DNA聚丙烯酰胺凝膠電泳

1、1。變性：二、聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳適宜分離鑒定低分子量蛋白質(zhì)、小于 1Kb 的 DNA片段和DNA序列分析 . 其裝載的樣品量大，回收 DNA純度高. 長(zhǎng)度僅相差0.2%(即 500bp 中的 1bp)的核苷酸 分子即能分離.聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體，在催化劑TEMED(N，N， N， N'一四甲基乙二胺) 和 過(guò)硫酸銨的作用下，丙烯酰胺聚合形成長(zhǎng)鏈，聚丙烯酰胺鏈在交聯(lián)劑，N， N'一亞甲 雙丙烯酰胺參與下，聚丙烯胺鏈與鏈之間交叉聯(lián)接而形成凝膠.聚丙烯酰胺凝膠孔徑的大小是由丙烯酰胺的濃度決定的，不同濃度丙烯酰胺和DNA的 有效分離范圍見表2.丙烯酰胺(%)

2、 有效分離范圍(bp) 溴酚蘭 * 二甲苯青 *3.510020001004605.080500652608.0604004516012.040200307015.025150156020.0101001245* 表中給出的數(shù)字為與指示劑遷移率相等的雙鏈DNA分子所含堿基對(duì)數(shù)目(bp).（ 一 ） 材料1 電泳儀器: 電泳儀，垂直電泳槽及其附件.2 準(zhǔn)備工作：1。 必要時(shí)可用KOH/甲醇清洗玻璃板和間隔片2用溫?zé)岬娜ノ蹌┤芤合礈觳Ａ烷g隔片，再充分漂洗，先用自來(lái)水，再用去離子水，應(yīng)拿取玻璃板的邊緣部分或戴手套操作，以免手上的油脂殘留再玻璃板的工作面上。用乙醇沖洗玻璃板，并將其至于一邊晾干。3

3、安裝玻璃與間隔片：將較大的（不帶拗口）玻璃板平放在試驗(yàn)臺(tái)上，在玻璃板的兩側(cè)將間隔片平行至于邊緣放妥：用凡士林輕涂以幫組與間隔片在后面操作中保持原位；將那板在間隔片上放穩(wěn)。2.30%丙烯酰胺丙烯酰胺，29 克N， N'一亞甲基雙丙烯酰胺，1 克H2O，加至100ml裝于棕色瓶?jī)?nèi)，4可保存二個(gè)月.3.10%過(guò)硫酸銨過(guò)硫酰銨，1 克加水至，10ml4可保存一周，-20 可保存一個(gè)月.4.1XTBE 電 泳 緩 沖 液 ：（ 89mmol/lTris- 硼 酸 ，2mmol/lEDTA（ph8.0）,TBE 用5×儲(chǔ)備液稀釋即可，緩沖液PH8.35.TEMED（四甲基乙烯基二胺）35

4、ul（ 二 ） 聚丙烯酰胺凝膠的制備與電泳根據(jù)分離DNA片段的大小及需凝膠的容積，配制聚丙烯酰胺凝膠 .1. 按要求裝配好垂直電泳板，兩塊玻璃板的兩側(cè)及底部用 1%的瓊脂糖封邊， 防止封閉不嚴(yán)而使聚丙烯酰胺液漏出.2. 將裝好的玻璃電泳板傾斜成45 60角.3. 按表 3 配制所需%濃度凝膠的毫升數(shù).4. 將上述液體加入TEMED35ul后，立即混勻，緩緩倒入兩玻璃板間的膠床中，直到液體接近溢出時(shí)為止. 最后加入1mlH2O覆蓋層，室溫靜置30min 左右至分離膠凝聚，傾去覆蓋層，并用吸水紙吸凈。5. 將上述液體混勻后加入電泳槽中立即插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，密切注意防止梳齒下產(chǎn)生氣泡，用一有力的夾將梳

5、子夾在一邊的玻璃板上，然后將玻璃板斜靠在物體上，使 成 10°角，可減少液體泄漏的機(jī)會(huì).6. 室溫聚合1h 后（聚合完全后，用1 × TBE浸潤(rùn)的紙巾保繞梳子和凝膠的頂部，然后用saran wrap 膜密封整塊凝膠，4度保存，直至使用），將玻璃板插入電泳槽中，上緊，倒入1XTBE 緩沖液7. . 當(dāng)準(zhǔn)備好電泳時(shí)，在梳子周圍及頂部噴些1 × TBE緩沖液，從聚合的凝膠中小心取出梳子，立即用注射器吸取1 × TBE 緩沖液沖洗加樣孔，因?yàn)槭嶙尤〕龊?，梳子上吸附的及凝膠頂部未聚合的丙烯酰胺會(huì)流入加樣孔內(nèi)聚合，產(chǎn)生不規(guī)則的表面，將導(dǎo)致以后DNA電泳帶型不規(guī)則.

6、用剃刀除去凝膠底部的密封條8. 將 DNA樣品與適量的載樣緩沖液混勻后（ 制備樣品：取中號(hào) EP管，每管加入10ul,4*loading buffer, 加樣2030ul （視樣品濃度而定）, 混勻后，煮沸5min, 離心 ），加到樣品孔內(nèi)，加樣時(shí)不要產(chǎn)生氣泡. （加樣孔中的氣泡要用注射器針頭除去）9. 接好電極，電壓為 1-8V/cm ， 進(jìn)行電泳. 電泳80V× 1hr,然后調(diào)置100V*4hr10. 根據(jù)指示劑遷移位置來(lái)判定是否終止電泳.11. 電泳畢，切斷電源，棄去電泳儀，取出膠床板，小心移去一塊玻璃板， 讓凝膠吸附在另一塊玻璃板上. 浸入含0.5ug/ml 的溴化乙錠溶液中

7、，15 30min 后取出水洗紫外儀下觀察結(jié)果.12. 聚丙烯酰胺凝膠電泳只能檢出>10ng 以上量的DNA條帶 . 要求更高的靈敏度，可用銀染.銀染1. 染色液：溴化乙定溶液(貯存液0.5ug/ml )( TAE配 置 ： EB 為 10mg/ml ， 取1ul,1*10(-3)ml*10mg/ml=10(-2)mg,10(-2)/x=0.5*10(-3)x=20ml ) , 亞甲基藍(lán)貯存液( 0.001%-0.0025%,TAE 配置)2. 步驟： 1。將凝膠及其附著的玻璃板輕輕的浸泡入需用的染色液，染色液正好將凝膠沒住即可，室溫染色3045min2以玻璃板為支持物將凝膠從染液中取出

8、，水沖洗后用KIMwipe 紙巾蘸去凝膠表面多余的液體3用一張saran warp 膜覆蓋在凝膠上，用梳子寬的一端或折疊的 K紙巾除去S膜上的氣泡，4在紫外透光源上放一張S 膜，將凝膠倒置，放在透光源上，移去玻璃板，凝膠留在S膜上2。非變性法醫(yī)的非變性聚丙烯酰安凝膠電泳1. 基因組提取DNA1 Chelx-100配方 :TE buffer: 1M Tris HCL(PH=8.0)Tris base 121.9gGlass-diatilled800ml(concentrated HCL) 45mL10ml0.5M EDTA 0.2mlGlass distilled (deconized wate

9、r)990ml擴(kuò)增水Dd H2O 100ml1M NAOH 200ul2. 步驟：取全血40ul 加入1.5ml 管中加入TE1ml室溫，15min離心10000 轉(zhuǎn)，5min棄上清，加入chelex200ul56 度水浴，30min冰箱保存唾液拭子：剪下于1.5ml 管中，加ddH2O1 ml,10min, 來(lái)回吸液沖柱，抽液體離心，棄上請(qǐng)，加入chelex-100(200ul) 和蛋白酶 K（3ul）,36 度水浴 30min, 沸水8 10min, 取出冰浴5min, 離心備用3擴(kuò)增：Dd H2O（擴(kuò)增水）15.65ul（ 可變 ）D NTP6（不變）10*buffer 3.75（ 不變

10、 ）Primer10.3 （不變）Primer20.3 （不變）Taq 酶 （5U/ul）: 加入 0.3ul,（3U/ul）: 加入 0.5ul0.5（ 可變） （ 加入量為1.5U）BSA 3.75 （不變）Mg2+ 2.25 （不變）樣本 DNA5（可變）總體積37.52. 電泳1膠配方：（7%）30PAG8.2ml三者可以一起用（7的膠），總體積為 36ml10×TBE3.5mlH2O 23.3mlTEMED 30ulPA 300ul膠配方：（6%）30 PAG（雙丙稀15G總體積單丙稀285GH2O1000ml7ml 三者可以一起用（6的膠），總體積為36ml10× TBE 3.5mlH2O 24.5mlTEMED 30ulPA 300ul3. 到膠：長(zhǎng)板靠正版（紅紐），短板靠負(fù)極（黑紐），膠液從長(zhǎng)板上面倒入，注意無(wú)氣泡（PAG有神經(jīng)毒）緩沖液：1× TBE（5*TBE 的配方，稀釋即可）Tris54g 總體積硼酸27.5g1000mlEDTA 3.72gH2O6 PAG30%PAG 200ml5*TBE 200ml1000ml加水定容4. 加樣：樣本2.5ul載體 buff