生物催化技術(shù)

1、生物催化技術(shù)摘要：本文主要探討生物催化劑的種類、生物催化酶的制備、表征、應(yīng)用等方面.其中固定化酶有許多粗酶液沒有的特點(diǎn),但制備固定酶首先要經(jīng)過大量復(fù)雜的別離、純化工作,而且一種固定化酶只能用于特定的單步反響,以及對現(xiàn)代生物催化技術(shù)的開展及研究.關(guān)鍵詞：生物催化劑；性質(zhì)；用途；開展引言：生物催化劑是游離的或固定的細(xì)胞或酶的總稱,它們在生物反響中起著催化劑的作用.生物催化是利用生物催化劑,改變通常是加速化學(xué)反響速率,合成有機(jī)化學(xué)品和藥物制品.生物催化涉及三個(gè)學(xué)科的不同局部：化學(xué)中的生物化學(xué)和有機(jī)化學(xué)；生物學(xué)中的微生物學(xué)、分子生物學(xué)和酶學(xué)；化學(xué)工程學(xué)中的催化、傳遞工程和反響工程學(xué).人類很早就知道利用

2、酶和微生物細(xì)胞作為生物催化劑進(jìn)行生物催化已有幾千年歷史,早已創(chuàng)造了麥芽制曲釀酒工藝,古埃及和古代中國都有歷史記載.近現(xiàn)代熟悉酶是與發(fā)酵和消化現(xiàn)象聯(lián)系在一起的.后來創(chuàng)造了“酶這一術(shù)語以表述催化活性,近代科學(xué)技術(shù)對酶的熟悉研究,成為現(xiàn)代酶學(xué)與生物催化研究的根底.現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)以及化工行業(yè)的不斷開展,對于催化劑的要求越來越高,人們不斷探索新的催化技術(shù)以滿足不開展的化工行業(yè)的需求.與化學(xué)工業(yè)相反,生物催化技術(shù)工業(yè)是產(chǎn)銷量不大的行業(yè),主要應(yīng)用與制藥領(lǐng)域及少數(shù)的化工行業(yè)及視頻行業(yè).生物催化技術(shù)對化學(xué)工業(yè)的影響主要是可再生資源的生物加工.自生物技術(shù)誕生之日起,人們就一直致力于把它應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中去.工業(yè)生物

3、催化技術(shù)是生物技術(shù)應(yīng)用中一個(gè)新興和關(guān)鍵的領(lǐng)域.生物催化技術(shù)首先從和它聯(lián)系做緊密的醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)開始,逐漸涉及到化工、材料等行業(yè),并通過它們影響社會生產(chǎn)、生活的各個(gè)方面.美國21實(shí)際開展規(guī)劃中預(yù)計(jì),到2021年,通過生物催化技術(shù),將實(shí)現(xiàn)降低化學(xué)工業(yè)原料消耗、水資源消耗、能量消耗30%,減少污染物的排放和污染擴(kuò)散以蛋白質(zhì)酶的工程應(yīng)用為核心的工業(yè)生物催化技術(shù),被認(rèn)為是生物技術(shù)繼生物醫(yī)藥和轉(zhuǎn)基因植物之后的第三次浪潮.它的開展與應(yīng)用將對人類的工業(yè)化學(xué)過程帶來根本的變革.工業(yè)生物催化的興起與以下的兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)因素有密切的關(guān)系：(1)蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)的出現(xiàn),(2)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的開展.探討了工業(yè)生物催化

4、技術(shù)的現(xiàn)狀和開展趨勢,并對我國如何開展該領(lǐng)域的根底和應(yīng)用研究提出一些見解.1 .生物催化劑的種類及性質(zhì)1.1 生物催化劑的種類：從酶的作用和功能的發(fā)現(xiàn)過程中了解到,人們最早使用的是游離的細(xì)胞活體,即使用這些細(xì)胞中的酶作為生物催化劑；在此根底上考慮將該酶蛋白質(zhì)從細(xì)胞中提取別離出來.比擬純的催化劑形態(tài)進(jìn)行的反響催化,也可以采用固定化技術(shù)將酶或細(xì)胞固定在惰性固體外表后再使用.因此,固定化細(xì)胞和固定化酶又稱固定化催化劑生物催化劑的類別如下：生長細(xì)胞、休止細(xì)胞、凍干細(xì)胞、處理細(xì)胞1.2 生物催化劑的性質(zhì)生物催化劑具有催化高效性,催化種類的專一性及反響條件專一性三大根本性質(zhì).生物催化劑的三大特征決定了生物

