極性：C18 C8 CN Silica官能團(tuán)極性大小官能團(tuán)極性大小(樣品）樣品） 烷烴（烷烴（CH3，CH2）烯烴（）烯烴（CH=CH）醚類（）醚類（OCH3，OCH2）硝基化合物）硝基化合物(NO2)二甲胺（二甲胺（CH3NCH3）脂類（脂類（COOR）酮類（）酮類（CO）醛類（）醛類（CHO）硫醇（）硫醇（SH）胺類（）胺類（NH2）酰胺（）酰胺（NHCOCH3）醇類（）醇類（OH）酚類（酚類（ArOH）羧酸類（）羧酸類（COOH）七、高效液相色譜分離模式七、

17、高效液相色譜分離模式 基于極性的分離基于極性的分離 考慮到流動(dòng)相和固定相的極性，對(duì)于某一固定相，必須選擇一個(gè)流動(dòng)相，使得感興趣的分析物可以結(jié)合在色譜柱上，但不能太強(qiáng)而洗脫不下來。在具有類似極性強(qiáng)度的溶劑中，考慮固定相和流動(dòng)相的配合，可以區(qū)分分析物極性和溶解性的更微弱的差別，使色譜系統(tǒng)的選擇性最大化?？偠灾?，色譜學(xué)家會(huì)選擇最佳的具有合適相反相極性的流動(dòng)相和固定相的組合。之后，當(dāng)樣品流過色譜柱的時(shí)候，同性相吸的原則將決定哪一種分析物流速放緩（出峰慢），哪一種流速更快（出峰快）。 七、高效液相色譜分離模式七、高效液相色譜分離模式 基于極性的分離基于極性的分離正相高效液相色譜正相高效液相色譜圖 S

18、-1 代表三個(gè)染料混合物的正相色譜分離。極性的固定相極性的固定相最強(qiáng)地保留了極性的黃色染料。相對(duì)非極性的藍(lán)色染料在非極性溶劑的流非極性溶劑的流動(dòng)相動(dòng)相保留競爭中勝出，很快被洗脫出來。由于藍(lán)色染料最像流動(dòng)相兩者都是非極性，它流動(dòng)得更快。對(duì)硅膠柱正相色譜來說，典型的情況流動(dòng)相是100% 極性較小的有機(jī)相，不含水。樣品是極性小的先出峰樣品是極性小的先出峰圖 S -1: 正相色譜法七、高效液相色譜分離模式七、高效液相色譜分離模式 基于極性的分離基于極性的分離反相高效液相色譜（最常用）反相高效液相色譜（最常用）反相是指與正相恰好相反的色譜模式，即使用極性流動(dòng)相極性流動(dòng)相和非非極性極性疏水性如疏水性如C1

19、8固定相固定相。圖 S-2 描述了三種染料的黑色混合物被該種方法分離的過程。樣品是極性大的先出峰樣品是極性大的先出峰圖 S -1: 反相色譜法七、高效液相色譜分離模式七、高效液相色譜分離模式 基于電荷的分離基于電荷的分離: 離子交換色譜離子交換色譜IEC離子交換分離的固定相以表面酸堿性強(qiáng)弱和吸附保留的離子類型來劃分。陽離子交換是用負(fù)電荷表面來保留和分離帶正電荷的離子。反之亦然，陰離子交換是用正電荷表面來保留和分離帶負(fù)電荷的離子。離子抑制色譜法：離子抑制色譜法：通常改變流動(dòng)相的通常改變流動(dòng)相的pH值被中和，使其失去吸附力而被洗值被中和，使其失去吸附力而被洗脫脫 。七、高效液相色譜分離模式七、高效

20、液相色譜分離模式 基于尺寸大小的分離：基于尺寸大小的分離：排阻色譜SEC - 凝膠滲透色譜GPC十九世紀(jì)五十年代，Porath 和 Flodin發(fā)現(xiàn)生物分子可以通過過濾或流經(jīng)孔徑可控的親水右旋糖苷聚合物時(shí)按照大小被分開，而不是基于電荷數(shù)或極性。這個(gè)過程被稱為凝膠過濾。后來，一種類似的裝置，使用特定孔徑范圍的有機(jī)聚合物填料可分離合成寡聚物和多聚物。這個(gè)過程成為凝膠滲透色譜GPC。使用孔徑可控的硅膠填料操作類似的分離過程被稱作排阻色譜SEC。八、液相色譜分析方法的建立八、液相色譜分析方法的建立1 . 色譜柱的選擇：色譜柱的選擇：疏水性的樣品疏水性的樣品反相鍵合色譜；反相鍵合色譜；親水性的樣品親水性

21、的樣品正相鍵合色譜；正相鍵合色譜；生物大分子生物大分子 體積排阻色譜；體積排阻色譜；無機(jī)離子化合物無機(jī)離子化合物離子對(duì)色譜；離子對(duì)色譜；高分子聚合高分子聚合 凝膠色譜；凝膠色譜；同系物的分離同系物的分離吸附、分配和鍵合色譜；吸附、分配和鍵合色譜；同分異構(gòu)體同分異構(gòu)體 雙鍵或取代基異構(gòu)用吸附色譜；雙鍵或取代基異構(gòu)用吸附色譜； 多環(huán)芳烴異構(gòu)選用反相鍵合；多環(huán)芳烴異構(gòu)選用反相鍵合；對(duì)映異構(gòu)體對(duì)映異構(gòu)體 流動(dòng)相加入手性選擇劑或具有光流動(dòng)相加入手性選擇劑或具有光學(xué)活性的固定相。學(xué)活性的固定相。八、液相色譜分析方法的建立八、液相色譜分析方法的建立2.流動(dòng)相、配比、流量、梯度洗脫的選擇流動(dòng)相、配比、流量、梯

22、度洗脫的選擇：根據(jù)分析樣品的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，結(jié)合色譜分析法確定流動(dòng)根據(jù)分析樣品的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，結(jié)合色譜分析法確定流動(dòng)相。相。為達(dá)到較好的分離效果，確定流動(dòng)相配比。為達(dá)到較好的分離效果，確定流動(dòng)相配比。流動(dòng)相的總流量增加，通常柱效增加。流動(dòng)相的總流量增加，通常柱效增加。梯度洗脫梯度洗脫-在洗脫過程中連續(xù)或間斷的改變流動(dòng)相在洗脫過程中連續(xù)或間斷的改變流動(dòng)相的組成，來改善分析效果的技術(shù)。適用范圍：當(dāng)樣品中的組成，來改善分析效果的技術(shù)。適用范圍：當(dāng)樣品中溶質(zhì)組分較多及不同溶質(zhì)的性質(zhì)差別較大時(shí)。溶質(zhì)組分較多及不同溶質(zhì)的性質(zhì)差別較大時(shí)。特殊要求：當(dāng)分析弱酸、弱堿性化合物時(shí)，可通過采用特殊要求：當(dāng)分析弱酸、弱堿性

23、化合物時(shí)，可通過采用緩沖溶液及調(diào)節(jié)流動(dòng)相的緩沖溶液及調(diào)節(jié)流動(dòng)相的Ph值來改善峰型。值來改善峰型。九、樣品分析方法介紹九、樣品分析方法介紹1 流動(dòng)相的準(zhǔn)備流動(dòng)相的準(zhǔn)備 流動(dòng)相的流動(dòng)相的選擇選擇-有機(jī)相（色譜級(jí)甲有機(jī)相（色譜級(jí)甲醇、色譜級(jí)乙腈）與水（超純水、緩沖溶醇、色譜級(jí)乙腈）與水（超純水、緩沖溶液）液）流動(dòng)相的流動(dòng)相的過濾過濾-用孔徑為用孔徑為0.45m濾濾膜過濾除去固體顆粒雜質(zhì)。膜過濾除去固體顆粒雜質(zhì)。流動(dòng)相的流動(dòng)相的脫氣脫氣-超聲脫氣、吹氦脫超聲脫氣、吹氦脫氣、加熱回流法、抽真空脫氣法、在線真氣、加熱回流法、抽真空脫氣法、在線真空脫氣法。空脫氣法。2 樣品的準(zhǔn)備樣品的準(zhǔn)備稱量稱量、用流動(dòng)相

24、超聲、用流動(dòng)相超聲溶解溶解、過濾過濾。九、樣品分析方法介紹九、樣品分析方法介紹3 分析方法的設(shè)定（參考相關(guān)文獻(xiàn)）分析方法的設(shè)定（參考相關(guān)文獻(xiàn)）流動(dòng)相的配比及流量流動(dòng)相的配比及流量-選擇何種有機(jī)相，純水或緩沖選擇何種有機(jī)相，純水或緩沖溶液，有機(jī)相與水相的比例，流動(dòng)相的總流量。溶液，有機(jī)相與水相的比例，流動(dòng)相的總流量。紫外檢測波長的確定紫外檢測波長的確定-通過測定被分析樣品的通過測定被分析樣品的最大吸收波長（紫外吸收檢測器）。最大吸收波長（紫外吸收檢測器）。是否采用梯度洗脫，確定起始配比（如是否采用梯度洗脫，確定起始配比（如20 80)及及終點(diǎn)配比終點(diǎn)配比(如如80 20)。九、樣品分析方法介紹九

