安全選擇標(biāo)記和無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展(定稿)

1、LOGOThe Advances in Research of the Transgenic Plants with Safe or No Selection Markers小組成員：竇富強(qiáng)、鄢苗、張哲、張作林小組成員：竇富強(qiáng)、鄢苗、張哲、張作林指導(dǎo)老師：張椿雨指導(dǎo)老師：張椿雨 教授教授安全選擇標(biāo)記和無選擇標(biāo)記安全選擇標(biāo)記和無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究進(jìn)展引言引言v轉(zhuǎn)基因植物的形成過程（以Bt抗蟲棉為例）： 在這個(gè)過程中，為了提高在這個(gè)過程中，為了提高對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選效率，我們對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選效率，我們不可避免地引入了不可避免地引入了 M Marker Gene ，如圖中的抗生素

2、基因。，如圖中的抗生素基因。引言引言 （一）轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展及意義 改良遺傳性狀（二）轉(zhuǎn)基因技術(shù)的現(xiàn)狀 標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化后仍留在植物體，植物及環(huán)境安全性能否能到保障？ 為此，科學(xué)家們提出了無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物（Marker-Free Transgenic Plants，MFTPs）的概念。目錄目錄標(biāo)記基因的潛在危害安全篩選標(biāo)記技術(shù)MFTPS獲得途徑一、標(biāo)記基因的潛在危害一、標(biāo)記基因的潛在危害（1）安全性安全性：antibiotic resistance（抗生素抗性標(biāo)記基因）（抗生素抗性標(biāo)記基因） ： cross talk （水平轉(zhuǎn)移）、（水平轉(zhuǎn)移）、 gene escape（基因逃逸）（基因逃逸）he

3、rbicide resistance（除草劑抗性標(biāo)記基因）：（除草劑抗性標(biāo)記基因）： ecological risk（2）影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生影響轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生（3）影響多重轉(zhuǎn)化影響多重轉(zhuǎn)化二、安全篩選標(biāo)記技術(shù)二、安全篩選標(biāo)記技術(shù)2.1 基因正向選擇基因正向選擇（Positive Selection）的安全標(biāo)記基因的安全標(biāo)記基因（1）與激素生物合成有關(guān)的基因）與激素生物合成有關(guān)的基因異戊烯基轉(zhuǎn)移酶基因ipt和吲哚-3-乙酰胺水解酶基因IaaH。（2）與糖類代謝有關(guān)的基因）與糖類代謝有關(guān)的基因與糖類代謝有關(guān)的基因主要包括甘露糖磷酸異構(gòu)酶基因pmi，木糖異構(gòu)酶基因xylA和核糖醇操縱子rtl。（3）與氨

4、基酸代謝有關(guān)的基因）與氨基酸代謝有關(guān)的基因l 主要有D-氨基酸氧化酶(DAAO)和天冬氨酸激酶(AK)等。l 細(xì)菌的ak基因?qū)嚢彼岷吞K氨酸并不敏感。二、安全篩選標(biāo)記技術(shù)二、安全篩選標(biāo)記技術(shù)2.2 基于負(fù)向選擇的安全標(biāo)記基因基于負(fù)向選擇的安全標(biāo)記基因 利用來源于植物的基因（如菠菜BADH基因）作為選擇標(biāo)記基因，該基因所編碼的甜菜堿脫氫酶將有毒的甜菜堿醛轉(zhuǎn)化為無毒的甜菜堿。2.3 基于可視化選擇的安全標(biāo)記基因基于可視化選擇的安全標(biāo)記基因 維多利亞水母中分離出的綠色熒光蛋白(GFP)二、安全篩選標(biāo)記技術(shù)二、安全篩選標(biāo)記技術(shù)2.4 該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)：該技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)：l ipt 基因 優(yōu)點(diǎn)：高水平有利于

