第十四章免疫細胞的分離及其表面標志檢測技術

1、第十四章免疫細胞的分離及表面標志檢測技術第十五章免疫細胞功能檢測技術SeparationandAssaysforImmunocyte第一部分目的要求和教學內容一、目的要求掌握：Ficollhypaque分層液分離PBMC勺原理、方法，淋巴細胞亞群分離的原理、方法及應用，T細胞增殖試驗的方法，B細胞的數(shù)量及功能的檢測，NK細胞的活性、中性粒細胞、巨噬細胞功能的檢測方法；熟悉：T細胞功能的體內試驗、T細胞介導的細胞毒檢測的方法；了解：淋巴細胞的純化與亞群分離的方法、吞噬細胞的分離方法、溶血空斑試驗。二、教學內容1 免疫細胞的分離與純化：細胞的分離，外周血單個核細胞的分離，淋巴細胞的純化與亞群分離，

2、吞噬細胞的分離。2 淋巴細胞的數(shù)量檢測：T細胞數(shù)量檢測，B細胞數(shù)量檢測。3 淋巴細胞的功能檢測：T細胞功能檢測，B細胞功能檢測，NK細胞活性測定。4 吞噬細胞功能檢測：中性粒細胞功能檢測，巨噬細胞功能檢測。第二部分測試題一、選擇題（一）單項選擇題（A型題）1 外周血中的單個核細胞主要是指A. 淋巴細胞B. 嗜酸粒細胞C. 單核細胞一淋巴細胞D. 單核細胞E. 中性粒細胞2 .分離人外周血淋巴細胞分層液的最佳密度為A. 1.030B. 1.035C. 1.092D. 1.020E. 1.0773 .用FicolIhypaque分層液分離PBMC分離的PBMd位于試管的A. 血漿層之上B. 血漿層

3、之中C. 血漿層與分層液之間D. 分層液之中E. 試管底部4. 用玻璃纖維或葡聚糖凝膠Sephadex-G10柱分離細胞時，從柱上洗脫下的細胞主要是A.粒細胞B. 淋巴細胞C. 單核細胞D. T細胞E. B細胞5. 能與SRB（占合形成E花環(huán)的細胞主要是A. T細胞B. B細胞C. 單核細胞D. 粒細胞E. 血小板6用小鼠抗人CD3單克隆抗體檢測T細胞，其結果代表的是A. T細胞總數(shù)B. Th胞數(shù)C. Ts細胞數(shù)D. cd4細胞數(shù)E. cd8胞數(shù)7. 用尼龍棉柱分離細胞時，不易黏附尼龍棉纖維而被洗脫的細胞是A. 粒細胞B. B細胞C. 單核細胞D. T細胞E. 血小板8. 表示淋巴細胞的活力常

4、用A. 活淋巴細胞占總淋巴細胞的百分比B. 活細胞濃度C. 淋巴細胞濃度D. 活細胞和總細胞的比值E. T細胞和B細胞的比例9. 用腹腔滲出法可從動物的腹腔滲出液中分離出A. 血小板B. B細胞C. 單核細胞D. T細胞E. 巨噬細胞10. 活細胞經(jīng)臺盼藍染色后呈A. 藍色B. 棕色C. 紅色D. 不著色E. 天青色11. 熒光標記法計數(shù)外周血B淋巴細胞，檢測的特有的表面標志是A. CDl9B. CD20C. 補體受體DSmIgEFcR12. NKffl胞特有的表面抗原是ACD2B. CDl6C. 無特異的表面抗原D. CD23E. CD5613僅能使T細胞發(fā)生淋巴母細胞轉化的因子是A. PH

5、AB. PWMC. .LPSD. ConAE. EBV14. 能使B細胞和T細胞發(fā)生淋巴母細胞轉化的因子是A. PHAB. PWMC. .LPSD. SPAE. EBV15. 檢查體液免疫功能最常用的方法是A. 血清免疫球蛋白定量測定B. 溶血空斑試驗C. B淋巴細胞計數(shù)D. 淋巴母細胞轉化試驗E.SmlgG測定16溶血空斑試驗用于檢測下列何種細胞的功能A. T細胞B. B細胞C. 中性粒細胞D. 吞噬細胞E. N陸田胞17. 測定T淋巴細胞功能的體內試驗是A. 錫克試驗B. 狄克試驗C. 結核菌素試驗D. 天然血型抗體滴度E. 血清：IgG測定18. 正常人外周血T淋巴細胞轉化率為A<

