生化技術：10固定化的酶與微生物匯總

1、 第十章第十章 固定化的酶與微生物固定化的酶與微生物 一、固定化的酶與固定化微生物的概念一、固定化的酶與固定化微生物的概念 是一類由生物細胞產(chǎn)生的具有催化功能的生是一類由生物細胞產(chǎn)生的具有催化功能的生物大分子（蛋白質），通常稱作生物催化劑物大分子（蛋白質），通常稱作生物催化劑酶酶:l固定化酶固定化酶(inmobilized enzyme)(inmobilized enzyme) 是用適當?shù)奈锢怼⒒瘜W方法把純化的是用適當?shù)奈锢?、化學方法把純化的酶固定于一定的空間內(nèi)，使其成為既保持了酶固定于一定的空間內(nèi)，使其成為既保持了本身的特性，又能在連續(xù)反應之后可以本身的特性，又能在連續(xù)反應之后可以回收回收和

2、重復使用和重復使用的一種制品的一種制品 是用適當?shù)奈锢怼⒒瘜W方法把純化的是用適當?shù)奈锢?、化學方法把純化的微生物固定于一定的空間內(nèi)，使其成為既保持固定于一定的空間內(nèi)，使其成為既保持了本身的特性，又能在連續(xù)反應之后可以回了本身的特性，又能在連續(xù)反應之后可以回收和重復使用的一種制品收和重復使用的一種制品 固定化微生物固定化微生物l固定化酶和固定化微生物的研究歷史固定化酶和固定化微生物的研究歷史: 1916年年Nelson和和Griffin發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn) :有些酶雖然不溶于水，但是仍存在催化活有些酶雖然不溶于水，但是仍存在催化活性現(xiàn)象性現(xiàn)象 1953年年Grubhofer和和Schleith真正開始固定化酶

3、的研究真正開始固定化酶的研究1960年之后，年之后，Katzir-Katchalski學派對酶的固定方法和固定化酶的理化學派對酶的固定方法和固定化酶的理化性質做了大量的工作，并將其成功地應用于工業(yè)生產(chǎn)性質做了大量的工作，并將其成功地應用于工業(yè)生產(chǎn) 1969年千煙一郎也成功地將固定化氨基酰化酶應用于年千煙一郎也成功地將固定化氨基?；笐糜贒L-氨基酸的光學氨基酸的光學拆分過程，使其反應實現(xiàn)了連續(xù)化拆分過程，使其反應實現(xiàn)了連續(xù)化 1973年千煙一郎研制成了大腸桿菌年千煙一郎研制成了大腸桿菌(Ecoli)的固定化細胞，即所謂的固定化細胞，即所謂固定固定化微生物化微生物，并將其用于連續(xù)生產(chǎn)，并將其用

4、于連續(xù)生產(chǎn)L-天門冬氨酸過程。天門冬氨酸過程。 固定化微生物雖然僅較固定化微生物雖然僅較適用于催化小分子物質適用于催化小分子物質的轉化的轉化，并伴隨發(fā)生分解生成物等，并伴隨發(fā)生分解生成物等副反應副反應，但它工，但它工序簡單、穩(wěn)定性好、酶活力喪失少、成本低廉，以序簡單、穩(wěn)定性好、酶活力喪失少、成本低廉，以及利用其固有的多酶系統(tǒng)可對有機體的代謝途徑進及利用其固有的多酶系統(tǒng)可對有機體的代謝途徑進行研究行研究l固定化微生物的特點固定化微生物的特點: 本章將就固定化的酶與微生物的制備方法及其本章將就固定化的酶與微生物的制備方法及其制品的制品的性質和應用性質和應用進行討論進行討論 三、固定化酶三、固定化酶

5、的制備的制備（一）酶固定化的前提條件（一）酶固定化的前提條件 酶的活性中心酶的活性中心(催化部分催化部分)和空間結構和空間結構(結合部結合部分分)的維持是其具有催化活力的必需條件。因此，的維持是其具有催化活力的必需條件。因此，在制備固定化酶時，要盡可能避免采用劇烈的在制備固定化酶時，要盡可能避免采用劇烈的條件（過高的溫度和鹽濃度、強酸和強堿，以條件（過高的溫度和鹽濃度、強酸和強堿，以及各種有機溶劑等）處理。否則，酶的催化作及各種有機溶劑等）處理。否則，酶的催化作用會降低，甚至喪失，或者改變酶對底物的專用會降低，甚至喪失，或者改變酶對底物的專一性一性 （二）（二）酶的固定化方法酶的固定化方法 l

6、固定化酶制備方法，根據(jù)制備原理分類：固定化酶制備方法，根據(jù)制備原理分類： l制備固定化酶的模式圖：制備固定化酶的模式圖： 1載體結合法載體結合法(1)物理吸附法物理吸附法 載體類型：載體類型：是將酶蛋白吸附到水不溶性的惰性載體上制成固定化酶的過程。是將酶蛋白吸附到水不溶性的惰性載體上制成固定化酶的過程。制備原理：制備原理：常為疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、常為疏松多孔的吸附材料；如：多孔玻璃、活性炭、酸性白土、羥基磷灰石、磷酸鈣凝膠以及淀粉等物質。羥基磷灰石、磷酸鈣凝膠以及淀粉等物質。酶與載體的相互作用較弱，二者之間易于分離。酶與載體的相互作用較弱，二者之間易于分離。缺缺

