細(xì)胞轉(zhuǎn)染的步驟

1、轉(zhuǎn)染8添加義項(xiàng)DNA小片段插入體細(xì)胞或細(xì)胞系的過(guò)程。若此DNA未與宿主細(xì)胞DNA整合而獲表達(dá)，稱(chēng)“瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（transienttransfectionf：若與宿主細(xì)胞DNA整合并隨后者的發(fā)制而復(fù)制稱(chēng)"穩(wěn)定轉(zhuǎn)染（stabletransfectionfo10本詞條正文缺少必要目錄或最新動(dòng)態(tài)，歡迎各位編輯詞條，額外獲取10個(gè)積分基本信息中文名稱(chēng)轉(zhuǎn)染外文名稱(chēng)transfection過(guò)程真核細(xì)胞由于外源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過(guò)程。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染transienttransfection穩(wěn)定轉(zhuǎn)染stabletransfection目錄展開(kāi)基本簡(jiǎn)介轉(zhuǎn)染(transfection)指其核細(xì)胞由于外

2、源DNA摻入而獲得新的遺傳標(biāo)志的過(guò)程。常規(guī)轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類(lèi)是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(永久轉(zhuǎn)染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色體中，因此一個(gè)宿主細(xì)胞中可存在多個(gè)拷貝數(shù)，產(chǎn)生高水平的表達(dá)，但通常只持續(xù)幾天，多用于啟動(dòng)了和其它調(diào)控元件的分析。般來(lái)說(shuō)，超螺旋質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染效率較高，在轉(zhuǎn)染后24-72小時(shí)內(nèi)(依賴(lài)于各種不同的構(gòu)建)分析結(jié)果，常常用到一些報(bào)告系統(tǒng)如熒光蛋白，B半乳糖苜酶等來(lái)幫助檢測(cè)。后者也稱(chēng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，外源DNA既可以整合到宿主染色體中，也可能作為一種游離體(episome)存在。盡管線(xiàn)性DNA比超螺旋DNA轉(zhuǎn)入最低但整合率高。外源DNA整合到染色體中概率很小，大約1/

3、104轉(zhuǎn)染細(xì)胞能整合，通常需要通過(guò)一些選擇性標(biāo)記，如來(lái)氨丙基轉(zhuǎn)移辭(APH：新霉素抗性基因)，潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移的(HPH),胸仔激幽(TK)等反復(fù)篩選，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的同源細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染技術(shù)的選擇對(duì)轉(zhuǎn)染結(jié)果影響也很大，許多轉(zhuǎn)染方法需要優(yōu)化DNA與轉(zhuǎn)染試劑比例，細(xì)胞數(shù)量,培養(yǎng)及檢測(cè)時(shí)間等。相關(guān)分類(lèi)化學(xué)轉(zhuǎn)染法包括：1.DEAE前聚糖法，2.磷懵鈣法，3.人工脂質(zhì)體法。DEAE葡聚糖是最早應(yīng)用哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑之一，DEAE.前聚糖是陽(yáng)離子多聚物，它與帶負(fù)電的核酸結(jié)合后接近細(xì)胞膜而被攝取，用DEAE-的聚糖轉(zhuǎn)染成功地應(yīng)用于瞬時(shí)表達(dá)的研究，但用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染卻不是十分可靠。磷酸鈣法是磷酸鈣共沉淀轉(zhuǎn)染法，因?yàn)?/p>

4、試劑易取得，價(jià)格便宜而被廣泛用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的研究，先將DNA和氯化鈣混合，然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸鈣沉淀，最后把含仃沉淀的混懸液加到培養(yǎng)的細(xì)胞上，通過(guò)細(xì)胞胞膜的內(nèi)吞作用攝入DNA,磷酸鈣似乎還通過(guò)抑制血清中和細(xì)胞內(nèi)的核酸酶活性而保護(hù)外源DNA免受降解.人工脂質(zhì)體法采用陽(yáng)離子脂質(zhì)體，具有較高的轉(zhuǎn)染效率，不但可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，而且還能轉(zhuǎn)染從寡核仃酸到人工酵母柒色體不同長(zhǎng)度的DNA,以及RNA,和蛋白質(zhì).此外，脂質(zhì)體體外轉(zhuǎn)染同時(shí)適用于瞬時(shí)表達(dá)和穩(wěn)定表達(dá)，與以往不同的是脂質(zhì)體還可以介導(dǎo)DNA和RNA轉(zhuǎn)入動(dòng)物和人的體內(nèi)用于甚因治療。人工合成的陽(yáng)離子脂質(zhì)體和帶負(fù)電荷