6、40B. 40%50%C. 60%80%D80%E>90%19常用檢測細胞毒效應的方法是A. 3H-TdR摻人法B125I釋放法C. 51Cr釋放法D. 形態(tài)學檢測法E. CD8檢測法20. 包被有抗Ig抗體的親和板，其吸附的是A. T細胞B. B細胞C. NK細胞D. NKT'細胞E. 吞噬細胞21. Ficollhypaque液分離淋巴細胞是一種A. 不連續(xù)密度梯度離心法B. 連續(xù)密度梯度離心法C. 親和層析法D. 離子交換層析法E. 自然沉降法22. Ficollhypaque淋巴細胞分離液的主要成分是A. 聚蔗糖B. 泛影葡胺C. 聚乙二醇D. 聚蔗糖+泛影葡胺E. 聚蔗

7、糖+聚乙二醇23. Percoll分離液的主要成分是A. 聚蔗糖B. 泛影葡胺C. 聚乙二醇D. 聚乙烯吡咯烷酮E.經(jīng)聚乙烯吡咯烷酮處理的硅膠顆粒24. 檢測中性粒細胞殺菌功能的方法是A. NBT還原試驗B. 白細胞計數(shù)C. 溶血空斑試驗D. 淋巴母細胞轉化試驗E. 補體介導的細胞毒試驗25. MTT比色法檢測IL-2活性，下列哪項是錯誤的A. 需要IL一2依賴細胞株B. 增殖細胞具有吸收MTT勺能力C. 顏色的深淺代表細胞代謝活性的強弱D. 可反映B細胞的功能E.可反映T細胞的功能（二）多項選擇題（x型題）1淋巴細胞分離液要求符合的條件有A對細胞無毒B. 高滲C. 不溶于血液D無色E. 有合

8、適的比重2與T細胞計數(shù)有關的表面抗原是A.CD2B. CD3C. CD4D.CD8E. CDl93. 與B細胞計數(shù)有關的表面標志是A.SmIgB. CDl9C. CD20D.CD21E. CD24. 符合淋巴母細胞轉化的形態(tài)學特征有A.細胞體積變小B. 核仁明顯、核染質疏松C.可見有絲分裂D. 胞漿極少，呈天青色E.胞內可見空泡5. 用酶聯(lián)免疫斑點試驗檢測B細胞功能的優(yōu)點有A.穩(wěn)定、特異B.可檢測抗體分泌細胞C.可檢測抗體的分泌量D.可同時進行B細胞計數(shù)E.可同時檢測不同抗原誘導的不同抗體的分泌6. 細胞免疫功能測定包括以下哪些A. T細胞計數(shù)B. B細胞計數(shù)C. T細胞功能測定D.Tc細胞效

9、應測定E. 細胞因子測定7檢測淋巴細胞亞群常用的方法有A免疫熒光法B. 流式細胞儀測定C. 酶免疫組化法D放射免疫法E. 免疫金染色法8細胞免疫功能體內試驗方法有A細胞毒試驗B. 混合淋巴細胞反應C. 皮膚試驗D淋巴細胞增殖試驗E.接觸性過敏試驗9. T細胞增殖試驗常用的檢測方法有A流式細胞儀法B. 形態(tài)學方法C. 51Cr釋放法D.MTT檢測法E.3H一FdF摻人法10檢測吞噬細胞功能的方法有A. 吞噬試驗B. 殺菌試驗C. NBT還原試驗D. 化學發(fā)光測定法E趨化功能測定法11淋巴細胞亞群的分離方法有A. E花環(huán)分離法B. 尼龍棉柱分離法c親和板結合分離法D. 免疫磁珠分離法E. 超速離心

10、分離法12. T細胞數(shù)量檢測包括A. T細胞增殖試驗B. 間接熒光免疫法C. 酶免疫組織化學法D. 微量細胞毒試驗E. 花環(huán)技術13. 檢測T細胞數(shù)量的花環(huán)試驗有A. 酵母菌花環(huán)試驗B. 補體C3b花環(huán)試驗C. E花環(huán)試驗D. 葡萄球菌花環(huán)法E. 抗體致敏細胞花環(huán)法14. B細胞表面具有、AmIgB. C抗原C. Fc受體D. 補體受體E. EB病毒受體15. B細胞數(shù)量檢測的方法包括A. mIg的檢測法B. C抗原檢測法C. Fc受體檢測法D. 補體受體檢測法E. 小鼠紅細胞受體檢測法16. B淋巴細胞功能的測定方法有A. B細胞增殖試驗B. 溶血空斑試驗C. 酶聯(lián)免疫斑點法D. 體內測定法

