簡(jiǎn)明微生物工程 3-2發(fā)酵機(jī)制-酒精、檸檬酸

1、三氯乙酸（三氯乙酸（TCA）沉淀蛋白的原理）沉淀蛋白的原理 TCA 與蛋白質(zhì)之間主要有以下幾個(gè)方面的作用：與蛋白質(zhì)之間主要有以下幾個(gè)方面的作用： 在酸性條件下與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽；在酸性條件下與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽； 作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團(tuán)出較多的疏水性基團(tuán), 使之聚集沉淀；使之聚集沉淀； 隨著蛋白質(zhì)分子量的增大，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性與致密隨著蛋白質(zhì)分子量的增大，其結(jié)構(gòu)復(fù)雜性與致密性越大，性越大，TCA 可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全可能滲入分子內(nèi)部而使之較難被完全除去，在電泳前樣品加熱處理時(shí)可能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)除去，在電泳

2、前樣品加熱處理時(shí)可能使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生酸水解而形成碎片，而且隨時(shí)間的延長(zhǎng)這一作用愈生酸水解而形成碎片，而且隨時(shí)間的延長(zhǎng)這一作用愈加明顯；加明顯； 電泳圖譜顯示，人血清蛋白電泳圖譜顯示，人血清蛋白 、牛血清蛋白、牛血清蛋白 單體譜單體譜帶有較明顯的展寬現(xiàn)象，這可能是由于帶有較明顯的展寬現(xiàn)象，這可能是由于TCA 的結(jié)合的結(jié)合，使，使SDS 與蛋白質(zhì)的結(jié)合量產(chǎn)生偏差，從而造成蛋與蛋白質(zhì)的結(jié)合量產(chǎn)生偏差，從而造成蛋白質(zhì)所帶電荷的不均一性，造成遷移率的不一致。白質(zhì)所帶電荷的不均一性，造成遷移率的不一致。微生物的發(fā)酵機(jī)制本章重點(diǎn)：1、酒精、乳酸、甘油的 發(fā)酵機(jī)制2、檸檬酸的發(fā)酵機(jī)制3、谷氨酸的發(fā)酵機(jī)制EMP

3、途徑途徑HMP途徑途徑ED途徑途徑TCA循環(huán)循環(huán)第一節(jié) 糖代謝產(chǎn)物的發(fā)酵機(jī)制一、糖酵解途徑及調(diào)節(jié) 葡萄糖葡萄糖 抑制 激活 己糖激酶己糖激酶 ADP AMP 葡萄糖葡萄糖-磷酸磷酸 果糖果糖-磷酸磷酸 磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶 ATP ADP AMP 果糖果糖-，二磷酸，二磷酸 3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛二羥丙酮磷酸二羥丙酮磷酸 3- 3-磷酸甘油酸磷酸甘油酸 2- 2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸 葡萄糖葡萄糖-磷酸磷酸 磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸 果糖果糖-,二磷酸二磷酸 丙酮酸丙酮酸激酶激酶 ATP 3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛 丙酮酸丙酮酸 葡萄糖分解途徑葡萄糖分解途徑胞質(zhì)胞質(zhì) 線粒體線粒體

4、TCA TCA循環(huán)循環(huán)葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸乙酰乙酰CoACoACOCO2 2+H+H2 2O O 乙醇乙醇 乳酸乳酸丙酮酸的去路丙酮酸的去路 O O2 2線粒體線粒體 乙酰乙酰CoACoATCATCACOCO2 2+H+H2 2O O NADH NADNADH NAD+ +丙酮酸丙酮酸 乳酸乳酸 丙酮酸脫羧酶丙酮酸脫羧酶 NADH NADNADH NAD+ + 乙醛乙醛 乙醇乙醇 羧化酶羧化酶 乙酰乙酰CoACoA丙酮酸乙醛乙醛乙醇乙醇CO2HH乳酸乳酸草酰乙酸草酰乙酸HATP琥珀酸琥珀酸丙酸丙酸CO2CO2甲酸甲酸(6)(5)(4)(3)(2)(1)H2CO2乙酰乙酰CoAATP乙酸乙酸