5、催化劑的廣泛的用途6.2 .固定化酶的制備方法：2.1 傳統(tǒng)的制備方法：2.1.1 吸附法吸附法是利用物理吸附法,將酶固定在纖維素、瓊脂糖等多糖類或多孔玻璃、離子交換樹脂等載體上的固定方式.顯著特點(diǎn)是：工藝簡便及條件溫和,包括無機(jī)、有機(jī)高分子材料,吸附過程可同時(shí)到達(dá)純化和固定化；酶失活后可重新活化,載體也可再生.但要求載體的比外表積要求較大,有活潑的外表.2.1.2 包埋法包埋固定化法是把酶固定聚合物材料的格子結(jié)構(gòu)或微囊結(jié)構(gòu)等多空載體中,而底物仍能滲入格子或微囊內(nèi)與酶相接觸.這個(gè)方法比擬簡便,酶分子僅僅是被包埋起來,生物活性被破壞的程度低,但此法對大分子底物不適用.1網(wǎng)格型將酶或包埋在凝膠細(xì)微

6、網(wǎng)格中,制成一定形狀的固定化酶,稱為網(wǎng)格型包埋法.也稱為凝膠包埋法.2微囊型把酶包埋在由高分子聚合物制成的小球內(nèi),制成固定化酶.由于形成的酶小球直徑一般只有幾微米至幾百微米,所以也稱為微囊化法.2.1.3 結(jié)合法酶蛋白分子上與不溶性固相支持物外表上通過離子鍵結(jié)合而使酶固定的方法,叫離子鍵結(jié)合法.其間形成化學(xué)共價(jià)鍵結(jié)合的固定化方法叫共價(jià)鍵結(jié)合法.共價(jià)鍵結(jié)合法結(jié)合力牢固,使用過程中不易發(fā)生酶的脫落,穩(wěn)定性能好.該法的缺點(diǎn)是載體的活化或固定化操作比擬復(fù)雜,反響條件也比擬強(qiáng)烈,所以往往需要嚴(yán)格限制條件才能獲得活力較高的固定化酶.2.1.4 交聯(lián)法交聯(lián)法是用多功能試劑進(jìn)行酶蛋白之間的交聯(lián),使酶分子和多功

7、能試劑之間形成共價(jià)鍵,得到三向的交聯(lián)網(wǎng)架結(jié)構(gòu),除了酶分子之間發(fā)生交聯(lián)外,還存在著一定的分子內(nèi)交聯(lián).多功能試劑制備固定化酶方法可分為：1單獨(dú)與酶作用；2酶吸附在載體外表上再經(jīng)受交聯(lián)；3多功能團(tuán)試劑與載體反響得到有功能團(tuán)的載體,再連接酶.交聯(lián)劑的種類很多,最常用的是戊二醛,其他的還有異氟酸衍生物、雙偶氮二聯(lián)苯胺、N,N-乙烯馬來酰亞胺等.交聯(lián)法的優(yōu)點(diǎn)是酶與載體結(jié)合牢固,穩(wěn)定性較高；缺點(diǎn)是有的方法固定化操作較復(fù)雜,進(jìn)行化學(xué)修飾時(shí)易造成酶失活.2.2 新型的制備方法：2.2.1 共價(jià)固定法：酶分子外表存在很多可供利用的化學(xué)基團(tuán).選擇性地利用酶分子外表遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)的特定稀有基團(tuán)(如琉基)進(jìn)行反響,使該基

8、團(tuán)與載體上另一基團(tuán)共價(jià)交聯(lián)來同定酶蛋白,使其活性中央朝向溶液方向,以到達(dá)限制其空間取向的目的.Collioud等化學(xué)合成一個(gè)異雙功能試劑(N-m-3(trifluoromethyl)diazirin-3-ylphenyl4maleimidobutyramide),他們禾用這種雙功能試劑成功地實(shí)現(xiàn)了氨基酸、合成肽和抗體Fab片段的定向固定.Stein等通過衍生全氟疊氮基苯疏水交聯(lián)共價(jià)固定一種脂鏈細(xì)胞蛋白,取得了一致的空間取向.固定后的蛋白質(zhì)分子結(jié)合牢固、穩(wěn)定性佳,不能被離子或非離子去污劑清除.2.2.2 氨基酸置換法：利用基因定點(diǎn)突變技術(shù)在蛋白質(zhì)分子外表適宜位置置換一個(gè)氨基酸分子,通過該氨基酸殘