7、 點：點： 酶活力不易喪失，蛋白質的空間結構不發(fā)生明顯變化。酶活力不易喪失，蛋白質的空間結構不發(fā)生明顯變化。優(yōu)優(yōu) 點：點：(2)離子結合法離子結合法 載體類型：載體類型：將酶以離子結合的方式固定到具有離子交換基團的非水溶性載將酶以離子結合的方式固定到具有離子交換基團的非水溶性載體上制成的固定化酶體上制成的固定化酶 。制備原理：制備原理：常為帶各種離子基團的硅膠、纖維素、交聯(lián)葡聚糖和樹脂等物質常為帶各種離子基團的硅膠、纖維素、交聯(lián)葡聚糖和樹脂等物質 。 酶與載體的結合力不高，且易受緩沖液類型和酶與載體的結合力不高，且易受緩沖液類型和pH值高低的影響。值高低的影響。應用這種固定化酶反應時，溶液的應

8、用這種固定化酶反應時，溶液的pH值、離子強度、溫度和底值、離子強度、溫度和底物濃度發(fā)生變化，往往可引起酶的脫落。物濃度發(fā)生變化，往往可引起酶的脫落。 。缺缺 點：點：優(yōu)優(yōu) 點：點：操作較簡便、條件較溫和、酶活力不易喪失。操作較簡便、條件較溫和、酶活力不易喪失。(3)共價結合法共價結合法 是將酶的非必需基團是將酶的非必需基團(-氨基，氨基，-氨基，氨基，、-羧基，羥基，羧基，羥基，咪唑基等咪唑基等)通過通過共價鍵或整合劑偶聯(lián)共價鍵或整合劑偶聯(lián)于固相載體上而制成固定于固相載體上而制成固定化酶?；?。 制備原理：制備原理：有硅膠、纖維素、瓊脂糖和交聯(lián)葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝膠有硅膠、纖維素、瓊脂糖和

9、交聯(lián)葡聚糖，以及聚丙烯酰胺凝膠等物質。等物質。 酶與載體結合很牢固，使用周期長（該法目前應用較為普遍）。酶與載體結合很牢固，使用周期長（該法目前應用較為普遍）。 優(yōu)優(yōu) 點：點：載體類型載體類型:操作較復雜、條件較劇烈、酶活力喪失較多。操作較復雜、條件較劇烈、酶活力喪失較多。缺缺 點：點：l根據(jù)偶聯(lián)反應方式類型的不同，可將共價結合法分為：根據(jù)偶聯(lián)反應方式類型的不同，可將共價結合法分為：共價結合法共價結合法 重氮法重氮法多肽法多肽法烷化法烷化法縮合劑法縮合劑法載體交聯(lián)法載體交聯(lián)法 疊氮法疊氮法 鹵化氰法鹵化氰法 載體共價交聯(lián)法載體共價交聯(lián)法 “酶網(wǎng)酶網(wǎng)載體法載體法 重氮法重氮法制備原理：制備原理：

10、常用載體常用載體:先將載體（帶氨基的芳香族化合物先將載體（帶氨基的芳香族化合物R-Y-NH2）用稀鹽酸和亞用稀鹽酸和亞硝酸鈉（相當于亞硝酸）處理生成硝酸鈉（相當于亞硝酸）處理生成重氮鹽重氮鹽化合物化合物，然后與酶然后與酶蛋白的酚基、咪唑基發(fā)生蛋白的酚基、咪唑基發(fā)生偶聯(lián)反應偶聯(lián)反應(游離氨基也能發(fā)生十分緩游離氨基也能發(fā)生十分緩慢的反應慢的反應)，制成固定化酶（形成偶氮化合物），制成固定化酶（形成偶氮化合物）有對氨芐基纖維素、聚氨基聚苯乙烯、有對氨芐基纖維素、聚氨基聚苯乙烯、3-對對-氨苯氧基氨苯氧基-2-羥丙羥丙酰纖維素、氨基酸共聚物、交聯(lián)葡聚糖酰纖維素、氨基酸共聚物、交聯(lián)葡聚糖-氨茴香酸酯等氨

11、茴香酸酯等proENNYRNYRHClNaNONHYR222弱酸性環(huán)境弱酸性環(huán)境加入酶蛋白，低溫（加入酶蛋白，低溫（05）多多肽肽法法 利用肽的合成原理，使酶蛋白和載體之間以肽鍵連利用肽的合成原理，使酶蛋白和載體之間以肽鍵連接而制成固定化酶的過程。它又分疊氮法和鹵化氰法接而制成固定化酶的過程。它又分疊氮法和鹵化氰法等等疊疊 氮氮 法法先用羧甲基纖維素甲酯與水合肼作用形成先用羧甲基纖維素甲酯與水合肼作用形成酰肼酰肼，然后再，然后再與亞硝酸反應得到與亞硝酸反應得到疊氮化合物疊氮化合物，再在低溫條件下，該化，再在低溫條件下，該化合物合物和酶的游離和酶的游離- -NHNH2 2、- -OHOH和和-