5、乙醇乙醇H乙酰乳酸乙酰乳酸CO23-羥基丁酮羥基丁酮H2,3-丁二醇丁二醇CO2H2乙酰乙酰CoAATP乙酸乙酸乙酰乙酰乙酰乙酰CoACO2ATPATPHH丙酮丙酮2-丙醇丙醇丁酸丁酸丁醇丁醇H二二.乙醇生成機(jī)制乙醇生成機(jī)制 脫羧酶脫羧酶 NADH NADNADH NAD+ +葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸 乙醛乙醛 乙醇乙醇1 1molmol葡萄糖按葡萄糖按100%100%生成生成2 2molmol乙醇，重量理論轉(zhuǎn)化率：乙醇，重量理論轉(zhuǎn)化率： 2 2* *46.05/180.1 46.05/180.1 * *100% =51.1 %100% =51.1 % 實(shí)際只有實(shí)際只有95%95%生成乙醇，生

6、成乙醇，5%5%構(gòu)成細(xì)胞或副產(chǎn)物，因構(gòu)成細(xì)胞或副產(chǎn)物，因此乙醇對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率約為此乙醇對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率約為48.5 %48.5 % 副產(chǎn)物副產(chǎn)物：雜醇油、琥珀酸、酯類、糠醛、甲醇：雜醇油、琥珀酸、酯類、糠醛、甲醇等等三、甘油的合成機(jī)制三、甘油的合成機(jī)制1、正常情況，無(wú)氧生成乙醇、正常情況，無(wú)氧生成乙醇2、加入抑制劑（加入抑制劑（NaHSO3),形成甘油形成甘油二型發(fā)酵二型發(fā)酵3、抑制劑不可太多，否則中毒，因此仍有乙醇、抑制劑不可太多，否則中毒，因此仍有乙醇4、堿性（堿性（ pH7.6 ）條件下，）條件下，乙醛歧化乙醛歧化，產(chǎn)生甘，產(chǎn)生甘油、乙醇、乙酸、油、乙醇、乙酸、CO2 酵母的三型發(fā)酵酵母的三型

7、發(fā)酵四、乳酸發(fā)酵機(jī)制四、乳酸發(fā)酵機(jī)制1 1、同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵：產(chǎn)物只有乳酸：產(chǎn)物只有乳酸 NADH NAD NADH NAD+ +葡萄糖葡萄糖=丙酮酸丙酮酸 =乳酸乳酸1 1molmol葡萄糖按葡萄糖按100%100%生成生成2 2molmol乳酸乳酸，乳酸乳酸對(duì)糖的理對(duì)糖的理論轉(zhuǎn)化率：論轉(zhuǎn)化率： 2 2* *90/180 90/180 * *100% =100 %100% =100 %進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的M M：保加利亞乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳桿菌德氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌、干酪乳桿菌干酪乳桿菌2、異型乳酸發(fā)酵通過(guò) HMP途徑的發(fā)

8、酵 *概念葡萄糖發(fā)酵除產(chǎn)生乳酸外還有 CO2 、乙醇或乙酸。i )異型乳酸發(fā)酵經(jīng)典途徑轉(zhuǎn)化率50 腸膜明串腸膜明串珠菌屬珠菌屬利用利用葡萄葡萄糖糖的反應(yīng)的反應(yīng)短乳桿菌利用短乳桿菌利用核糖核糖的反應(yīng)的反應(yīng)ii ) 雙歧桿菌途徑50凈5個(gè)同型、異型乳酸發(fā)酵比較10050五、五、檸檬酸的發(fā)酵機(jī)制 為什么黑曲霉為什么黑曲霉能夠過(guò)量積累能夠過(guò)量積累檸檬酸？檸檬酸？2 丙酮酸脫氫酶丙酮酸脫氫酶3檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶4 烏頭酸水合酶烏頭酸水合酶5 異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶6 酮戊二酸脫酮戊二酸脫氫酶氫酶（一）、檸檬酸積累的機(jī)制：（一）、檸檬酸積累的機(jī)制：1 由于錳離子缺乏抑制了蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)由于錳離