9、基特殊的側(cè)鏈基團(tuán)限制固定方向.Huang等通過定點(diǎn)突變在枯草蛋白酶(subtil2isin)分子外表遠(yuǎn)離活性中央的位置引入半胱氨酸(Cys殘基.經(jīng)蛋白質(zhì)空間折疊后暴露出Cys,然后利用Cys殘基上的琉基固定枯草蛋白酶分子,取得了較好的固定效果,固定效率和固定后催化活性均有很大提升.2.2.3 抗體耦聯(lián)法：大多數(shù)抗體具有足夠的穩(wěn)定性承受各種活化與偶聯(lián)方法.抗體分子中很多可供偶聯(lián)用的官能團(tuán)可以通過賴氨酸的一氨基或末端氨基、天冬氨酸的B-氨基、谷氨酸的y-氨基或末端竣基進(jìn)行一般性的偶聯(lián).Spitznagel等用碘乙酸活化多孔玻璃珠來定向固定抗體酶(abzyme)48G7-4A1的Fab片段,抗體酶F

10、ab片段保持了很好的催化活性.抗體分子Fc區(qū)的糖鏈局部氧化可產(chǎn)生醛基,醛基與載體上的氨基通過縮合反響可實(shí)現(xiàn)定向固定.醛基假設(shè)與載體上的酰肌通過腺鍵結(jié)合實(shí)現(xiàn)抗體分子的定向固定,與隨機(jī)固定相比,固定后抗體穩(wěn)定性提升的同時(shí)免疫吸附活性也提升了3倍.2.2.4 生物素-親和素親合法：生物素是存在于所有活細(xì)胞內(nèi)但含量甚微(<0,0001%)的中性小分子輔酶.親和素是一個(gè)含有四個(gè)相同亞基的四聚體,每個(gè)亞基均含一個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)(解離常數(shù)105mol/L)0生物素與親和素或相應(yīng)細(xì)菌中的鏈霉親和素有高專一性的、極強(qiáng)的親和力.這種特性使其成為免疫分析、受體研究、免疫組織化學(xué)、基因工程和蛋白質(zhì)別離等領(lǐng)域中獨(dú)

11、特有力的工具.2.2.5 疏水定向固定法：細(xì)胞粘著分子(celladhesionmolecules,CAMs)!介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-底物粘著、細(xì)胞發(fā)育和細(xì)胞信號發(fā)生的分子.細(xì)胞粘著分子和其它細(xì)胞外表分子通常通過疏水作用固定在脂質(zhì)膜上,磷脂錨定是常選擇的方式.接觸位點(diǎn)A糖蛋白是調(diào)節(jié)發(fā)育的細(xì)胞粘著分子,產(chǎn)生于多細(xì)胞發(fā)生早期,通過形成高親和、EDTA穩(wěn)定的接觸位點(diǎn)介導(dǎo)細(xì)胞粘著.接觸位點(diǎn)A糖蛋白可通過神經(jīng)酰胺疏水同定在細(xì)胞外表.疏水定向固定可保持蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、生理活性及天然構(gòu)象.這種通過疏水作用的固定,固定的效率高,固定為非共價(jià),而且固定過程可逆,用去污劑可終止或消除同定應(yīng).Stein等用庚基胺修

12、飾竣甲基葡聚糖載體外表的竣基來疏水固定接觸位點(diǎn)A糖蛋白分子,成功地限制了固定位點(diǎn)的空間取向.用mAb7l特異結(jié)合來檢測csA的活性狀態(tài),mAb71結(jié)合良好,而mAb353那么不能結(jié)合.2.2.6 微波/超聲輔助固定化：微波是一種電磁波,波長為0.1100cmo微波加熱的主要原理是介質(zhì)材料的極性分子在微波高頻電場的作用下反復(fù)快速取向轉(zhuǎn)動(dòng)而摩擦生熱,是從物質(zhì)內(nèi)部開始,瞬時(shí)到達(dá)需要的溫度.微波加熱具有許多傳統(tǒng)加熱不具備的優(yōu)點(diǎn),包括：加熱迅速、均勻,不需要熱傳導(dǎo)過程,內(nèi)外同時(shí)加熱,加熱時(shí)間短；加熱質(zhì)量高,營養(yǎng)破壞少；節(jié)能高效；易于限制功能等超聲波是指振動(dòng)頻率大于20kHz以上的一種縱波,在介質(zhì)中傳播時(shí)

