實驗四小鼠精子畸形試驗學習教案

1、實驗實驗(shyn)四四 小鼠精子畸形試驗小鼠精子畸形試驗第一頁，共16頁。 精子畸形試驗是檢測受試化學毒物能精子畸形試驗是檢測受試化學毒物能否破壞哺乳動物精子正常形態(tài)的實驗方法否破壞哺乳動物精子正常形態(tài)的實驗方法(fngf)(fngf)。通過實驗，學習和掌握小鼠。通過實驗，學習和掌握小鼠精子畸形試驗的原理和步驟。精子畸形試驗的原理和步驟。 實驗實驗(shyn)目的目的1.1. 1.第1頁/共16頁第二頁，共16頁。實驗原理實驗原理2.2. 精子畸形是指精子的形狀異常和異常精子畸形是指精子的形狀異常和異常精子數(shù)量精子數(shù)量(shling)(shling)的增多。生殖系統(tǒng)對的增多。生殖系統(tǒng)對化學毒

2、物的作用十分敏感，在其他系統(tǒng)還化學毒物的作用十分敏感，在其他系統(tǒng)還未出現(xiàn)毒性反應前，生殖系統(tǒng)可能已出現(xiàn)未出現(xiàn)毒性反應前，生殖系統(tǒng)可能已出現(xiàn)了損害作用。正常情況下，哺乳動物的精了損害作用。正常情況下，哺乳動物的精液中也存在少量的畸形精子，但在某些化液中也存在少量的畸形精子，但在某些化學毒物的作用下，特別是在可引起生殖細學毒物的作用下，特別是在可引起生殖細胞遺傳性損傷的化學毒物作用下，哺乳動胞遺傳性損傷的化學毒物作用下，哺乳動物睪丸產生的畸形精子數(shù)量物睪丸產生的畸形精子數(shù)量(shling)(shling)可可大量增加。因此，可以用大量增加。因此，可以用 第2頁/共16頁第三頁，共16頁。實驗原理實

3、驗原理2.2.檢查雄性動物接觸化學毒物后精子畸形率的高低，檢查雄性動物接觸化學毒物后精子畸形率的高低，來反映該化學毒物的生殖毒性和對生殖細胞潛在來反映該化學毒物的生殖毒性和對生殖細胞潛在(qinzi)(qinzi)的致突變性。的致突變性。 化學毒物引起精子畸形的機制尚未完全清楚?；瘜W毒物引起精子畸形的機制尚未完全清楚。正常情況下，精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)生過程受正常情況下，精子的成熟和正常形態(tài)發(fā)生過程受多種基因調控，一旦這些基因中的一個或多個在多種基因調控，一旦這些基因中的一個或多個在化學毒物的作用下發(fā)生突變，就會導致畸形精子化學毒物的作用下發(fā)生突變，就會導致畸形精子數(shù)量的大量增加。一般認為，常

4、染色體上的基因數(shù)量的大量增加。一般認為，常染色體上的基因控制控制 第3頁/共16頁第四頁，共16頁。實驗原理實驗原理2.2.精子畸形，精子畸形，Y-Y-性連鎖基因控制畸形精子的表現(xiàn)性連鎖基因控制畸形精子的表現(xiàn)(bioxin)(bioxin)。某些特異的染色體重排，如性、。某些特異的染色體重排，如性、常染色體易位，是化學毒物誘發(fā)哺乳動物畸形常染色體易位，是化學毒物誘發(fā)哺乳動物畸形率增高的主要機制。率增高的主要機制。 由于精子畸形有可能影響生殖。因此，當由于精子畸形有可能影響生殖。因此，當受檢物引起精子畸形率增高，即使不一定是化受檢物引起精子畸形率增高，即使不一定是化合物誘發(fā)生殖細胞突變的結果，但

5、也表明受試合物誘發(fā)生殖細胞突變的結果，但也表明受試物直接或間接損害精子，從而可能影響生殖。物直接或間接損害精子，從而可能影響生殖。 第4頁/共16頁第五頁，共16頁。 實驗實驗(shyn)(shyn)動物：動物：實驗實驗(shyn)材料材料3.3.體重體重(tzhng)18-22g(tzhng)18-22g小鼠。小鼠。 實驗器材：實驗器材：灌胃針、注射器灌胃針、注射器5 5套、眼科剪、眼套、眼科剪、眼科鑷、顯微鏡、飼養(yǎng)籠等?？畦?、顯微鏡、飼養(yǎng)籠等。 實驗試劑：實驗試劑：磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、無水乙醇、磷酸鹽緩沖液、生理鹽水、無水乙醇、2%2%伊紅水溶液、甲基磺酸甲酯或甲基磺伊紅水溶液、甲基磺

