肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)基因的篩選與鑒定-動(dòng)物科學(xué)實(shí)踐教學(xué)中心

1、項(xiàng)目類別學(xué)科名稱1學(xué)科代碼1學(xué)科名稱2學(xué)科代碼2項(xiàng)目受理號(hào)一般項(xiàng)目獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)C180803S2011J5043湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目申請(qǐng)書(表二 )項(xiàng)目名稱 ：肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)基因的篩選與鑒定湖南省自然科學(xué)基金委員會(huì)二一年制一、內(nèi)容摘要（不超過400 字）子宮內(nèi)膜炎是造成母牛不孕的主要原因之一，其發(fā)病率高，嚴(yán)重影響著母牛的繁殖與受胎率，而且增加飼料消耗和治療費(fèi)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)的正常發(fā)展。近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)牛子宮內(nèi)膜炎的研究集中在病原菌的分離、鑒定及其對(duì)病原微生物抑制的相關(guān)研究上，然而對(duì)于子宮內(nèi)膜炎的抗病的分子機(jī)制尚不清楚，關(guān)于肉牛子宮內(nèi)膜炎的分子研究未見相關(guān)報(bào)道。本研究

2、擬采用抑制性消減雜交（SSH）方法構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)cDNA文庫(kù)，篩選和鑒定差異表達(dá)基因，為肉牛子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)理和生物治療奠定分子基礎(chǔ)，對(duì)肉牛業(yè)的快速發(fā)展具有重要的意義。二、立項(xiàng)依據(jù)研究意義、 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài)分析，需結(jié)合科學(xué)研究發(fā)展趨勢(shì)來論述科學(xué)意義；或結(jié)合國(guó)民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展中迫切需要解決的關(guān)鍵科技問題來論述其應(yīng)用前景。附主要參考文獻(xiàn)目錄?！卷?xiàng)目的研究意義】子宮內(nèi)膜炎是造成母牛不孕的主要原因之一，其發(fā)病率高，嚴(yán)重影響著母牛的繁殖與受胎率，而且增加飼料消耗和治療費(fèi)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，制約了養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)的正常發(fā)展。根據(jù)病情的急緩和臨床癥狀的輕重，可分為急性型、膿毒血癥型、慢性

3、型和隱性型四種，其中隱性型臨床上難以診斷，潛在對(duì)牛的繁殖性能危害更大1,2 。牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病原因較為復(fù)雜，該病的發(fā)生主要與病源因素、繼發(fā)因素、機(jī)體的激素水平和免疫力等因素有關(guān)。治療方案大多為抗生素治療，近年來隨著廣譜高效抗菌藥物的廣泛使用或?yàn)E用，出現(xiàn)大量的新型耐藥菌株，尤其是多重耐藥菌臨床感染日益增多，同時(shí)伴隨著新耐藥譜的變異。近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)牛子宮內(nèi)膜炎的研究集中在病原菌的分離、鑒定及其對(duì)病原微生物抑制的相關(guān)研究上 3-5 ，然而對(duì)于子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)制尚不清楚，關(guān)于肉牛子宮內(nèi)膜炎的分子研究未見相關(guān)報(bào)道。本研究擬采用抑制性消減雜交（SSH）方法構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)cDNA 文庫(kù)，篩選和

4、鑒定差異表達(dá)基因，為肉牛子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)理和生物治療奠定分子基礎(chǔ)，對(duì)肉牛業(yè)的快速發(fā)展具有重要的意義?！緡?guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀分析】牛子宮內(nèi)膜炎的研究重在奶牛，奶牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)病原因較為復(fù)雜，該病的發(fā)生主要與病源因素、繼發(fā)因素、機(jī)體的激素水平和免疫力等因素有關(guān)2,6 。但是肉牛子宮內(nèi)膜炎也頻繁發(fā)生。其研究情況如下：1. 奶牛子宮內(nèi)膜炎研究進(jìn)展目前，關(guān)于奶牛子宮內(nèi)膜炎的研究較多，包括：（1）主要病原微生物的分離、鑒定和耐藥性分析；（ 2）子宮內(nèi)膜炎的治療方法研究。（ 1）子宮內(nèi)膜炎的主要病原微生物的分離、鑒定和耐藥性分析結(jié)合申請(qǐng)者近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，引起子宮內(nèi)膜炎的細(xì)菌主要有葡萄球菌、鏈球菌、大腸埃希菌、