9、子缺乏抑制了蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)致細(xì)胞內(nèi)NH4濃度升高和形成一條呼吸濃度升高和形成一條呼吸活力強(qiáng)的不產(chǎn)生活力強(qiáng)的不產(chǎn)生ATP的側(cè)系呼吸鏈，這的側(cè)系呼吸鏈，這兩方面的原因分別解除了對(duì)兩方面的原因分別解除了對(duì)PFK的代謝的代謝調(diào)節(jié)，促進(jìn)了調(diào)節(jié)，促進(jìn)了EMP途徑的暢通。途徑的暢通。2、由于丙酮酸羧化酶組成型，不被調(diào)節(jié)控、由于丙酮酸羧化酶組成型，不被調(diào)節(jié)控制，就源源不斷地提供草酰乙酸。制，就源源不斷地提供草酰乙酸。原料充足原料充足黑曲酶的標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈和側(cè)系呼吸鏈黑曲酶的標(biāo)準(zhǔn)呼吸鏈和側(cè)系呼吸鏈NADH2琥珀酸琥珀酸黃素蛋白黃素蛋白YXO2側(cè)系呼吸鏈側(cè)系呼吸鏈細(xì)胞細(xì)胞色素色素b細(xì)胞細(xì)胞色素色素c細(xì)胞細(xì)胞色

10、素色素a、a3水楊酰異羥水楊酰異羥 肟肟 酸酸抑菌素抑制抑菌素抑制EMP途徑的磷酸果糖激酶是一種調(diào)節(jié)酶。途徑的磷酸果糖激酶是一種調(diào)節(jié)酶。在正常生理濃度范圍的檸檬酸和在正常生理濃度范圍的檸檬酸和ATP對(duì)酶對(duì)酶有抑制作用，有抑制作用，AMP、無(wú)機(jī)磷和、無(wú)機(jī)磷和NH4對(duì)酶對(duì)酶有活化作用，有活化作用， NH4還能有效解除檸檬酸還能有效解除檸檬酸和和ATP對(duì)此酶的抑制。對(duì)此酶的抑制。一、檸檬酸積累的機(jī)制：一、檸檬酸積累的機(jī)制：3、丙酮酸氧化脫羧生成乙酰、丙酮酸氧化脫羧生成乙酰-CoA和和CO2固定兩個(gè)反應(yīng)固定兩個(gè)反應(yīng)的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合成檸的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調(diào)節(jié)，增強(qiáng)了合

11、成檸檬酸能力。檬酸能力。 來(lái)路暢通來(lái)路暢通4、由于順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立以下平衡：、由于順烏頭酸水合酶在催化時(shí)建立以下平衡： 檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸90：3：7 同時(shí)在控制同時(shí)在控制Fe2+含量時(shí)，順烏頭酸水合酶活力低，使含量時(shí)，順烏頭酸水合酶活力低，使檸檬酸積累，一旦檸檬酸濃度升高到某一水平就抑制檸檬酸積累，一旦檸檬酸濃度升高到某一水平就抑制異檸檬酸脫氫酶活力、從而進(jìn)一步促進(jìn)了檸檬酸自身異檸檬酸脫氫酶活力、從而進(jìn)一步促進(jìn)了檸檬酸自身積累。積累。去路阻斷去路阻斷5、檸檬酸的積累使、檸檬酸的積累使pH值下降，在低值下降，在低pH值下，順烏頭值下，順烏頭酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活，就更有利于檸檬酸酸水合酶和異檸檬酸脫氫酶失活，就更有利于檸檬酸的積累并排出體外。的積累并排出體外。二、二、DCA循循 環(huán)和醋酸發(fā)酵檸檬酸環(huán)和醋