12、-SHSH反應形成肽鍵反應形成肽鍵，即偶聯(lián)，即偶聯(lián)成固定化酶成固定化酶鹵化氰法鹵化氰法此法與第七章此法與第七章“親和層析親和層析”中親和吸附劑的制備原理相似。中親和吸附劑的制備原理相似。先用鹵化氰先用鹵化氰(常用的是溴化氰常用的是溴化氰CNBrCNBr)活化纖維素、交聯(lián)葡聚活化纖維素、交聯(lián)葡聚糖和瓊脂糖等多糖類載體，然后在偏堿性環(huán)境條件下，使糖和瓊脂糖等多糖類載體，然后在偏堿性環(huán)境條件下，使載體（基質）與酶（配體）進行偶聯(lián)，即可制成固定化酶載體（基質）與酶（配體）進行偶聯(lián)，即可制成固定化酶 烷基化法烷基化法制備原理：制備原理：常用載體常用載體:利用蛋白質利用蛋白質N末端游離末端游離- -NHN

13、H2 2、Tyr Tyr 的的Ph OH Ph OH 、CysCys的的OHOH等等與含鹵族功能團的非水溶性載體發(fā)生烷基化反應與含鹵族功能團的非水溶性載體發(fā)生烷基化反應（由酶蛋白（由酶蛋白取代鹵族功能團）制成固定化酶取代鹵族功能團）制成固定化酶氯乙酰纖維素、溴乙酰纖維素、碘乙酰纖維素、聚乙二氯乙酰纖維素、溴乙酰纖維素、碘乙酰纖維素、聚乙二醇碘乙酰纖維素和二氯醇碘乙酰纖維素和二氯-S-三嗪基纖維素等。其中二氯三嗪基纖維素等。其中二氯-S-三嗪基纖維素是帶正電荷的，它對中性或堿性的酶蛋白、三嗪基纖維素是帶正電荷的，它對中性或堿性的酶蛋白、或作用于帶負電荷底物的酶蛋白進行固定化較為有利，或作用于帶負

14、電荷底物的酶蛋白進行固定化較為有利，用其制備的固定化酶活力較高。用其制備的固定化酶活力較高?？s合劑法縮合劑法 將酶（含將酶（含-COOH和和-NH2）與含與含-NH2和和-COOH的載體（的載體（R- NH2 或或 R- COOH ）在縮合劑在縮合劑碳化碳化二亞胺二亞胺（R1-N=C=N-R2）或伍德沃德試劑或伍德沃德試劑K(N-乙基乙基-5-苯異口惡唑苯異口惡唑-3-磺酸磺酸)作用下進行縮合反應，作用下進行縮合反應，制成固定化酶制成固定化酶制備方法：制備方法：載體交聯(lián)法載體交聯(lián)法 這種制備固定化酶的方法有的地方把它歸到交聯(lián)法。這種制備固定化酶的方法有的地方把它歸到交聯(lián)法。因為它們都是通過一個

15、中間工具因為它們都是通過一個中間工具“交聯(lián)劑交聯(lián)劑”（如戊二醛（如戊二醛等）將酶固定化的。載體交聯(lián)法是在酶與載體之間進行等）將酶固定化的。載體交聯(lián)法是在酶與載體之間進行交聯(lián)，使酶固定化；而交聯(lián)法是在酶分子與酶分子之間交聯(lián)，使酶固定化；而交聯(lián)法是在酶分子與酶分子之間進行交聯(lián)，制成網(wǎng)狀結構的固定化酶進行交聯(lián)，制成網(wǎng)狀結構的固定化酶2、交聯(lián)法、交聯(lián)法 交聯(lián)法是酶分子之間在雙功能基團交聯(lián)劑作用下，交聯(lián)法是酶分子之間在雙功能基團交聯(lián)劑作用下，相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結構的固定化酶過程。最常用的交相互交聯(lián)呈網(wǎng)狀結構的固定化酶過程。最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，它和酶蛋白中的游離氨基形成希夫聯(lián)劑是戊二醛，它和酶蛋白中的游離

16、氨基形成希夫氏氏(Schiff)堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)成固定化堿，從而使酶分子之間相互交聯(lián)成固定化酶。酶。 此外，順丁烯二酸酐或乙烯共聚物與酶分子在六此外，順丁烯二酸酐或乙烯共聚物與酶分子在六甲撐二氨作用下，相互間進行反應，亦可制成固定甲撐二氨作用下，相互間進行反應，亦可制成固定化酶化酶3、包埋法、包埋法定義：定義：就是將酶包裹到高分子凝膠等物質的細微網(wǎng)格中，或包埋到高就是將酶包裹到高分子凝膠等物質的細微網(wǎng)格中，或包埋到高分子半透膜中制成固定化酶的方法分子半透膜中制成固定化酶的方法 分類：分類：包埋法根據(jù)包埋分式不同分為網(wǎng)格型和微囊型包埋法根據(jù)包埋分式不同分為網(wǎng)格型和微囊型由于包埋法由于