6、酸甲酯或甲基磺酸乙酸或環(huán)磷酰胺。酸乙酸或環(huán)磷酰胺。第5頁/共16頁第六頁，共16頁。4.4. 實驗步驟實驗步驟1.1.動物選擇動物選擇(xunz)(xunz)成熟的大鼠、小鼠均可使用。由成熟的大鼠、小鼠均可使用。由于小鼠較為經(jīng)濟，且有大量實驗證實小鼠在該試驗系統(tǒng)于小鼠較為經(jīng)濟，且有大量實驗證實小鼠在該試驗系統(tǒng)中對化學毒物最為敏感，故一般采用雄性小鼠，年齡宜中對化學毒物最為敏感，故一般采用雄性小鼠，年齡宜在在6 68 8周。周。2.2.劑量與分組試驗至少應設劑量與分組試驗至少應設3 3個以上個以上(yshng)(yshng)劑量組，并同時設立陽性對照組和陰性對照組。劑量組，并同時設立陽性對照組和

7、陰性對照組。接觸化學毒物后每組至少應存活接觸化學毒物后每組至少應存活5 5只動物。最高只動物。最高劑量組劑量組5d5d總劑量應能使部分動物死亡?？倓┝繎苁共糠謩游锼劳?。 一般可采用一般可采用LD50LD50的的2 24 4倍劑量，或預先給予倍劑量，或預先給予化學毒物的化學毒物的LD50LD50，以求得最高總劑量，然后以，以求得最高總劑量，然后以它的它的1/21/2（或（或1/51/5、1/101/10）作為下一劑量組的接）作為下一劑量組的接觸劑量，依此類推。觸劑量，依此類推。第6頁/共16頁第七頁，共16頁。4.4. 實驗步驟實驗步驟陽性對照可用環(huán)磷酰胺陽性對照可用環(huán)磷酰胺20mg/kg20

8、mg/kg或甲基磺酸甲酯或甲基磺酸甲酯75mg/kg75mg/kg或甲基磺酸乙酯或甲基磺酸乙酯60mg/kg60mg/kg，進行腹腔，進行腹腔(fqing)(fqing)注射，每天一次，連續(xù)注射，每天一次，連續(xù)5d5d。陰性對照。陰性對照選用給予相同體積的溶劑。選用給予相同體積的溶劑。3.3.染毒與采樣可采用一次或每天一次連續(xù)染毒與采樣可采用一次或每天一次連續(xù)5d5d的方的方法進行染毒。染毒途徑多用腹腔注射，也可采用法進行染毒。染毒途徑多用腹腔注射，也可采用與人體實際接觸化學毒物相同的途徑，如經(jīng)口、與人體實際接觸化學毒物相同的途徑，如經(jīng)口、吸入和皮膚接觸等。吸入和皮膚接觸等。 一般認為精原細胞

9、后期一般認為精原細胞后期(huq)(huq)或初級精母細或初級精母細胞早期對化學誘變劑較為敏感，在接觸化學毒物胞早期對化學誘變劑較為敏感，在接觸化學毒物后后4 45 5周精子畸形率最高，故選擇在第一次染毒周精子畸形率最高，故選擇在第一次染毒后第后第35d35d進行采樣。也可在染毒后第進行采樣。也可在染毒后第1 1、第、第4 4和第和第1010周周第7頁/共16頁第八頁，共16頁。4.4. 實驗步驟實驗步驟分三次采樣，或者在染毒后每周采樣一次，連分三次采樣，或者在染毒后每周采樣一次，連續(xù)進行續(xù)進行(jnxng)(jnxng)動態(tài)觀察，直至精子形態(tài)恢動態(tài)觀察，直至精子形態(tài)恢復正常。復正常。4.4.

10、制片用頸椎脫臼法處死小鼠，剪開腹腔制片用頸椎脫臼法處死小鼠，剪開腹腔(fqing)(fqing)，分離并摘取雙側附睪，將附睪放入盛有約分離并摘取雙側附睪，將附睪放入盛有約3ml3ml磷酸鹽緩沖磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的小平皿中，以眼科剪將附睪尾剪成小塊，液或生理鹽水的小平皿中，以眼科剪將附睪尾剪成小塊，用吸管將懸浮液輕輕吹打用吸管將懸浮液輕輕吹打5 56 6次，靜置次，靜置3 35min5min，用四層，用四層擦鏡紙濾除組織碎片，吸取此精子懸液滴于清潔載玻片擦鏡紙濾除組織碎片，吸取此精子懸液滴于清潔載玻片上，均勻推片，待玻片晾干后用甲醇固定上，均勻推片，待玻片晾干后用甲醇固定5min5min，干