5、棒狀桿菌、假單胞菌、變形桿菌、生殖器桿菌、嗜血桿菌、乳酸菌、化膿性放線桿菌、壞死性梭菌和擬桿菌等3-5 。劉明春等2009 年研究發(fā)現(xiàn)，可通過病原菌的16SrRNA 進(jìn)行設(shè)計(jì)引物，通過 PCR 方法對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定6 ，發(fā)現(xiàn)隱秘桿菌整合子基因的攜帶與牛子宮內(nèi)膜炎密切相關(guān) 7 ，此外，還發(fā)現(xiàn)奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌耐藥性及其與整合子奶牛子宮內(nèi)膜炎致病性大腸桿菌的耐藥性和多重耐藥性與整合子攜帶有著密切關(guān)系8 。（ 2）子宮內(nèi)膜炎的治療方法研究。用于母牛子宮內(nèi)膜炎治療的藥物主要為各種抗生素、化學(xué)制劑和激素等,但使用這些藥物進(jìn)行治療的主要缺點(diǎn)是細(xì)菌容易產(chǎn)生耐藥性，治療成本較高，易產(chǎn)生藥物殘留和降低子宮的

6、防御機(jī)制 9 。隨之而來， 生物制劑對(duì)子宮內(nèi)膜炎的治療研究納入到研究者的視野之內(nèi)，用微生態(tài)制劑、溶菌酶制劑和免疫制劑治療的應(yīng)用研究已經(jīng)展開10 。生物制劑雖然在奶牛子宮內(nèi)膜炎的治療中已經(jīng)顯示出了較好的療效，但到目前為止，還沒有一種用于防治奶牛子宮內(nèi)膜炎的生物制劑上市，因此還需要進(jìn)行更多的試驗(yàn)研究。2. 肉牛子宮內(nèi)膜炎研究進(jìn)展。迄今為止，關(guān)于肉牛子宮內(nèi)膜炎的研究工作還未開展，但是子宮內(nèi)膜炎潛在的影響著肉牛的繁殖，嚴(yán)重的影響著肉牛的經(jīng)濟(jì)效益。因而，肉牛子宮內(nèi)膜炎的分子機(jī)理研究迫在眉睫。【存在的問題】子宮內(nèi)膜炎受外界因素的影響，與肉牛自身的免疫和抗病能力密切相關(guān)。目前雖然對(duì)于子宮內(nèi)膜炎的發(fā)生基礎(chǔ)和治

7、療研究很多，但是對(duì)于子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)理是什么？其分子機(jī)制又是什么？其機(jī)制尚不清楚。倘若這些研究清楚，我們可采用生物治療的方法，對(duì)子宮內(nèi)膜炎抗性途徑進(jìn)行正向調(diào)控，從而達(dá)到治療的目的?！狙芯克悸泛皖A(yù)期目標(biāo)】1. 研究方法抑制性消減雜交（Suppression Subtractive Hybridization ，SSH）方法是一種篩選組織或細(xì)胞系差異表達(dá)基因的有效方法。1996年 Diatchenko 等將“抑制性 PCR”理論與代表性差異分析相結(jié)合，建立了一種分離差異表達(dá)基因的新方法抑制性消減雜交11 。抑制性消減雜交方法將需要檢測(cè)的組織mRNA 稱為“ tester”，將對(duì)照組織 mRNA

8、稱為“ driver”，以 mRNA 合成 cDNA后，通過僅僅兩輪雜交和兩次PCR過程，就能有效地分離到在tester中表達(dá)，而在 driver 中不表達(dá)或表達(dá)豐度較低的mRNA 。抑制性消減雜交方法通過兩次特異雜交和兩次特異PCR擴(kuò)增使假陽(yáng)性率大大降低，真陽(yáng)性率高達(dá) 94%12 。SSH能得到某種組織中相對(duì)其他組織的差異表達(dá)基因的較全面的信息，它較好地克服了其它方法中低豐度基因難以得到的問題。該技術(shù)與其他分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合，具有假陽(yáng)性率低、敏感性高、效率高等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛應(yīng)用于差異表達(dá)基因的篩選上。2. 研究思路本研究擬采用抑制性消減雜交（SSH）方法構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)cDNA

