結(jié)構(gòu)生物學(xué)：紅外光譜

1、紅外光譜法紅外光譜法 在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的應(yīng)用在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中的應(yīng)用歷史1666 Newton光譜spectrum1800 Herschel紅外（熱）1801 Ritter紫外（AgCl光解）彩虹自然界的光譜光譜學(xué)紅外線(xiàn)12500 cm-19000cm-14000cm-1400cm-110cm-1800nm1100nm2500nm25000nm 1000000nmWavenumberWavelengthFar IRMid IRNear IRSiliconLead Sufide紅外吸收光譜法 紅外吸收光譜法，也叫紅外分光光度法。 用一束紅外光照射一物質(zhì)時(shí)，該物質(zhì)就要吸收一部分光能，如果這種能量

2、不足以使外層電子發(fā)生躍遷，則能使分子的振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)發(fā)生變化。因此若將其透過(guò)的光用單色器進(jìn)行色散，就可得到一帶暗條的譜帶。如果以波長(zhǎng)或波數(shù)為橫坐標(biāo)，以百分吸收率或透過(guò)率為縱坐標(biāo)，把這譜帶記錄下來(lái)，就得到了該物質(zhì)的紅外吸收光譜圖。 1881Abney&Festing第一次分子結(jié)構(gòu)研究1889Angstrem 光譜co 光譜co2分子 原子 分子光譜學(xué)建立Julius3000cmCH3結(jié)構(gòu)指征-1紅外光譜理論： 量子力學(xué)& 群論紅外光用于結(jié)構(gòu)研究：1900Plank 量子力學(xué)黑體輻射能量不連續(xù)1911Nernst 分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)能量不連續(xù)1912Bjerrum HCl分子光譜H

3、和Cl的相對(duì)位移紅外光譜儀：1908Coblentz NaCl棱鏡光譜儀1910Wood&Trowbridge 光柵光譜儀1918Sleator&Randall 高分辨光譜儀1950美國(guó)PE公司 Perkin-Elmer21雙光束光譜儀擺脫專(zhuān)家，量的普及1969美國(guó)Digilab公司 FTS-14傅立葉變換光譜儀質(zhì)的飛躍快速，高分辨，高信噪比進(jìn)步掃描、時(shí)間分辨、紅外成像紅外頻率copied from /web1/OCOL-II/WIN/SPEC/IR/IRF.HTM 3700 - 2500 cm-1: X-H stretching (

4、X = C, N, O, S) 2300 - 2000 cm-1: C=X stretching (X = C or N) 1900 - 1500 cm-1: C=X stretching (X = C, N, O) 1300 - 800 cm-1: C-X stretching (X = C, N, O) 121212mmkcm m質(zhì)量對(duì)振動(dòng)頻率的影響H2I2MM =2 g/moleMM =254 g/moleThe greater the mass - the lower the wavenumberCC單鍵鍵長(zhǎng) 154 pm，振幅 10 pm。CCC 的角度變化一般是4o，此時(shí)C原子的位

5、移約為10 pm。4o10 pm10 pm154 pm伸縮振動(dòng)彎曲振動(dòng)紅外光譜的來(lái)源 幾乎所有化合物在紅外區(qū)域均有吸收，除了單原子和同極分子如N、H、O2、N2和H2之外。凡是具有不同結(jié)構(gòu)的兩個(gè)化合物一定不會(huì)有相同的紅外光譜，因此紅外吸收光譜法是有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)分析和鑒定的重要方法。紅外光譜的峰位指征生物分子與中紅外光譜3700 - 2500 cm-1: X-H stretching (X = C, N, O, S) 3400cm-1:X-H (X=N,O) 3100cm-1:C-H sp2 2900cm-1:C-H sp3 2500cm-1:S-H2300 - 2000 cm-1: CX st

6、retching (X = C or N) 2200cm-1:三鍵非對(duì)稱(chēng)運(yùn)動(dòng)1900 - 1500 cm-1: C=X stretching (X = C, N, O) 1650cm-1:羰基 1610cm-1:苯基1300 - 800 cm-1: C-X stretching (X = C, N, O) 1300cm-1: P=O stretching 1000cm-1:P-O-C (aliphatic carbon) 1200cm-1&900cm-1:P-O-C(aromatic carbon)分子的非對(duì)稱(chēng)（asymmetric ）的伸縮振動(dòng)或彎曲（bending）運(yùn)動(dòng)形式可以被紅