11、燥后，干燥后即可鏡檢觀察精子形態(tài)。也可用即可鏡檢觀察精子形態(tài)。也可用2%2%的伊紅水溶液染色的伊紅水溶液染色1 12h2h后再作鏡檢。后再作鏡檢。第8頁/共16頁第九頁，共16頁。4.4. 實驗步驟實驗步驟5.5.閱片在高倍鏡下檢查精子形態(tài)，可加上藍色或綠閱片在高倍鏡下檢查精子形態(tài)，可加上藍色或綠色濾光片。每只小鼠檢查完整的精子色濾光片。每只小鼠檢查完整的精子200200500500個，個，每個劑量組至少檢查每個劑量組至少檢查10001000個精子。精子畸形個精子。精子畸形(jxng)(jxng)主要表現(xiàn)在精子的頭部，可分為：無鉤、主要表現(xiàn)在精子的頭部，可分為：無鉤、香蕉形、無定形、雙頭、雙尾

12、、尾折疊及胖頭等形香蕉形、無定形、雙頭、雙尾、尾折疊及胖頭等形態(tài)。態(tài)。頭部重疊或全部重疊的精子、無尾精子不進行計頭部重疊或全部重疊的精子、無尾精子不進行計數(shù)。數(shù)。第9頁/共16頁第十頁，共16頁。5.5. 結果分析結果分析分別計算各劑量組的精子畸形發(fā)生率。各劑分別計算各劑量組的精子畸形發(fā)生率。各劑量組的精子畸形率與陰性對照組之間的差異量組的精子畸形率與陰性對照組之間的差異(chy)(chy)分析采用秩和檢驗。分析采用秩和檢驗。 由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差異由于不同品系小鼠的精子畸形率本底值差異(chy)(chy)較大，且影響的因素也較多，故在結較大，且影響的因素也較多，故在結果分析時

13、，應首先觀察陽性和陰性對照組的試果分析時，應首先觀察陽性和陰性對照組的試驗結果。陽性對照組精子畸形率的增高應在本驗結果。陽性對照組精子畸形率的增高應在本實驗室的歷史記錄范圍之內，并與陰性對照組實驗室的歷史記錄范圍之內，并與陰性對照組有顯著性差異有顯著性差異(chy)(chy)（P0.01P0.01），陰性對照），陰性對照組的畸形精子率也應與自己實驗室的歷史記錄組的畸形精子率也應與自己實驗室的歷史記錄接近，否則所得結果不可靠，試驗應重做。接近，否則所得結果不可靠，試驗應重做。第10頁/共16頁第十一頁，共16頁。5.5. 結果分析結果分析出現(xiàn)可重復的劑量反應關系時，可判斷試驗結果出現(xiàn)可重復的劑量

14、反應關系時，可判斷試驗結果為陽性。但要判定某一化學毒物為陽性。但要判定某一化學毒物(dw)(dw)為精子畸為精子畸形誘變劑，至少應該有兩個相鄰劑量組的精子畸形形誘變劑，至少應該有兩個相鄰劑量組的精子畸形率比陰性對照組顯著增高（率比陰性對照組顯著增高（P0.01P0.01）；或達到陰性）；或達到陰性對照組的對照組的2 2倍或倍或2 2倍以上，并且試驗結果能夠重復。倍以上，并且試驗結果能夠重復。如果試驗組的染毒劑量已使動物發(fā)生死亡，而精子如果試驗組的染毒劑量已使動物發(fā)生死亡，而精子畸形仍未見增加，則可判定試驗結果為陰性。在受畸形仍未見增加，則可判定試驗結果為陰性。在受試化學毒物試化學毒物(dw)(

15、dw)的毒性作用較低而不至于引起的毒性作用較低而不至于引起動物死亡時，應當記錄最大的染毒劑量。動物死亡時，應當記錄最大的染毒劑量。第11頁/共16頁第十二頁，共16頁。5.5. 結果分析結果分析精子畸形試驗還可進行畸變類型分析，不同部位的畸精子畸形試驗還可進行畸變類型分析，不同部位的畸形對精子的活動能力和使卵子受孕的能力有不同的影響。形對精子的活動能力和使卵子受孕的能力有不同的影響?？梢越Y合可以結合(jih)(jih)精子計數(shù)、精子運動能力試驗等對化精子計數(shù)、精子運動能力試驗等對化學毒物對雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用做進一步的檢測。學毒物對雄性生殖系統(tǒng)的毒性作用做進一步的檢測。第12頁/共16頁第十三頁，共16頁。6.6. 注意事項注意事項1 1在該試驗過程中，雖然將精子懸液采用離心等在該試驗過程中，雖然將精子懸液采用離心等方法方法(fngf)(fngf)除去組織殘渣后再制片效果會更佳，除去組織殘渣后再制片效果會更佳，但這使制片過程變得復雜化且更易造成人為誤差。但這使制片過程變得復雜化且更易造成人為誤差。2 2在鏡檢時要注意鑒別制片過程中人為造成的精在鏡檢時要注意鑒別制片過程中人為造成的精子損傷。特別要注意由于精子重疊和交叉所造成的子損傷。特別要注意由于精子