17、包埋法制備固定化酶的過程中，酶本身不發(fā)生物理化學變制備固定化酶的過程中，酶本身不發(fā)生物理化學變化，故其活力回收率較高，適用于固定各種類型的酶。目前應化，故其活力回收率較高，適用于固定各種類型的酶。目前應用較多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚用較多的是格子型包埋法，此法所用的材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、天然瓊脂糖和淀粉等，用其制備固定化酶的操作簡單乙烯醇、天然瓊脂糖和淀粉等，用其制備固定化酶的操作簡單這種固定化酶制品只能應用于這種固定化酶制品只能應用于底物和產(chǎn)物的分子質量都小底物和產(chǎn)物的分子質量都小的反的反應中應中優(yōu)點：優(yōu)點：缺點：缺點：四、固定化微生物四、固定化微生物的制備的制

18、備 目前，固定化微生物的制備方法最多的是包埋法，目前，固定化微生物的制備方法最多的是包埋法，其次是載體結合法和交聯(lián)法；另外，還有用其次是載體結合法和交聯(lián)法；另外，還有用選擇性選擇性熱變法熱變法制備固定化微生物的，就是將細胞在適當溫制備固定化微生物的，就是將細胞在適當溫度下進行處理，使細胞膜蛋白變性，但不使酶變性度下進行處理，使細胞膜蛋白變性，但不使酶變性而使酶固定與細胞內(nèi)的方法而使酶固定與細胞內(nèi)的方法 采用包埋法制備的部分固定化微生物及其用途采用包埋法制備的部分固定化微生物及其用途五、固定化酶和固定化微生物的性質五、固定化酶和固定化微生物的性質（一）相對活性（一）相對活性固定化酶固定化酶(或微

19、生物或微生物)的活力，通常用的活力，通常用“相對活力相對活力”表表示示 以固定化酶以固定化酶(或微生物或微生物)的活力與同樣量游離酶活的活力與同樣量游離酶活力之比稱為相對活力；一般用百分數(shù)表示。以游離酶力之比稱為相對活力；一般用百分數(shù)表示。以游離酶(或微生物或微生物)的活力為的活力為100作比較作比較 概念：概念： 一般，酶固定化以后，其活性通常會有不同一般，酶固定化以后，其活性通常會有不同程度的下降程度的下降 酶固定化以后，活性降低的原因：酶固定化以后，活性降低的原因：（1）酶蛋白空間酶蛋白空間構象改變，空間位阻構象改變，空間位阻效應增加，而酶的催化活性與其特定效應增加，而酶的催化活性與其特

20、定的空間結構密切相關；尤其是共價結合法和交聯(lián)法（酶的活性基團參的空間結構密切相關；尤其是共價結合法和交聯(lián)法（酶的活性基團參與反應）對空間結構的影響更大與反應）對空間結構的影響更大（2）酶與載體偶聯(lián)后產(chǎn)生的酶與載體偶聯(lián)后產(chǎn)生的空間位阻空間位阻效應降低了酶分子周圍的底物濃度，減少效應降低了酶分子周圍的底物濃度，減少了酶與底物接觸的機會；使反應減慢，表現(xiàn)出酶活力下降了酶與底物接觸的機會；使反應減慢，表現(xiàn)出酶活力下降（3）包埋法中凝膠通透性的影響，使包埋法中凝膠通透性的影響，使酶與底物的接觸受到限制酶與底物的接觸受到限制 另外，有些固定化酶另外，有些固定化酶(或微生物或微生物)相對活力的大小，還會受到

21、底物與載相對活力的大小，還會受到底物與載體性質體性質 、酶的類型、酶量以及制備方法等因素的影響、酶的類型、酶量以及制備方法等因素的影響 （二）活力曲線與最適（二）活力曲線與最適pHpH值值 l固定化酶固定化酶( (或微生物或微生物) )的活力曲線與最適的活力曲線與最適pHpH值的變化：值的變化： 酶酶( (或微生物或微生物) )固定化后，其活力曲線和最適固定化后，其活力曲線和最適pHpH值，一般會發(fā)生偏移值，一般會發(fā)生偏移l活力曲線和最適活力曲線和最適pH值偏移的原因：值偏移的原因：酶固定化后，部分氨基酸側鏈和酶分子的凈電荷發(fā)生了改變，隨之酶活酶固定化后，部分氨基酸側鏈和酶分子的凈電荷發(fā)生了改

22、變，隨之酶活性基團的解離值性基團的解離值(pK)也改變；而酶的活性與其解離狀態(tài)相關；也改變；而酶的活性與其解離狀態(tài)相關；由于載體的理化性質受到影響，致使固定化酶顆粒擴散層內(nèi)外的由于載體的理化性質受到影響，致使固定化酶顆粒擴散層內(nèi)外的H+濃濃度產(chǎn)生差異，其中多陰離子衍生物載體帶負電荷，最適度產(chǎn)生差異，其中多陰離子衍生物載體帶負電荷，最適pH值向堿側偏移，值向堿側偏移，而多陽離子衍生物載體帶正電荷，最適而多陽離子衍生物載體帶正電荷，最適pH值則向酸側偏移值則向酸側偏移 ；酶反應產(chǎn)物導致固定化酶顆粒內(nèi)帶電微環(huán)境的改變（在大多數(shù)情況下，酶反應產(chǎn)物導致固定化酶顆粒內(nèi)帶電微環(huán)境的改變（在大多數(shù)情況下，固定