7、外廣譜技術(shù)研究生物分子 H、C、N、O、S、P生物分子與中紅外光譜蛋白質(zhì) 純蛋白 蛋白骨架（二級(jí)結(jié)構(gòu)與空間結(jié)構(gòu)） 氨基酸殘基 （COOH/COO-1、NH2/NH3、SH/SS、Tyr-OH） 含輔基蛋白 輔基（黃素、卟啉、視黃醛、泛醌）蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)肽鏈的紅外特征吸收帶 吸收帶吸收帶名稱(chēng)名稱(chēng)頻率（cm-1）振動(dòng)模式說(shuō)明酰胺A酰胺B酰胺I酰胺II酰胺III酰胺IV酰胺V酰胺VI酰胺VII-3300-31001690-16001575-14801301-1229767-625800-640606-537-200NH伸縮與酰胺II第一倍頻共振吸收C=O伸縮CN伸縮，NH彎曲CN伸縮，NH彎曲OCN

8、彎曲，混有其它振動(dòng)模式NH面外彎曲C=O面外彎曲骨架扭動(dòng)肽平面的振動(dòng) 紅外光譜技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析經(jīng)歷了定性、半定量和定量研究的三個(gè)發(fā)展階段 。1950年Eliott和Ambrose根據(jù)模型多肽的紅外研究結(jié)果，指出酰胺I帶的1660-1650cm-1吸收歸屬于-螺旋結(jié)構(gòu)，1640-1630cm-1吸收歸屬于-折疊。70年代中期，發(fā)展若干半定量計(jì)算蛋白質(zhì)構(gòu)象的方法。80年代起，紅外光譜法對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的研究步入定量階段。傅里葉變換紅外技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)構(gòu)象定量研究提供了可能性。曲線(xiàn)擬合與二級(jí)結(jié)構(gòu)的定量計(jì)算 對(duì)蛋白質(zhì)的紅外酰胺I帶作曲線(xiàn)擬合處理，可以定量計(jì)算二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。曲線(xiàn)擬合可選用改

9、進(jìn)的Letentz函數(shù)作子峰函數(shù)。兩個(gè)初始基本參數(shù)，子峰數(shù)目及其峰位可從高分辨率的Fourier紅外光譜中得到。確認(rèn)子峰位置后，通過(guò)調(diào)整各子峰的高度及半高度以獲得滿(mǎn)意的擬合對(duì)象有兩種，一種是Byler等采用的傅里葉去卷積譜，另一種是Surewicz采用的傅里葉原始光譜。 1986年，Byler等利用曲線(xiàn)擬合去卷積譜方法(見(jiàn)圖11.17)，求得若干蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量并與X射線(xiàn)衍射法所得的結(jié)果作了比較，兩種方法所得的結(jié)果相當(dāng)一致(見(jiàn)表11.5)。值得提出的是，該方法假設(shè)各構(gòu)象的紅外相對(duì)吸收系數(shù)相等，因而可以由積分面積大小直接得出二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量。當(dāng)然這個(gè)假設(shè)的正確性尚需更多數(shù)據(jù)的支持，但表11.5

10、的結(jié)果初步說(shuō)明不同構(gòu)象成分的紅外相對(duì)吸收系數(shù)是相近的。核糖核酸酶A的去卷積FOURIER紅外酰胺I帶光譜及其曲線(xiàn)擬合譜 一般蛋白質(zhì)和多肽的傅里葉紅外酰胺I去卷積譜包括9到11個(gè)子峰，各子峰的精確峰位由二階導(dǎo)數(shù)確定，各子峰的結(jié)構(gòu)歸屬通過(guò)對(duì)已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的研究予以確定。具體操作步驟簡(jiǎn)述如下：1)選擇已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)測(cè)定其在1700-1600cm-1的酰胺I帶光譜；2)作去卷積變換和二階導(dǎo)數(shù)處理，求出去卷積及二階導(dǎo)數(shù)譜；3)確定子峰峰位并作曲線(xiàn)擬合處理求出各子峰面積，找出結(jié)構(gòu)與譜帶的對(duì)應(yīng)關(guān)系。 19種球蛋白酰胺I帶組分的特征頻率與指認(rèn)平均波數(shù)(cm)指認(rèn) 16942轉(zhuǎn)角 16892轉(zhuǎn)角 16832

11、轉(zhuǎn)角 16755伸展肽鏈 16713轉(zhuǎn)角 16634轉(zhuǎn)角 16534螺旋 16454無(wú)序結(jié)構(gòu) 16373伸展肽鏈 16313伸展肽鏈 16244伸展肽鏈 過(guò)去利用FT-IR法測(cè)定蛋白質(zhì)分子二級(jí)結(jié)構(gòu)時(shí)，大多是分析光譜中的酰胺I區(qū)，但水分子的干擾強(qiáng)烈，定量解析各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量有相當(dāng)大的困難，必須用氘代水作為溶劑，這則是在一般的酶的分離純化中難以做到的。蛋白質(zhì)分子紅外光譜的另外一個(gè)區(qū)域-酰胺III區(qū)，也反映了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，并能定量的反映這些二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，不受水分子的干擾，因此越來(lái)越倍受人們的重視。雖然此區(qū)與酰胺I區(qū)相比光譜的強(qiáng)度要弱得多，但由于現(xiàn)在測(cè)量?jī)x器的高靈敏性和較高的分辨率。現(xiàn)代計(jì)

12、算機(jī)解析程序的介入，使我們利用酰胺III區(qū)對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行定量分析成為可能。Kai等人1995年系統(tǒng)地用酰胺III區(qū)帶的方法研究了凍干條件下誘導(dǎo)的酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)可逆性變化，為酰胺III帶方法的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)的水溶液和氘水溶液譜酰胺III帶振動(dòng)區(qū)域與各種二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系 1 340-1 290cm-1為-螺旋結(jié)構(gòu)， 1 288-1 255cm-1為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)， 1 248-1 220cm-1為-折疊結(jié)構(gòu)。 用RNaseA凍干粉和10mg/ml水溶液經(jīng)掃描測(cè)得原始譜經(jīng)高斯曲線(xiàn)擬合處理，結(jié)果表明：凍干導(dǎo)致-折疊含量明顯增加，-螺旋和無(wú)規(guī)結(jié)構(gòu)下降。 (1)溶劑變性 1984年，Purc

13、ell和Susi應(yīng)用FTIR去卷積和二階導(dǎo)數(shù)譜法研究了牛胰凝乳蛋白酶原A在重水以及MeOD/D2O混合溶劑中的構(gòu)象。結(jié)果表明，天然蛋白中1 636cm-1主峰以及1 647cm-1弱峰屬于-折疊。在氘代甲醇溶劑中，1636cm-1峰的強(qiáng)度明顯減弱，表明-結(jié)構(gòu)成分減小。溶劑變性出現(xiàn)兩個(gè)新峰1 617cm-1和1 686cm-1，表明無(wú)序結(jié)構(gòu)明顯增加。 牛胰凝蛋白酶原A在不同溶劑中的Fourier紅外光譜a.去卷積譜 b.原始光譜 c.二階導(dǎo)數(shù)譜A.天然蛋白溶于重水 B. 天然蛋白60% MeOD/D2O混合溶劑中(2)熱變性和化學(xué)變性即酰胺I帶的1641cm-1和吸收和酰胺II帶的1551cm-

14、1吸收隨溫度升高而減弱，從1641cm-1等峰的吸收變化的絕對(duì)值與溫度的關(guān)系，可以看到大約在58時(shí)構(gòu)象發(fā)生較大的轉(zhuǎn)變。去卷積譜:1)60時(shí)的去卷積譜出現(xiàn)明顯的變化，這與差譜的結(jié)果一致；2)最明顯的譜帶變化是1641cm-1吸收帶(-折疊)隨溫度升高而強(qiáng)度減弱，其峰位波數(shù)與差譜中較大負(fù)峰的峰位波數(shù)精確地一致；3)1641cm-1吸收帶隨溫度而變化的同時(shí)，出現(xiàn)1647cm-1和1637cm-1兩個(gè)新峰，且1652cm-1吸收也在增大。所有這些主要的變化都表明RNaseA的熱誘導(dǎo)構(gòu)象變化主要發(fā)生在-折疊部分,在高于58時(shí)，-折疊中的長(zhǎng)程有序結(jié)構(gòu)完全消失。圖中兩個(gè)頂上的光譜帶都是從70降至28時(shí)測(cè)得的

15、，與升溫前這個(gè)溫度的譜帶幾乎相同。 核糖核酸酶A Fourier紅外酰胺I帶與溫度的關(guān)系。a.原始光譜 b.去卷積譜蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)變化研究 壓力A 紅外譜上從下到上，壓力從0.7到10kbar變化B 表示螺旋的紅外峰強(qiáng)度1650cm-1和壓力的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)表明壓力增加時(shí)，肌紅蛋白的構(gòu)象變得不穩(wěn)定，從天然折疊的構(gòu)象為主變化到無(wú)軌（1645cm-1和構(gòu)象（1624cm-1）為主，即蛋白質(zhì)構(gòu)象變得更加延展產(chǎn)生。P1/2在4和6kbar度附近。Meersman et al.Biophysical Journal 82(5) 26352644A 肌紅蛋白在不同溫度下的紅外圖譜從下到上溫度由20到90攝氏度

16、B 表示螺旋的紅外峰強(qiáng)度1650cm-1和溫度的關(guān)系 實(shí)驗(yàn)表明溫度增加時(shí)，肌紅蛋白的構(gòu)象從天然折疊的構(gòu)象為主變化到構(gòu)象（1624cm-1）為主，且為反平行結(jié)構(gòu)，T1/2在72度附近。蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)變化研究高溫Meersman et al.Biophysical Journal 82(5) 26352644A 肌紅蛋白在不同溫度下的紅外圖譜從下到上溫度由20到25攝氏度，a 和d是實(shí)驗(yàn)前后在20攝氏度下的譜圖；b是28攝氏度；c是10攝氏度。B 表示螺旋的紅外峰強(qiáng)度1650cm-1和溫度的關(guān)系 隨著溫度下降，肌紅蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)含量下降，當(dāng)再次提高溫度時(shí)，部分蛋白無(wú)法復(fù)性。T1/2在-12.7度附

17、近。蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)變化研究低溫Meersman et al.Biophysical Journal 82(5) 26352644氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)變化研究Tyr 2階導(dǎo)數(shù)圖實(shí)線(xiàn)25攝氏度蛋白虛線(xiàn)95攝氏度蛋白圖A 蛋白再變性劑形成的微球上圖B蛋白在lecithin脂質(zhì)體球liposome上S. Sukumaran et al. / FEBS Letters 579 (2005) 25462550 上圖蛋白中的酪氨酸在變性劑微球（黑方塊）以及l(fā)ecithin脂質(zhì)體球（黑球體）上的溫度依賴(lài)的結(jié)構(gòu)變化。 下圖蛋白構(gòu)象在變性劑微球以及各種脂質(zhì)體球上的溫度以來(lái)變化。S. Sukumaran et al. /

18、 FEBS Letters 579 (2005) 25462550氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)變化研究Tyr氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)變化研究Cys 上圖光受體蛋白的光循環(huán)機(jī)制。 光受體蛋白在給光和無(wú)光狀態(tài)下的差譜。實(shí)線(xiàn)是水溶液中的實(shí)驗(yàn)，虛線(xiàn)是氘水中的結(jié)果。Ataka et al. Biophysical Journal 84(1) 466474含輔基蛋白輔基：黃素、卟啉、視黃醛、泛醌含輔基蛋白黃素和cysSHAtaka et al. Biophysical Journal 84(1) 466474光受體蛋白 紅外差譜 Mb(+CO)Mb(CO) (a)Wt (b)E7Gly (c)E7Val (d)E7Phe (e)

19、E7Arg (f)E7Asp (g)E7Tyr (h)E7Met含輔基蛋白卟啉光誘導(dǎo)的BR結(jié)構(gòu)變化：光中間體M（13順視黃醛）無(wú)光狀態(tài)蛋白（全反視黃醛）Zscherp & Heberle (1997).含輔基蛋白視黃醛含輔基蛋白泛醌ATPase(Ca2+)-ATPase：粗線(xiàn)是非磷酸化的酶的紅外差譜 細(xì)線(xiàn)是磷酸化的酶的紅外差譜 1550cm-1指征Ca2+和COO1的鰲合峰，這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明鈣離子與ATPase的結(jié)合位點(diǎn)不受磷酸化影響。Barth et al. 1997蛋白質(zhì)鈣離子蛋白質(zhì)底物 圖A是caged ATP的光解進(jìn)程示意圖 圖B 圖A所示進(jìn)程的紅外差譜：粗線(xiàn)是沒(méi)有ATPase(Ca