9、文庫(kù)，篩選和鑒定差異表達(dá)基因，進(jìn)行差異基因的克隆，測(cè)序，為肉牛子宮內(nèi)膜炎的抗病機(jī)理和生物治療奠定分子基礎(chǔ)。3. 預(yù)期目標(biāo)本項(xiàng)目如能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，將對(duì)構(gòu)建子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)cDNA 文庫(kù)，可篩選出差異表達(dá)基因，為闡明子宮內(nèi)膜炎的分子機(jī)制基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究牛子宮內(nèi)膜炎的生物治療提供重要線索。參考文獻(xiàn)1Pleticha S, Heuwieser W. Definitionand diagnosis of chronic endometritis in cattle: a review.Dtsch Tierarztl Wochenschr, 2009,116(5):164-172.2 李世宏 , 楊國(guó)

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12、報(bào) , 2009,29(3): 343-345.7LiuMC,Wu CM,Liu YC, Zhao JC, Yang YL,Shen JZ. Dentification,susceptibility,anddetection of integron-gene cassettes of Arcanobacterium pyogenes in bovine endometritis.J DairySci, 2009, 92(8):3659-3666.8 趙紅霞,李培鋒 , 吳聰明 ,等 .奶牛子宮內(nèi)膜炎大腸桿菌耐藥性及其與整合子關(guān)系的研究. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)2009, 40(1): 142-144.9

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15、erentially expressed genes. Nucleic Acids Res, 1997, 25(13):2598-602.三、研究方案1研究?jī)?nèi)容、研究目標(biāo)以及擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題?！狙芯磕繕?biāo)】篩選肉牛子宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)基因，試圖發(fā)現(xiàn)與肉牛子宮內(nèi)膜炎密切相關(guān)的基因，為子宮內(nèi)膜炎抗病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究肉牛子宮內(nèi)膜炎的生物治療提供重要線索?！狙芯?jī)?nèi)容】第一、構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎SSH消減 cDNA 文庫(kù)。第二、消減 cDNA 文庫(kù)中差異表達(dá)基因的篩選、克隆鑒定。第三、差異表達(dá)基因的表達(dá)譜分析，揭示差異基因在肉牛子宮內(nèi)膜炎中的作用?！緮M解決的關(guān)鍵問題】篩選、克隆和鑒定肉牛子

16、宮內(nèi)膜炎差異表達(dá)基因，確定差異表達(dá)基因在乳牛子宮內(nèi)膜炎中的作用，揭示肉牛子宮內(nèi)膜炎發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制，為肉牛子宮內(nèi)膜炎的快速診斷和治療奠定基礎(chǔ)。2擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實(shí)驗(yàn)方案及可行性分析?！狙芯糠椒ā繕?gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎SSH 消減 cDNA 文庫(kù)消減 cDNA 文庫(kù)的篩選、克隆測(cè)序，進(jìn)行生物信息學(xué)分析差異表達(dá)基因的組織表達(dá)譜分析確定差異表達(dá)基因在肉牛子宮內(nèi)膜炎中的作用【技術(shù)路線 /實(shí)驗(yàn)方案】實(shí)驗(yàn)一、構(gòu)建肉牛子宮內(nèi)膜炎SSH消減 cDNA 文庫(kù)樣品采集（分別采集肉牛正常子宮和患有子宮內(nèi)膜炎的子宮）提取總 RNA 的制備mRNA 的分離、純化mRNA 反轉(zhuǎn)錄為 cDNA接頭連接二輪消減雜