23、化酶的活力曲線要比游離酶陡峭）固定化酶的活力曲線要比游離酶陡峭）的解釋：的解釋： 在固定化酶反應體系中，酶顆粒周圍存在一個極薄的擴在固定化酶反應體系中，酶顆粒周圍存在一個極薄的擴散層，帶電的載體使固定化酶微環(huán)境中的帶電狀態(tài)不同與散層，帶電的載體使固定化酶微環(huán)境中的帶電狀態(tài)不同與外環(huán)境。帶負電荷的載體會使料液中外環(huán)境。帶負電荷的載體會使料液中H+局部集中于擴散層，局部集中于擴散層，使固定化酶微環(huán)境的使固定化酶微環(huán)境的PH值低于外側料液的值低于外側料液的PH值；為了抵值；為了抵消這種影響，需提高料液的消這種影響，需提高料液的PH值，才能使固定化酶達到最值，才能使固定化酶達到最大的催化速度；所以，帶

24、負電荷的載體通常使固定化酶的大的催化速度；所以，帶負電荷的載體通常使固定化酶的最適最適PH值向堿側偏移，而帶正電荷的載體則通常使固定化值向堿側偏移，而帶正電荷的載體則通常使固定化酶的最適酶的最適PH值向酸側偏移值向酸側偏移l活力曲線和最適活力曲線和最適pHpH值偏移的表現(xiàn)值偏移的表現(xiàn) 綜上情況可以看出，酶綜上情況可以看出，酶( (或微生物或微生物) )經(jīng)固定化后，其活力曲線和最經(jīng)固定化后，其活力曲線和最適適pHpH的變化是有一定規(guī)律的。因此，當酶的最適的變化是有一定規(guī)律的。因此，當酶的最適pHpH與其所處的環(huán)境與其所處的環(huán)境pHpH不相同時，可通過選擇適當?shù)妮d體進行固定，以改變其最適不相同時，

25、可通過選擇適當?shù)妮d體進行固定，以改變其最適p p值，使之值，使之與環(huán)境相一致，從而使固定化酶活力達到最大。與環(huán)境相一致，從而使固定化酶活力達到最大。 l特點：特點：固定化酶的穩(wěn)定性一般都優(yōu)于游離酶；固定化酶的穩(wěn)定性一般都優(yōu)于游離酶；固定化微生物的穩(wěn)定性，基本上與固定化酶相近。固定化微生物的穩(wěn)定性，基本上與固定化酶相近。 l固定化酶穩(wěn)定性提高的原因可能是：固定化酶穩(wěn)定性提高的原因可能是：帶電荷載體與酶分子之間產(chǎn)生了靜電作用，對酶的特定空間帶電荷載體與酶分子之間產(chǎn)生了靜電作用，對酶的特定空間構象起到穩(wěn)定作用構象起到穩(wěn)定作用蛋白水解酶在固定化后避免了酶自身的消化現(xiàn)象發(fā)生蛋白水解酶在固定化后避免了酶自

26、身的消化現(xiàn)象發(fā)生固定化以后，由于空間位阻，降低了變性劑、解離劑、有機固定化以后，由于空間位阻，降低了變性劑、解離劑、有機溶劑等對酶的進攻破壞作用溶劑等對酶的進攻破壞作用（三）穩(wěn)定性（三）穩(wěn)定性（四）米氏常數(shù)（四）米氏常數(shù)米氏常數(shù)（米氏常數(shù)（K m ）是酶的一個特征性常數(shù)是酶的一個特征性常數(shù)，每一種酶都有一定的，每一種酶都有一定的K m 值，其倒數(shù)值，其倒數(shù)1/ K m 稱為親和常數(shù)，稱為親和常數(shù)，用來表示酶與底物的親和力用來表示酶與底物的親和力；而固定；而固定化酶的化酶的K m 值和最大反應速度（值和最大反應速度（Vm ）常因酶蛋白結構的變化和載體帶電常因酶蛋白結構的變化和載體帶電荷的影響而變

27、化。荷的影響而變化。 此外，此外，隨著反應體系離子強度的增大，或者載體粒度的增大，米氏隨著反應體系離子強度的增大，或者載體粒度的增大，米氏常數(shù)也會增大常數(shù)也會增大。一般，載體的顆粒越小，固定化酶越接近游離狀態(tài)的酶，。一般，載體的顆粒越小，固定化酶越接近游離狀態(tài)的酶，米氏常數(shù)就越接近。米氏常數(shù)就越接近。固定化酶的最大反應速度與游離酶相比固定化酶的最大反應速度與游離酶相比，要依具體情況而定。大多數(shù)，要依具體情況而定。大多數(shù)酶經(jīng)固定化以后，酶經(jīng)固定化以后， Vm 變化不大變化不大，但也有由于固定化方法不同而有差異，但也有由于固定化方法不同而有差異的。如：以多孔玻璃為載體共價結合的轉化酶，其的。如：以

28、多孔玻璃為載體共價結合的轉化酶，其Vm 與游離酶相同；與游離酶相同；但用但用PEAE凝膠包埋的轉化酶，其凝膠包埋的轉化酶，其Vm卻只卻只 相當于游離酶的相當于游離酶的1/10。（五）其（五）其 他他1 1、PHPH值的影響：酶用帶正電荷的載體固定時，在偏酸性環(huán)境值的影響：酶用帶正電荷的載體固定時，在偏酸性環(huán)境條件下可增加固定化酶的穩(wěn)定性；相反，酶用帶負電荷的載體條件下可增加固定化酶的穩(wěn)定性；相反，酶用帶負電荷的載體固定時，在偏堿性環(huán)境條件下可增加固定化酶的穩(wěn)定性固定時，在偏堿性環(huán)境條件下可增加固定化酶的穩(wěn)定性2 2、酶固定化以后，抗氧化能力增強、酶固定化以后，抗氧化能力增強3 3、固定化微生物

29、，如含精氨酸脫亞胺酶的惡臭假單包菌，用、固定化微生物，如含精氨酸脫亞胺酶的惡臭假單包菌，用PEAEPEAE凝膠包埋后，由于細胞膜結構發(fā)生改變，導致其對底物凝膠包埋后，由于細胞膜結構發(fā)生改變，導致其對底物（S S）和產(chǎn)物（和產(chǎn)物（P P）的選擇性喪失，從而提高了固定化微生物的的選擇性喪失，從而提高了固定化微生物的相對活力相對活力六、應用六、應用 固定化酶固定化酶(或微生物或微生物)比游離酶比游離酶(或自然微生物或自然微生物)不但穩(wěn)不但穩(wěn)定性好，而且與底物和產(chǎn)物更容易分開，所以在工業(yè)、定性好，而且與底物和產(chǎn)物更容易分開，所以在工業(yè)、醫(yī)學、藥學和生化分析等方面的應用發(fā)展較快醫(yī)學、藥學和生化分析等方面

30、的應用發(fā)展較快 （一）工業(yè)方面應用（一）工業(yè)方面應用 由于酶固定化以后，既穩(wěn)定，又容易與由于酶固定化以后，既穩(wěn)定，又容易與S S和和P P分離，分離，并且可以重復使用；所以固定化酶在工業(yè)上的應用既并且可以重復使用；所以固定化酶在工業(yè)上的應用既經(jīng)濟又實用經(jīng)濟又實用例例1、L-氨基酸的生產(chǎn)是利用固定化氨基酸的生產(chǎn)是利用固定化氨基?；赴被；阜磻M行的反應進行的生產(chǎn)步驟：生產(chǎn)步驟： 先將氨基?；赶葘被；肝接谖接贒EAE-交聯(lián)葡聚糖交聯(lián)葡聚糖A-25，制成固定化制成固定化酶反應柱，在柱中通入酶反應柱，在柱中通入DL-氨基酸的氨基酸的N-?；苌铮缓蟛甚；苌?，然后采用溶解度法把用

31、溶解度法把L-氨基酸和?；被岷王；?D-氨基酸分開氨基酸分開 （這樣就得到（這樣就得到了光學純度好，回首率高的了光學純度好，回首率高的DL-氨基酸）氨基酸）L-苯丙氨酸既是營養(yǎng)增補劑，苯丙氨酸既是營養(yǎng)增補劑，又是甜味劑阿斯巴甜的主原料又是甜味劑阿斯巴甜的主原料例例2、利用固定化多酶反應柱生利用固定化多酶反應柱生產(chǎn)產(chǎn)3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛 多酶反應柱，從上到下依次分別為用多酶反應柱，從上到下依次分別為用聚丙烯酰胺凝膠包埋的己糖激酶、磷酸聚丙烯酰胺凝膠包埋的己糖激酶、磷酸己糖異構酶、己糖異構酶、6-磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶-1、醛縮酶、醛縮酶（裂解酶）。當向反應柱注入一定比例（裂解酶）。當向

32、反應柱注入一定比例的的G、ATP、Mg 2+混合時，這些底物原混合時，這些底物原料流經(jīng)反應柱時，依次被己糖激酶、磷料流經(jīng)反應柱時，依次被己糖激酶、磷酸己糖異構酶、酸己糖異構酶、6-磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶-1和醛縮和醛縮酶催化反應，生成酶催化反應，生成3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛（二）醫(yī)學方面（二）醫(yī)學方面 固定化酶在醫(yī)學方面的應用，目固定化酶在醫(yī)學方面的應用，目前正在積極的研究和開發(fā)。其中用包前正在積極的研究和開發(fā)。其中用包埋法制備的固定化酶，在治療酶缺乏埋法制備的固定化酶，在治療酶缺乏癥和代謝異常癥等疾病時，有很好的癥和代謝異常癥等疾病時，有很好的發(fā)展前景。發(fā)展前景。 例例1 在小白鼠腹腔內(nèi)，