25、、樣品分析方法介紹4 樣品的分析樣品的分析選定分析條件，走基線；選定分析條件，走基線；待基線平穩(wěn)后，發(fā)出進(jìn)樣指令；待基線平穩(wěn)后，發(fā)出進(jìn)樣指令；用進(jìn)樣針吸取已過濾好的定量樣品；用進(jìn)樣針吸取已過濾好的定量樣品；進(jìn)樣分析，獲得色譜圖及分析結(jié)果；進(jìn)樣分析，獲得色譜圖及分析結(jié)果；如譜圖效果不佳，則改變條件后繼續(xù)分析。如譜圖效果不佳，則改變條件后繼續(xù)分析。十、柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)十、柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮色譜柱的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效、縮短使用壽命甚至損壞。在色譜操作過程中，需要注意下列問題，以維短使用壽命甚至損壞。在色譜操

26、作過程中，需要注意下列問題，以維護(hù)色譜柱。護(hù)色譜柱。1.避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱柱從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過緩。2.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)閼?yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬?，反之亦然?/p>

27、全部是水，反之亦然。3.一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖一般說來色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。除去留在柱頭的雜質(zhì)。否則反沖會(huì)迅速降低柱效。4.選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以），以避免固定相被破壞。有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠“飽和飽和”，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。，避

28、免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解。十、柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)十、柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)5.避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)避免將基質(zhì)復(fù)雜的樣品尤其是生物樣品直接注入柱內(nèi)，需要對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定處理或者在進(jìn)樣器和色譜柱之間連接一保護(hù)柱。保護(hù)柱一般是填有相似固定相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。相的短柱。保護(hù)柱可以而且應(yīng)該經(jīng)常更換。6.經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)。在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每

29、種流動(dòng)相的體積應(yīng)是路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要倍左右，即常規(guī)分析需要5075ml。 下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或下面列舉一些色譜柱的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。都必須嚴(yán)格脫水。甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化。反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿

30、）依次沖洗，再以相反順序依反相柱以水、甲醇、乙腈、一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖次沖洗。如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略最后用水沖洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)洗這一步。一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射注射100200µl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)。四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、腈或甲醇的混合溶液能除去類脂。有時(shí)也

31、注射二甲亞砜數(shù)次。此外，用乙腈、丙酮和三氟醋酸（丙酮和三氟醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染。 十、柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)十、柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)7.保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干保存色譜柱時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間。燥。絕對(duì)禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過夜或更長時(shí)間。8.色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)色譜柱使用過程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)

32、，使柱頭被污更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大。在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出12mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平。然后用適當(dāng)溶劑濕潤的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效固定相（與柱內(nèi)相同）填滿色譜柱，壓平，再擰緊柱接頭。這樣處理后柱效能得到

33、改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平。柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（530mm），可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的），可以起到保護(hù)、延長柱壽命的作用。采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的。柱效，這是值得的。十一、與檢測器有關(guān)的故障或排除十一、與檢測器有關(guān)的故障或排除1. 流動(dòng)池內(nèi)有氣泡流動(dòng)池內(nèi)有氣泡 如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動(dòng)池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則如果有氣泡連續(xù)不斷地通過流動(dòng)池，將使噪音增大，如果氣泡較大，則會(huì)在基線上出現(xiàn)許多

34、線狀會(huì)在基線上出現(xiàn)許多線狀“峰峰”，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)，這是由于系統(tǒng)內(nèi)有氣泡，需要對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。行充分的除氣，檢查整個(gè)色譜系統(tǒng)是否漏氣，再加大流量驅(qū)除系統(tǒng)內(nèi)的氣泡。如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法如果氣泡停留在流動(dòng)池內(nèi)，也可能使噪音增大，可采用突然增大流量的辦法除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動(dòng)輸液泵的同時(shí)，用手指緊壓流動(dòng)除去氣泡（最好不連接色譜柱）；或者啟動(dòng)輸液泵的同時(shí)，用手指緊壓流動(dòng)池出口，使池內(nèi)增壓，然后放開?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加池出口，使池內(nèi)增壓，然后

35、放開?？煞磸?fù)操作數(shù)次，但要注意不使壓力增加太多，以免流動(dòng)池破裂。太多，以免流動(dòng)池破裂。2. 流動(dòng)池被污染流動(dòng)池被污染 無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移。可以使用適當(dāng)無論參比池或樣品池被污染，都可能產(chǎn)生噪音或基線漂移?？梢允褂眠m當(dāng)溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用溶劑清洗檢測池，要注意溶劑的互溶性；如果污染嚴(yán)重，就需要依次采用1mol/L硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。硝酸、水和新鮮溶劑沖洗，或者取出池體進(jìn)行清洗、更換窗口。十一、與檢測器有關(guān)的故障或排除十一、與檢測器有關(guān)的故障或排除3. 光源燈出現(xiàn)故障光源燈出現(xiàn)故障 紫外或