11、E. 形態(tài)學檢查法17. 中性粒細胞吞噬和殺菌功能的測定方法A. 形態(tài)學檢查法B. 顯微鏡檢查法C. 溶菌法D. NBT還原試驗E化學發(fā)光測定法18. 巨噬細胞功能的檢測方法包括A. 炭粒廓清試驗B. 吞噬功能檢測C. 巨噬細胞溶酶體酶測定D. 細胞毒作用測定E. 巨噬細胞促凝血活性測定（三）配伍題問題1-3A. 紅細胞層B. 粒細胞層C. 單個核細胞層D. 血漿與血小板層E. 淋巴細胞分離液層1. 采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，最上層是2. 采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，最下層是3. 采用淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，第二層是問題4-6A.淋巴細胞轉化試驗B.溶血空

12、斑試驗C.炭粒廓清試驗D.瓊脂糖凝膠平板法E. 化學發(fā)光測定法4. 巨噬細胞吞噬功能的檢測：5. 中性粒細胞趨化功能的檢測：6. 中性粒細胞吞噬和殺菌功能的檢測：二、填空題1. PBM包括（）和（）。2. 在反相溶血空斑試驗中，每一個空斑代表一個（）。3. B細胞表面特異的標志是（）。4. 常用的測定淋巴細胞活力的方法是（）。5. 淋巴細胞轉化情況的判定方法有（）、（）和（）。6淋巴細胞轉化試驗應用的同位素是（7分離外周血白細胞常用的方法是（）8去除白細胞懸液中殘留紅細胞的常用方法有（9去除單個核細胞懸液中單核細胞的常用方法有（10. 檢測T纟田胞數(shù)量的花環(huán)技術包括（）花環(huán)技術主要有（）和（）

13、。11. 淋巴田胞和單核田胞的密度為（）。12. 外周血經(jīng)Ficoll分離液離心后從上到下分為（），田胞毒試驗應用的同位素是（）和（）。）和（）。）和（）。（）和（）；檢測B細胞數(shù)量的）（）及（）層。三名詞解釋1 .外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）2. E花環(huán)試驗（erythrocyterosettetest）3. 淋巴母細胞轉化試驗（1ymphoblasttransformationassay）4. 溶血空斑試驗hemolyticplaqueassay）5. 四唑氮藍還原試驗（nitrobluetetrazoliumrecoverya

14、ssay,NB還原試驗）四、簡答題1. 簡述T淋巴細胞轉化的試驗原理和鏡下淋巴細胞轉化形態(tài)學特征。2 .敘述T細胞介導的細胞毒試驗的原理、意義和方法分類3測定吞噬細胞功能有哪些常用方法?五論述題簡述Fic011一hypaque分離液分離PBM的原理、步驟和注意事項。第三部分參考答案與題解、選擇題（一）單項選擇題（A型題）1C2E3C4B5A6A7D8A9.E10D11D12C13A14B15A16B17C18C19C20-B21A22D23E24A25D（二）多項選擇題（X型題）1ACDE2ABCD3ABCD4BCE5ABCDE6ACDE7ABCE8CE9BDE10ABCDE11ABCD12B

15、CDE13CDE14ABCDE15ABCDE16ABCD17BCDE18ABCDE（三）配伍題1.D2.A3.C4.C5.D6.E、填空題1淋巴細胞單核細胞2.分泌Ig的細胞3SmIg4臺盼藍染色法5.形態(tài)學方法。HTdR摻入法MTI"檢測法3516H，Cr7自然沉降法聚合物加速沉降法&無菌蒸餾水低滲裂解法0.83%氯化銨處理法9黏附去除法，羰基鐵粉吞噬去除法10. E花環(huán)試驗葡萄球菌花環(huán)法抗體致敏紅細胞花環(huán)法EA花環(huán)試驗EAC花環(huán)試驗11. 淋巴細胞和單核細胞的密度為1.077+0.001。12. 外周血經(jīng)Ficoll分離液離心后從上到下分為血清_,_PBM及_粒細胞、紅細

16、胞層。三、名詞解釋1. PBMC:外周血單個核細胞主要指淋巴細胞和單核細胞，是免疫學實驗中最常用的細胞群，也是進行T細胞和B細胞分離純化的重要環(huán)節(jié)。2. E花環(huán)試驗：T細胞表面有特異性綿羊紅細胞(SRBC)受體，即E受體。將T細胞與SRBc按一定比例混勻，置4h至少2h或過夜，T細胞表面的E受體能與SRBC結合形成以T細胞為中心，四周環(huán)繞SRBC的花環(huán)樣結構，鏡檢計數(shù)可得總花環(huán)(Et)形成率，亦即T細胞的百分率。3. 淋巴母細胞轉化試驗：細胞在體外受到有絲分裂原或抗原的刺激后，細胞出現(xiàn)一系列的增殖反應，主要表現(xiàn)為胞內蛋白質和核酸合成增加，并發(fā)生形態(tài)返祖變化，如細胞變大、胞質增多、胞質出現(xiàn)空泡、