5、的核酸結(jié)合后形成復(fù)合物，當(dāng)復(fù)合物接近細(xì)胞膜時(shí)被內(nèi)吞成為內(nèi)體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，隨后DNA復(fù)合物被釋放進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，至于DNA是如何穿過(guò)核膜的,其機(jī)理目前還不十分清楚.物理方法包括：顯微注射電穿孔基因槍等，顯微注射雖然費(fèi)力，但是非常行效的將核酸導(dǎo)入細(xì)胞或細(xì)胞核的方法。這種方法常用來(lái)制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，但卻不適用于需要大量轉(zhuǎn)染細(xì)胞的研究。電穿孔法常用來(lái)轉(zhuǎn)染如植物原生質(zhì)體這樣的常規(guī)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。電穿孔常脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。導(dǎo)入的效率與脈沖的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間有關(guān)系，基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)，這種方法適用于培養(yǎng)的細(xì)胞核在體的細(xì)胞.相關(guān)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)和掌握外源基因

6、導(dǎo)入真核細(xì)胞的主要方法一脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。了解外源基因進(jìn)入的一般性方法，觀(guān)*測(cè)外源蛋白的表達(dá)（綠色熒光蛋白），為染色準(zhǔn)備實(shí)臉材料。實(shí)驗(yàn)原外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入：璘酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過(guò)直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞;病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大：病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響：所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)

7、染法最重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問(wèn)他，通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索的合道轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體是promega公司的TransFast脂質(zhì)體試劑，它是一種陽(yáng)離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體的混合物，是對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)中采用的293T細(xì)胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑?！睂?shí)驗(yàn)材料（1）材料293T細(xì)胞、MyoD表達(dá)質(zhì)粒和EGFP表達(dá)質(zhì)粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素（雙抗）、FCS（小牛血清）、PBS（磷酸鹽緩沖溶液）、胰酹/EDTA消化液、轉(zhuǎn)染試劑（TransFast）（2）器材20W200ul/1ml微量移液器和T

8、ip頭酒精燈、廢液缸、血球計(jì)數(shù)板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺(tái)式離心機(jī)、35mm培養(yǎng)皿、轉(zhuǎn)染管、15ml離心管、觀(guān)察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞傳代（1）試驗(yàn)準(zhǔn)備：200111/lmlTip頭各一盒（以上物品均需高壓滅菌），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。轉(zhuǎn)染(3)用Tip頭加入ImITrypsin液，消化1分鐘(37。C,5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶型，觀(guān)察到細(xì)胞完全從壁上脫落卜來(lái)為止。(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。(5)用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開(kāi)。(6)將培養(yǎng)液裝入離心管

9、中，10OOrpm離心5min。(7)用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)HII中，使其均勻分布。(9)將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染1)轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備A.將400ul去核酸醐水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。B.震蕩后將試劑放在一20攝氏度保存，使用前還需震蕩，。2)選擇合適的混合比例(1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量)來(lái)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無(wú)血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)最的MyoD或者EGFP的DNA,震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。5

10、)將混合液在室溫放置1015分鐘。6）吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無(wú)血清培養(yǎng)基清洗一次。7）加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。8）到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類(lèi)決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2448小時(shí)。第二次細(xì)胞傳代1）在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀(guān)察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。2）再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新粉入培養(yǎng)皿中。3）在正常條件卜培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。研究進(jìn)展轉(zhuǎn)染技術(shù)國(guó)際上推出了一些陽(yáng)離子聚合物基因轉(zhuǎn)變絲生以其適用宿主范圍廣，操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效率高受到研究者們的青睞。其中樹(shù)枝狀聚

11、合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine,PEI）的轉(zhuǎn)染性能最佳，但樹(shù)枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽(yáng)離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個(gè)碳個(gè)原子，即每"第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”（protonsponge。這種聚陽(yáng)離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹(shù)枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。大量實(shí)驗(yàn)證明，PEI是非常有希望的基因治療我體。目前在設(shè)計(jì)更更雜的基因我體時(shí)，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。轉(zhuǎn)染效率線(xiàn)型PEI(LinePEl.LPEI)與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI(BranchedPEl.BPEI)要早一些，過(guò)去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)分物的細(xì)胞毒性較低，仃利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但最近研窕表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含行生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的