36、熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)紫外或熒光檢測器的光源燈使用到極限或者不能正常工作時(shí)，可能產(chǎn)生嚴(yán)重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時(shí)需要重噪音，基線漂移，出現(xiàn)平頭峰等異常峰，甚至使基線不有回零。這時(shí)需要更換光源燈。更換光源燈。4. 倒峰倒峰 倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折倒峰的出現(xiàn)可能是檢測器的極性接反了，改正后即可變成正峰。用示差折光檢測器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于流動(dòng)相的折光指數(shù)，也會(huì)出現(xiàn)倒峰，光檢測器時(shí)，如果組分的折光指數(shù)低于流動(dòng)相的折光指數(shù)，也會(huì)出現(xiàn)倒峰，這就需要選擇合適的流動(dòng)相。如果流動(dòng)相中含有紫外

37、吸收的雜質(zhì)，使用紫外這就需要選擇合適的流動(dòng)相。如果流動(dòng)相中含有紫外吸收的雜質(zhì)，使用紫外檢測器時(shí)，無吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相。檢測器時(shí)，無吸收的組分就會(huì)產(chǎn)生倒峰，因此必須用高純度的溶劑作流動(dòng)相。在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓力變化，或者由于樣品溶劑與在死時(shí)間附近的尖銳峰往往是由于進(jìn)樣時(shí)的壓力變化，或者由于樣品溶劑與流動(dòng)相不同所引起的。流動(dòng)相不同所引起的。 十二、流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)十二、流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)1. 流動(dòng)相的性質(zhì)流動(dòng)相的性質(zhì) 一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易一個(gè)理想的液相色譜流動(dòng)相溶劑應(yīng)具有低粘度、與檢測器兼容性好、易

38、于得到純品和低毒性等特征。于得到純品和低毒性等特征。 流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜流動(dòng)相應(yīng)不改變填料的任何性質(zhì)。低交聯(lián)度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性填料有時(shí)遇到某些有機(jī)相會(huì)溶脹或收縮，從而改變色譜柱填床的性質(zhì)。堿性流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑流動(dòng)相不能用于硅膠柱系統(tǒng)。酸性流動(dòng)相不能用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統(tǒng)。的柱系統(tǒng)。 純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在純度。色譜柱的壽命與大量流動(dòng)相通過有關(guān)，特別是當(dāng)溶劑所含雜質(zhì)在柱上積累時(shí)。

39、所以流動(dòng)相一定要選用柱上積累時(shí)。所以流動(dòng)相一定要選用色譜級(jí)，水要選用超純水（娃哈哈純凈色譜級(jí)，水要選用超純水（娃哈哈純凈水）。水）。必須與檢測器匹配。使用必須與檢測器匹配。使用UV檢測器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測波長下應(yīng)沒有吸檢測器時(shí)，所用流動(dòng)相在檢測波長下應(yīng)沒有吸收，或吸收很小。與甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，并可滿足收，或吸收很小。與甲醇相比，乙腈的溶劑強(qiáng)度較高且粘度較小，并可滿足在紫外在紫外185205nm處檢測的要求處檢測的要求 。粘度要低（應(yīng)粘度要低（應(yīng)2cp）。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，）。高粘度溶劑會(huì)影響溶質(zhì)的擴(kuò)散、傳質(zhì)，降低柱效，還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)

40、間延長。最好選擇沸點(diǎn)在還會(huì)使柱壓降增加，使分離時(shí)間延長。最好選擇沸點(diǎn)在100以下的流動(dòng)相。以下的流動(dòng)相。對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響對(duì)樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉淀，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。十二、流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)十二、流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)2. 流動(dòng)相的流動(dòng)相的PH 采用反相色譜法分離弱酸（采用反相色譜法分離弱酸（3pKa7）或弱堿（）或弱堿（7pKa8）樣品時(shí)，通過）樣品時(shí)，通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相的調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定

41、相上的保留，并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的并改善峰形的技術(shù)稱為反相離子抑制技術(shù)。對(duì)于弱酸，流動(dòng)相的pH值越小，值越小，組分的組分的k值越大，當(dāng)值越大，當(dāng)pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于弱酸的pKa值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；值時(shí)，弱酸主要以分子形式存在；對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用對(duì)弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加醋酸溶液；分析弱堿樣品時(shí)，通常在流動(dòng)相中加入少量弱堿，常用入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩

42、沖液和磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。三乙胺溶液。注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減注：流動(dòng)相中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質(zhì)與殘余硅醇基的強(qiáng)相互作用，減輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑輕或消除峰拖尾現(xiàn)象。所以在這種情況下有機(jī)胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑?；虺矂Ｊ?、流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)十二、流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)3. 流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相的脫氣 HPLC所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的所用流動(dòng)相必須預(yù)先脫氣，否則容易在系統(tǒng)內(nèi)逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩(wěn)定性，甚工