13、,使介質(zhì)發(fā)生物理的和化學(xué)的變化,從而產(chǎn)生一系列超聲效應(yīng),包括熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng).研究認(rèn)為,超聲波對液體化學(xué)反響速度和產(chǎn)率的影響主要是超聲波在液體介質(zhì)中的空化作用,超聲可使液體介質(zhì)中形成微泡,其破裂伴隨能量的釋放,可以提升許多化學(xué)反響的速度.到目前為止,超聲波技術(shù)對物質(zhì)提取,高分子降解,酶解反響等都有很好的促進(jìn)作用.其中超聲波酶解反響具有高效、廉價(jià)、無污染,可提升酶促反響速度和有效成分的產(chǎn)率.3酶固定化原理經(jīng)戊二醛活化的載體具了能與蛋白酶分子的自由氨基反響的基團(tuán),及-CHQ經(jīng)過戊二醛活化的載體與酶蛋白分子的反響機(jī)理是戊二醛的另一個(gè)沒有與為載體相連的-CHO再與酶分子的氨基反響,

14、形成-N=C鍵,從而將酶分子固定在載體上.在參加酶液前必須將過量的戊二醛試劑洗去,由于戊二醛是一種交聯(lián)劑,它能與酶分子交聯(lián),使酶分子之間形成共價(jià)鍵,得到三維網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu).止匕外,戊二醛是蛋白的變性劑,過量的戊二醛本身會使蛋白質(zhì)分子中毒,降低酶的活性,具體反映的機(jī)理如下圖.口日磔加向皿山例4 .生物催化酶的光譜表征：復(fù)原型輔酶NADH的光譜吸收曲線吸收峰分別在260nm和340nm復(fù)原型輔酶NADH的吸收光譜曲線生化谷丙轉(zhuǎn)氨酶檢驗(yàn)試劑的反響原理如下：e酮戊二酸+L-丙氨酸ALT-谷氨酸+丙酮酸初反響丙酮酸+NADH+H+LDH-孚瞰+NAD+主反響NADH的氧化速率與樣本中ALT酶活力成正比,N

15、ADH在340nm處有特征吸收峰,在340nm處測其吸光度的下降速率即可計(jì)算出ALT的活性.5 .固定化酶的應(yīng)用5.1 醫(yī)藥領(lǐng)域固定化月尿酶：月尿酶是專一性催化尿素水解的酶,應(yīng)用于尿素生產(chǎn)限制、產(chǎn)品檢驗(yàn),也廣泛用于臨床醫(yī)學(xué)、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)等,月尿酶的固定化在血液透析中有著極佳的應(yīng)用前景.固定化磷酸酯酶：磷酸酯酶的作用是催化水解低密度脂蛋白上的磷脂的酶,加速體內(nèi)低密度脂蛋白的代謝.人體中的低密度脂蛋白是主要的血漿膽固醇載體,由于其在體內(nèi)代謝緩慢,易形成高血漿膽固醇,以至引起心血管疾病,因此磷酸酯酶的固定化可以應(yīng)用于心血管疾病的治療.固定化葡聚糖酶：葡聚糖酶常用于水解在血液替代品的制備過程中產(chǎn)生的右旋糖

16、酊.5.2 食品行業(yè)：固定化酶應(yīng)用于食品檢測：固定化酶技術(shù)的開展使生物傳感器也得到相當(dāng)大的開展,它不僅使食品成分的高選擇性、快速、低本錢分析測定成為可能,而且生物傳感器技術(shù)的持續(xù)開展將很快實(shí)現(xiàn)食品生產(chǎn)的在線質(zhì)量限制,降低食品生產(chǎn)本錢,并可以保證平安可靠及高質(zhì)量的食品.5.3 環(huán)境保護(hù)：在環(huán)境監(jiān)測方面,固定化酶也可以用于測定有毒物質(zhì)含量以進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測.楊雪梅等選用硅膠、活性炭、大孔樹脂,在一定條件下用物理吸附法固定蛋白酶,3種載體固定的蛋白酶對含高濃度蛋白質(zhì)的淀粉黃漿廢水進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)大孔樹脂對蛋白酶的效果良好,并對含高濃度蛋白質(zhì)的廢水處理效果最好.在廢水處理中,固定化酶也受到了越來越多科學(xué)

17、家的關(guān)注.生活污水和工業(yè)廢水中有害成分主要是氯酚,將辣根過氧化物酶大量吸附在磁石上,可以保證其100%的活力,且凈化效果是粗酶的20多倍.5.4 生物傳感器方面的應(yīng)用：在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,生物傳感器因快速、靈敏、專一、響應(yīng)快等優(yōu)點(diǎn)發(fā)揮著越來越重要的作用.目前,在檢測多種細(xì)菌、病毒及其毒素等多個(gè)方面生物傳感器已有較廣泛應(yīng)用.比方高精度血糖分析儀是采用固定化酶的生物傳感分析儀,其分析精度可以到達(dá)0.5%2%,比家用保健類生物傳感器幾乎高一個(gè)數(shù)量級,比目前醫(yī)用生化分析儀的精度也高2%3%這在血糖分析領(lǐng)域是非常重要的6.酶電極現(xiàn)已用于測定各種糖類、抗生素、氨基酸、有機(jī)酸、脂肪、醇類、胺類以及尿素、尿酸等.5.

