SDS-PAGE分離膠-濃縮膠配方

1、SDS-PAGE1、SDS-PAGE：聚丙烯酰胺凝膠電泳2、Acr:丙烯酰胺；配膠時(shí)用30%Acr（質(zhì)量比Acr：Bis=29:1）3、Bis：甲叉雙丙烯酰胺4、DDW:超輕水5、SDS：十二烷基硫酸/磺酸鈉，陰離子去污劑（配膠時(shí)用10%）6、APS：過(guò)硫酸銨NH4S2O4配膠時(shí)用10%7、TEMED：四甲基乙二胺，促凝劑8、Tris-Hcl：3羥基氨基甲烷鹽酸緩沖液，配膠時(shí)（分離膠ph=8.8,濃縮膠ph=6.8）9、DTT：二硫蘇糖醇，DTT也常常被用于蛋白質(zhì)中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質(zhì)中的半胱氨酸之間所形成的蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間二硫鍵。10、IMA：碘乙酰胺，碘代乙酰胺用于有機(jī)合成，

2、在蛋白組學(xué)中組氨酸和半胱氨酸的烷基化試劑，用于多肽測(cè)序以及酶抑制劑等，蛋白組學(xué)級(jí)試劑。CH>2ICONH>2，是和碘乙酸一樣，可通過(guò)下列反應(yīng)不可逆地抑制SH酶類的物質(zhì)。5呱10ml1imt2Dml西nA3D祁4QmdSOmt6%陰iW30%Aerylamde15MTrte-HCl(pHSB'i1g$DS10%過(guò)謊盟霰TEMED6%OelH；O30%Aerylamde15MTrlfe-HCIfpi-i8S'iICiSDS1我過(guò)礪酸融TEMEDmceiH；/?Acryiamdel.flMTrl5-HCI(PHU印1C%SDG1出逍斕槻TEMED12%GalHiD3C陽(yáng)A

3、avlam'da15MTris-HCI(pHSB)ICTiSDS過(guò)確鞭槻TEMED15%QvlHjO3CiAfllamda15MTris-HCTfpHs朋10%SDG1g迥就盤錢TEMED2.Es7.6J.132.521）根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分離膠（即下層膠）：flAhICKfa12ISflHMolnrratin口nrr>fnrTiEd>Q：bi30CQfnmritiy23:1.Rringennmlian由Sapqfbtixinrs時(shí)田尸。血加sind&naimingSDS-PAGErffircinliu

4、龍f凝膠總濃度與蛋白質(zhì)相對(duì)分子里的關(guān)索:、蛋白質(zhì)相姑分子星范國(guó)：<1刈“話用的凝膠總濃度：卻-3協(xié)二、蛋白質(zhì)相對(duì)分子里范帽：1皿71滬適用的凝膠總濃度：1勢(shì)U幌三、蛋白質(zhì)相對(duì)分子毘范圍；Ed加適用的凝臉總濃度：1吧嚴(yán)巧四i蛋白質(zhì)相對(duì)分子里范圉：1寸滬廳材爐適用的凝膠總濃憧；io%五、蛋白質(zhì)相對(duì)分子里范圉：>io=適用的凝膠總濃度：13%SDS-PAGE分離膠濃度最佳分離范圍6%膠50-150kD8%膠30-90kD10%膠20-80kD12%膠12-60kD15%膠10-40kD成分配制不同彳體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）6%膠51015203050蒸餾水2.0

5、4.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:l)1.02.03.04.06.010.01MTris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%過(guò)硫酸銨0.00.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不同體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）8%膠51015203050蒸餾水6.710.016.730%Acr-Bis(29:1)5.38.013.31MTris,pH5.77.611

6、.419.010%SDS0.00.30.510%過(guò)硫酸銨0.00.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不同彳體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）10%膠51015203050蒸餾水5.38.013.330%Acr-Bis(29:1)6.710.016.71MTris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%過(guò)硫酸銨0.00.30.5TEMED0.0020.0040.

7、0060.0080.0120.02成分配制不同彳體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）12%膠51015203050蒸餾水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.012.020.01MTris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%過(guò)硫酸銨0.00.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不同彳體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）15%膠51015203050蒸餾水0.51.01.5

8、2.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01MTris,pH5.77.611.419.010%SDS0.00.30.510%過(guò)硫酸銨0.00.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：如果配制非變性膠，參考上述配方，不加10%SDS即可配制成非變性PAGE膠。1）按照如下表格配制SDS-PAGE的濃縮膠（也稱堆積膠、積層膠或上層膠）:成分配制不同彳體積SDS-PAGE濃縮膠所需各成分的體積（毫升）5%膠2346810蒸餾水4.1

9、5.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71MTris,pH80.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%過(guò)硫酸銨0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01TBST緩沖液每2L體積中含：1MTrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g葉溫1ml1）抗體去除液每50mL抗體去除液中含：0.5MTrisHCL(pH6.8)6.25mL10%SDS10mLBeta-ME0.175mL水33.75mL

10、migrationwwwbuuuuui/Qe©99e鬧.0iL.J染H貸賈SDS-PAGE電泳的基本原理：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX,式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇p