生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)：米氏常數(shù)

1、蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定操作方法蔗糖酶米氏常數(shù)的測(cè)定操作方法1）將離子交換柱層析得的）將離子交換柱層析得的E3稀釋稀釋(pH4.6 HAC緩沖液緩沖液) )至至20U/mL20U/mL，共共16ml。2）取試管取試管8支，按支，按0-7編號(hào)，編號(hào)，0為對(duì)照管。為對(duì)照管。3）按表）按表1將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于將蔗糖液、醋酸緩沖液分別加入試管中，于35水浴中保溫水浴中保溫（使（使溫度平衡，以下同）溫度平衡，以下同）10min。4）取約取約16ml酶液，放入酶液，放入同一水浴中保溫約同一水浴中保溫約10min。5）于各管中依次按于各管中依次按同樣時(shí)間間隔同樣時(shí)間間隔加入已保溫過的酶液加入

2、已保溫過的酶液2ml，記時(shí)，立即搖記時(shí)，立即搖勻。在勻。在35水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)3min。6）按按同樣次序和時(shí)間間隔同樣次序和時(shí)間間隔，加入，加入0.5ml的的1mol/L NaOH，搖勻，終止反應(yīng)。搖勻，終止反應(yīng)。7）吸取反應(yīng)混合物）吸取反應(yīng)混合物0.5ml，加入盛有加入盛有3ml DNS試劑和試劑和1.5ml去離子水的血糖去離子水的血糖管中，放入沸水中加熱管中，放入沸水中加熱5min，冷卻后稀釋定容至冷卻后稀釋定容至25ml，搖勻后，測(cè)定搖勻后，測(cè)定A540值。值。反應(yīng)物反應(yīng)物活力測(cè)定活力測(cè)定數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理管管號(hào)號(hào)0.1mol/L蔗糖液蔗糖液pH4.6buffer酶液酶液（ml

3、）1mol/LNaOH(ml)吸取吸取反應(yīng)物反應(yīng)物(ml)DNS試劑試劑(ml)水水(ml)A540底物底物濃度濃度(S)1/S1/A002.002.000.50.531.5010.41.602.000.50.531.50.01010020.51.502.000.50.531.50.01258030.61.402.000.50.531.50.01566.740.81.202.000.50.531.50.025051.01.002.000.50.531.50.0254061.50.502.000.50.531.50.037526.772.00.002.000.50.531.50.05020數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)處理： 以以A A值作為相對(duì)反應(yīng)速度，以值作為相對(duì)反應(yīng)速度，以1/1/S S為橫坐為橫坐標(biāo)，