33、分別注射在小白鼠腹腔內(nèi)，分別注射生理鹽水、游離的和固定化的天冬酰生理鹽水、游離的和固定化的天冬酰胺酶后，飼養(yǎng)觀察的結果如圖胺酶后，飼養(yǎng)觀察的結果如圖10-8所所示示 從圖中可看出：使用游離從圖中可看出：使用游離天冬酰胺酶的藥效時間為天冬酰胺酶的藥效時間為2天，天，而使用固定化天冬酰胺酶的藥而使用固定化天冬酰胺酶的藥效時間為效時間為6天，明顯延長了藥效天，明顯延長了藥效時間時間 機體正常的體細胞能合成足量的機體正常的體細胞能合成足量的Asn 供蛋白質合成供蛋白質合成使用，但白血病病變細胞卻不能合成使用，但白血病病變細胞卻不能合成Asn，必須不斷必須不斷從血液中攝取從血液中攝取Asn供病變細胞蛋白

34、質合成。因此，臨供病變細胞蛋白質合成。因此，臨床上應用天冬酰胺酶使床上應用天冬酰胺酶使Asn水解為水解為Asp ，減少血液減少血液Asn的含量，使病變細胞蛋白質合成受阻，達到治療的含量，使病變細胞蛋白質合成受阻，達到治療的目的的目的例例2 人工腎人工腎 尿毒癥患者就是由于腎臟病變，體內(nèi)的代謝廢物如尿尿毒癥患者就是由于腎臟病變，體內(nèi)的代謝廢物如尿素、尿酸等不能隨尿排出體外，傳統(tǒng)的方法就是素、尿酸等不能隨尿排出體外，傳統(tǒng)的方法就是“透析透析”，即利用半透膜將血液中的代謝廢物排除。這種方法病人很即利用半透膜將血液中的代謝廢物排除。這種方法病人很痛苦，使用不方便，并且成本很高；而痛苦，使用不方便，并且

35、成本很高；而新型新型人工腎人工腎是由微是由微型膠囊型膠囊脲酶脲酶和和微型膠囊吸附劑微型膠囊吸附劑離子交換樹脂或活性炭構離子交換樹脂或活性炭構成的，將其裝于體外血管分流器內(nèi)，并與循環(huán)系統(tǒng)連接，成的，將其裝于體外血管分流器內(nèi)，并與循環(huán)系統(tǒng)連接，體積約為體積約為1立升，可隨身攜帶。并且由于固定化酶可重復立升，可隨身攜帶。并且由于固定化酶可重復使用，離子交換樹脂可再生，所以此法比透析法效率高、使用，離子交換樹脂可再生，所以此法比透析法效率高、成本低、使用方便成本低、使用方便（三）生化分析方面（三）生化分析方面 1定量分析定量分析 定量分析是將固定化酶分別與分光光度計、熒光光度計和微量熱量計等儀定量分析

36、是將固定化酶分別與分光光度計、熒光光度計和微量熱量計等儀器組合起來，進行含量檢測的一種自動分析方法。目前這種分析方法正在臨器組合起來，進行含量檢測的一種自動分析方法。目前這種分析方法正在臨床檢驗中應用。床檢驗中應用。 例如，例如，在固定化膽堿酯酶中，通人一定體積的空氣或水，根據(jù)熒光分析測在固定化膽堿酯酶中，通人一定體積的空氣或水，根據(jù)熒光分析測定結果，便可得知其中對人有害的膽堿酯酶神經(jīng)毒劑定結果，便可得知其中對人有害的膽堿酯酶神經(jīng)毒劑(酶抑制劑酶抑制劑)的含量的含量 現(xiàn)在國際上已用固定化酶對體液和排泄物中的過氧化氫、尿素、乳酸、葡現(xiàn)在國際上已用固定化酶對體液和排泄物中的過氧化氫、尿素、乳酸、葡

37、葡糖和氨基酸等物質進行自動分析測定葡糖和氨基酸等物質進行自動分析測定(見表見表10-6)。 2 2制作酶電極制作酶電極 將固定化酶覆蓋在電極上，或將酶固定在電極上構成的將固定化酶覆蓋在電極上，或將酶固定在電極上構成的裝置稱酶電極，也稱酶傳感器裝置稱酶電極，也稱酶傳感器 3 3分析物質的結構分析物質的結構 將分析蛋白質和核酸一級結構的蛋白水解酶、羧肽酶、將分析蛋白質和核酸一級結構的蛋白水解酶、羧肽酶、亮氨酸氨肽酶、核酸酶、磷酸二酯酶和磷酸單酯酶等分別亮氨酸氨肽酶、核酸酶、磷酸二酯酶和磷酸單酯酶等分別制成固定化酶，在應用時比游離酶操作簡單，分離方便制成固定化酶，在應用時比游離酶操作簡單，分離方便4