18、5 能源利用：近年來不少學(xué)者為了解決能源緊缺問題致力于利用固定化的脂肪酶催化合成生物柴油.高陽等研究了利用多孔滲水物質(zhì)為載體固定脂肪酶,使其可在低水環(huán)境中合成生物柴油.氫氣作為一種清潔能源已引起人們的關(guān)注.有學(xué)者利用聚丙烯酰胺凝膠包埋丁酸梭狀芽抱桿菌IFO3847菌株,可以利用葡萄糖生產(chǎn)氫氣,并且穩(wěn)定性好,無需隔氧6 .固定化酶的研究進(jìn)展固定化酶對提升酶的穩(wěn)定性,拓展酶的應(yīng)用領(lǐng)域具有非常重要的意義.目前常用固定化方法普遍存在固定化使用試劑和載體本錢高,固定化過程中酶的構(gòu)象受到影響及底物結(jié)合部位和活性中央受載體封閉所引起的酶活損失較大,固定化操作過程繁瑣等缺點(diǎn),限制了固定化酶的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用.針對當(dāng)

19、前固定化酶載體和方法的缺乏,本文采用反相懸浮包埋法合成磁性瓊脂糖微球,經(jīng)環(huán)氧氯丙烷和亞氨基二乙酸處理使微球帶上螯合基團(tuán),經(jīng)吸附銅離子后,制備了磁性瓊脂糖一亞氨基二乙酸IDA-Cu2僉屬螯合載體,利用該載體定向固定了木瓜蛋白酶,固定化最適條件為Cu2+1.5X10-2mol/g載體、固定化時(shí)間4h、固定化pH7.0、給酶量30mg/g載體.固定化酶的最適反響溫度70C、最適反響pH8.0,固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯高于溶液酶,固定化酶活力回收為68.4%,且有較好的操作穩(wěn)定性,載體重復(fù)使用5次后固定化酶酶活為首次固定化酶79.71%.本文研究了利用金屬螯合載體固定多酚氧化酶時(shí),固定化酶的性質(zhì).得出固

20、定化酶的最適反響溫度為50C,最適反響pH值7.0,固定化酶的酸堿耐受性明顯好于溶液酶,固定化酶反復(fù)使用6次,酶活仍保存50%左右,固定化載體可以反復(fù)使用5次,仍保持良好的性能.在使用金屬螯合載體固定化酶時(shí),固定化反響條件溫和,對酶的高級結(jié)構(gòu)影響小,酶活回收高；固定化酶的熱穩(wěn)定性明顯提升；載體的再生、酶的固定化過程操作簡單；固定化酶及載體可屢次重復(fù)利用,固定化酶生產(chǎn)本錢低.因此該技術(shù)在工業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景.高分子微球具有一定的化學(xué)和機(jī)械穩(wěn)定性,能反抗微生物和酸堿的作用,是優(yōu)良的固定化酶載體材料.針對制備高活性、高穩(wěn)定性固定化酶對載體材料的性能要求,評述了高分子微球的組成和功能性基團(tuán)的可設(shè)計(jì)性、粒徑與形態(tài)可控性、多孔和大比外表積等結(jié)構(gòu)性質(zhì),概括了載體結(jié)構(gòu)性質(zhì)對固定化酶催化活性的影響規(guī)律,提出了對不同性質(zhì)的生物酶"量體裁衣",設(shè)計(jì)制備特效的載體材料是高分子微球固定化酶研究的開展趨勢.同時(shí)介紹了固定化青霉素?；负凸潭ɑ久冈诠I(yè)催化領(lǐng)域的應(yīng)用.首先用分相法和填充法制作了兩種多孔玻璃微珠FXB5口TCBL用它們作為載體分別用物理吸附法、共價(jià)偶聯(lián)法和重氮法固定了a-淀粉酶,在對它們的固定效果比擬后,選取了共價(jià)偶聯(lián)法進(jìn)行了較詳細(xì)的研究；