17、核染色質疏松、核仁明顯，這種淋巴細胞增殖反應又稱淋巴細胞母細胞轉化(1ymphoblasttransformation)。4. 溶血空斑試驗：該方法用于檢測實驗動物抗體形成細胞數(shù)目。其基本原理是抗體形成細胞分泌的Ig與SRBc上的抗原結合，在補體作用下出現(xiàn)溶血反應。方法是將SRBC與其免疫的小鼠脾細胞、補體及適量瓊脂糖液混合傾注平板，或者將吸附有已知抗原的SRBc與待檢B細胞、補體及適量瓊脂糖液混合傾注平板，溫育一定時間，抗體形成細胞釋放的抗體會使周圍SRBc致敏，并在補體作用下出現(xiàn)肉眼可見的溶血空斑，每一空斑中央含有一個抗體形成細胞，因此空斑數(shù)量即代表抗體形成細胞數(shù)。5. NBT還原試驗：活

18、化的中性粒細胞與NBT起溫育，由于中性粒細胞吞噬殺菌過程中產(chǎn)生超氧陰離子(O2-)，使被吞進細胞內的NBT由原來呈淡黃色還原成不溶性的藍黑色顆粒，沉積在細胞漿中，稱為NBT陽性細胞。光學顯微鏡下計數(shù)NBT陽性細胞，其百分率可反映中性粒細胞的殺菌功能。四、簡答題1.T淋巴細胞轉化試驗原理：T淋巴細胞在受到非特異性有絲分裂原或特異性抗原刺激后能發(fā)生增殖反應，細胞代謝旺盛，蛋白質和核酸合成增加；與此同時細胞體積增大，分裂呈母細胞樣，此為淋巴細胞轉化現(xiàn)象。因此可借助形態(tài)學方法觀測淋巴細胞形態(tài)變化情況，3H胸腺嘧啶核苷(3HFdR)摻入法測定DNA合成情況，或MTT比色法測定線粒體代謝活性即可判定淋巴細

19、胞轉化程度。鏡下淋巴細胞形態(tài)可以見到以下幾種類型。(1) 淋巴母細胞胞體比未轉化淋巴細胞大34倍，呈圓形或橢圓形，胞漿染色淡藍，可有偽足、空泡，細胞核增大，核質疏松，呈細網(wǎng)狀，可見分裂現(xiàn)象。(2) 過渡型淋巴細胞形態(tài)介于淋巴母細胞和正常淋巴細胞之間，體積稍大，多為1215m胞漿稍多，淡藍色，核稍大，核質疏松。注意與大淋巴細胞區(qū)別，后者雖然體積較大，但核質致密，胞漿較少，嗜堿性強。(3) 正常淋巴細胞與未經(jīng)刺激的淋巴細胞一樣，體積小，核質致密，胞漿少，嗜堿性強。3. 細胞毒T細胞(CTL)在體外能特異性殺傷帶有相同抗原的某些敏感傳代瘤細胞株(靶細胞)。將適當?shù)陌屑毎麘乙喊匆欢ū壤c受檢淋巴細胞混

20、合，培養(yǎng)數(shù)小時后觀察靶細胞的破壞情況可判斷受檢者的CTL殺傷能力，進而判斷其細胞免疫狀態(tài)。常用方法有形態(tài)學檢查法和51Cr釋放法。CTL殺傷功能測定是體外檢測機體細胞免疫功能的一種常用方法。利用靶抗原與淋巴細胞的相互關系闡明靶細胞的抗原性；用于判斷腫瘤患者的預后及免疫治療效果；觀察藥物、腫瘤抗原以及其他抗原對CTL殺傷功能的影響；鑒定淋巴細胞的功能性亞群等。4. 吞噬細胞功能測定從趨化、吞噬和殺菌三個方面進行檢測。常用的方法：趨化功能測定的有濾膜滲透法、瓊脂平板法，吞噬功能測定的有吞噬試驗，殺菌功能測定的有NBT還原試驗、殺菌功能試驗、化學發(fā)光試驗等方法。五. 論述題2. Ficollhypaque分離液分離PBMC勺原理：血液單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。人外周血單個核細胞的密度為1.0501.077，而粒細胞和紅細胞的密度在1.0901.093。利用密度為1.077±0.001的Ficollhypaque分層液，將待分離的細胞懸液小心鋪于其上，經(jīng)離心后單個核細胞懸浮