38、 4研究酶的功能和反應機理研究酶的功能和反應機理 采用固定化酶可以研究酶的功能和反應機理采用固定化酶可以研究酶的功能和反應機理例如例如 為了研究某些酶的為了研究某些酶的亞單位功能，可將具有亞單位功能，可將具有4個亞基的醛縮酶固定到瓊個亞基的醛縮酶固定到瓊脂糖上，制成固定化的醛脂糖上，制成固定化的醛縮酶縮酶(s)。將此酶經(jīng)含巰基。將此酶經(jīng)含巰基乙醇的乙醇的8molL尿素溶液尿素溶液處理后，得到變性的固定處理后，得到變性的固定化亞單位化亞單位(b)。然后經(jīng)透析。然后經(jīng)透析和再生，則分別得到了固和再生，則分別得到了固定化亞單位定化亞單位(c)和再生固定和再生固定化醛縮酶化醛縮酶(d)(見圖見圖10-

39、9)。(a)、(c)和和(d)三者的比活三者的比活力分別為力分別為4.5、1.6和和2.2umg蛋白。這表明構成蛋白。這表明構成醛縮酶的亞基醛縮酶的亞基(即亞單位即亞單位)是有酶活性是有酶活性5制備親和吸附劑制備親和吸附劑 有些物質如酶和底物有些物質如酶和底物(或競爭性抑制劑或競爭性抑制劑 )、抗原和抗體、抗原和抗體、激素和受體蛋白、激素和受體蛋白、DNA和和RNA等具有某些生物學特性，等具有某些生物學特性，即每一對物質之間存在著很高的特異結合能力。如果將即每一對物質之間存在著很高的特異結合能力。如果將酶用適當?shù)妮d體固定后，制成的酶用適當?shù)妮d體固定后，制成的親和吸附劑親和吸附劑就能把類似就能把

40、類似底物底物從混合物中分離出來從混合物中分離出來 。 （四）應用實例（四）應用實例固定化固定化5 5- -磷酸二酯酶的制備磷酸二酯酶的制備( (重氮法重氮法) ) 材料準備材料準備酶固定化酶固定化酶活力測定酶活力測定粗酶液的制備粗酶液的制備雙功能試劑雙功能試劑SESA（對對-硫酸酯乙砜基苯胺硫酸酯乙砜基苯胺）的配制）的配制載體（載體（葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-200 ）的制備）的制備載體的活化（制備載體的活化（制備SESA葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠G-200載體載體 ）原酶液活力測定原酶液活力測定 固定化酶活力測定固定化酶活力測定 殘留酶活力測定殘留酶活力測定相對酶活力和回收率的計算相對酶活力和回收率

41、的計算 1 1、粗酶液、粗酶液制備制備 將桔青霉菌將桔青霉菌(Penicillium citrium)發(fā)酵液用（發(fā)酵液用（NHNH4 4）2 2SOSO4 4鹽析，鹽析，或用的冷乙醇沉淀分離得到酶或用的冷乙醇沉淀分離得到酶2、雙功能試劑的預處理、雙功能試劑的預處理 取取5g SESA（對對-硫酸酯乙砜基苯胺）硫酸酯乙砜基苯胺）加加10ml水研磨，水研磨，隨后慢慢加入含隨后慢慢加入含2NaNa2 2COCO3 3的的0.1molL的的NaOHNaOH溶液溶液40ml混勻，混勻，收集懸液，棄去殘渣。收集懸液，棄去殘渣。3、載體的處理、載體的處理取取10g SephadexSephadexG-200

42、(粉末狀粉末狀150-200目目)凝膠凝膠，加水加水200mi浸浸泡泡12h后，加含后，加含2 NaNa2 2COCO3 3的的0.1molL NaOH溶液，室溫溶液，室溫放置過夜，使其充分溶脹放置過夜，使其充分溶脹4、載體的活化、載體的活化 將溶脹好的堿性將溶脹好的堿性SephadexSephadexG-200凝膠置沸水浴中攪拌，當加溫凝膠置沸水浴中攪拌，當加溫到到50時，逐漸加入時，逐漸加入SESA懸液，用含懸液，用含2 NaNa2 2COCO3 3的的0.1molL NaOH溶液調(diào)溶液調(diào)pH值為值為8，待加溫到，待加溫到80時，保持時，保持20min，爾后爾后繼續(xù)加溫到繼續(xù)加溫到90，維

43、持，維持6min，接著開始降溫冷卻，并依次用接著開始降溫冷卻，并依次用0.1molL NaOH和和0.1molL HCLHCL溶液各溶液各700ml，洗洗3次，再次，再用水洗至用水洗至pH4.0左右左右 5、酶固定化、酶固定化取上述取上述SESA-SephadexSephadexG-200載體載體2g(離心后濕重離心后濕重)于冰浴中冷卻，加于冰浴中冷卻，加5 NaNa2 2NONO2 2溶液溶液05ml，攪勻并滴加攪勻并滴加1molL HCL HCL 05ml，攪拌攪拌10min后，后，用冷的用冷的0.05N HCLHCL洗三次，冷水洗一次。在洗三次，冷水洗一次。在05用用1molL NaNa2 2COCO3 3溶溶液液調(diào)調(diào)pH6.07.0，立即加入酶液立即加入酶液lml（10mg/ml ）, ,合并洗滌液，用作測定合并洗滌液，用作測定殘留的酶活力（固定化的殘留的酶活力（固定化的5-5-磷酸二酯酶呈鮮艷的桔紅色。按此程序，磷酸二酯酶呈鮮艷的桔紅色。按此程序，用用2