17、交與PCR擴(kuò)增消減效率檢測(cè)連接載體，轉(zhuǎn)化 互補(bǔ)，篩選陽(yáng)性克隆，保存獲得消減 cDNA 文庫(kù)實(shí)驗(yàn)二、從消減cDNA 文庫(kù)中篩選差異表達(dá)基因，并進(jìn)行克隆測(cè)序、組織表達(dá)譜分析，確定其在肉牛子宮內(nèi)膜炎中的作用消減 cDNA 文庫(kù)的篩選標(biāo)記正、反向消減cDNA 和未消減Driver cDNA的探針有效陽(yáng)性克隆的PCR 產(chǎn)物點(diǎn)膜3 張分別進(jìn)行斑點(diǎn)雜交陽(yáng)性克隆篩選（取雜交信號(hào)僅在用正向消減 cDNA 作探針雜交時(shí)出現(xiàn)、或信號(hào)強(qiáng)度明顯高于用反向消減 cDNA 和未消減的 Driver cDNA 作探針雜交時(shí) 5 倍以上者）測(cè) 序生物信息學(xué)分析確定差異表達(dá)基因片段差異表達(dá)基因的組織表達(dá)譜分析初步確定差異表達(dá)基因

18、在肉牛子宮內(nèi)膜炎中的作用【可行性分析】(1) 成熟的相關(guān)技術(shù)項(xiàng)目組成員已經(jīng)熟練掌握本研究所依賴的關(guān)鍵技術(shù)，如消減抑制雜交技術(shù)、基因克隆技術(shù)和基因的生物信息學(xué)分析等相關(guān)的理論和操作技術(shù)，為本項(xiàng)目的開展打下了堅(jiān)實(shí)的的基礎(chǔ)。(2) 較強(qiáng)的研究工作經(jīng)驗(yàn)申請(qǐng)者有多年從事研究工作的經(jīng)驗(yàn)，主持和參與過許多項(xiàng)目的研究，在學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表研究論文和綜述文章多篇。項(xiàng)目組第二成員，獲得動(dòng)物遺傳博士學(xué)位，掌握了cDNA 文庫(kù)構(gòu)建等分子生物學(xué)技術(shù)，在基因分離、克隆和功能研究方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)。項(xiàng)目組第三成員為國(guó)家肉牛疾病控制中心專家組成員，近年來主要從事肉牛、奶牛子宮內(nèi)膜炎和乳房炎等肉牛疾病相關(guān)課題的調(diào)研與科學(xué)研究。2

19、0052006年在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室訪問學(xué)習(xí)期間，開展分子生物學(xué)、微生物學(xué)與免疫學(xué)等領(lǐng)域研究，參與了湖北省奶牛常見病的防治、 1型菌毛體內(nèi)介導(dǎo)沙門氏菌侵襲樹突狀細(xì)胞及對(duì)免疫反應(yīng)的影響等省級(jí)、國(guó)家級(jí)自然科學(xué)基金的部分研究工作；對(duì)實(shí)驗(yàn)必需的先進(jìn)儀器設(shè)備及技術(shù)平臺(tái)相當(dāng)熟悉；其所從事的前期工作為本項(xiàng)目積累了相關(guān)技術(shù)知識(shí)和研究材料。項(xiàng)目組其他組成成員，均為引進(jìn)博士、碩士，具有扎實(shí)的分子生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)方面的理論知識(shí)和相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作技能。申請(qǐng)者和項(xiàng)目組成員有充分的時(shí)間保障從事該項(xiàng)研究。(3) 較完善的研究條件本課題研究依托的創(chuàng)新平臺(tái)是湖南省動(dòng)物學(xué)重點(diǎn)建設(shè)實(shí)驗(yàn)室和動(dòng)物科學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室，所屬學(xué)科動(dòng)物學(xué)學(xué)科為湖南省“十一五”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科。目前擁有近500萬元的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，屬省內(nèi)同類實(shí)驗(yàn)室先進(jìn)水平，圖書資料及信息來源齊全。具有較成熟的技術(shù)分析條件，具備本研究中各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)測(cè)試所需要的相關(guān)儀器設(shè)備。同時(shí)湘西北地區(qū)擁有漣源市天華科技牧業(yè)有限公司、湖南懷化振鑫牧業(yè)有限責(zé)任公司和湖南加華生物科技發(fā)展有限公司，確保實(shí)驗(yàn)材料的供給。項(xiàng)目組第三成員為國(guó)家肉牛體系中心肉牛疾病控制功能研究室科學(xué)家團(tuán)隊(duì)成員，可借助國(guó)家肉