5、轉(zhuǎn)化植物的再生，提高轉(zhuǎn)化率。 缺點(diǎn)：ipt的低水平表達(dá)會導(dǎo)致植物表型的反常變化，如植物出現(xiàn)莖不伸長，側(cè)根難以形成等一系列不正常的發(fā)育現(xiàn)象；l GFP基因 優(yōu)點(diǎn)：能夠?qū)D(zhuǎn)化細(xì)胞進(jìn)行可視化觀察，方法靈活，范圍廣泛，檢測快捷，使用方便。 缺點(diǎn)：野生型GFP發(fā)光較弱，熒光反應(yīng)也不是酶反應(yīng)，且不能通過添加某些物質(zhì)來加強(qiáng)信號,更不易對熒光進(jìn)行定量檢測。另外，GFP基因在植物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)頻率并不高，甚至在某些植物細(xì)胞中并不表達(dá)。三、三、MFTPS 獲得途徑獲得途徑First approach：excise or segregate a marker gene from a target geneSecond

6、 approach：overexpression of the isopentenyl transferase (ipt) gene無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物（Marker-free Transgenic Plants，MFTPS）三、三、MFTPS 獲得途徑獲得途徑3.1 Excise a marker gene( (標(biāo)記基因移除標(biāo)記基因移除) ) 技術(shù)流程：技術(shù)流程： 利用通常的選擇標(biāo)記篩選出初級轉(zhuǎn)基因植株，然后利用轉(zhuǎn)基因植株后代遺傳重組使選擇標(biāo)記與目的基因分離，或利用位點(diǎn)特異性酶將標(biāo)記基因切除而培育無選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。 標(biāo)記移除技術(shù)標(biāo)記移除技術(shù)：co-transformatio

7、n(共轉(zhuǎn)化)homologous recombination（同源重組)site-specific recombination system(位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng))transposes mediated reorientation(轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的再定位系統(tǒng)) multi-auto-transformation vector(MAT載體系統(tǒng))tissue specific expression(組織特異性表達(dá)）三、三、MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.1 Co-transformation（共轉(zhuǎn)化）（共轉(zhuǎn)化）農(nóng)農(nóng)桿桿菌菌介介導(dǎo)導(dǎo)三、三、MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.1 Co-transforma

8、tion（共轉(zhuǎn)化）（共轉(zhuǎn)化）無標(biāo)記基因無標(biāo)記基因三、三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.1 Co-transformation無標(biāo)記基因無標(biāo)記基因三、三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 目前對煙草、擬南芥、水稻、玉米、油菜、大豆、小麥等都已成功目前對煙草、擬南芥、水稻、玉米、油菜、大豆、小麥等都已成功。不適于馬鈴薯、甘蔗等無性繁殖植物，不適于多年生植物。不適于馬鈴薯、甘蔗等無性繁殖植物，不適于多年生植物。3.1.1 Co-transformation（共轉(zhuǎn)化）（共轉(zhuǎn)化）應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例三、三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 3.1.2 Homologous Recombination（同源重組

9、）（同源重組） 同源重組發(fā)生在同源重組發(fā)生在DNA的同源序列之間，只要兩條的同源序列之間，只要兩條DNA序列相序列相同或相近，重組就可以在此序列中的任何一點(diǎn)發(fā)生。同或相近，重組就可以在此序列中的任何一點(diǎn)發(fā)生。 3.1.2 Homologous Recombination（同源重組）（同源重組） 用選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選并獲得轉(zhuǎn)基因植株后，再重新導(dǎo)入一段序列，使標(biāo)記基因置于2個(gè)DNA同源序列之間，通過染色體內(nèi)重組將含有選擇標(biāo)記的DNA片段去除，獲得MFTPS。三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑基基因因打打靶靶三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑成功地應(yīng)用于動物和微生物，植物上尚處于探索階段。3.1.2 Ho

10、mologous Recombination（同源重組）應(yīng)用實(shí)例（同源重組）應(yīng)用實(shí)例三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 該方法利用重組酶催化2個(gè)短的特定DNA序列間的重組，將位于這兩個(gè)短DNA序列中間的選擇標(biāo)記基因篩除，獲得無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物。已發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)包括Cre/loxp、FLP/FRT、R/RS和Gin/gix、attp等5種。3.1.3 Site-specific Recombination System（位點(diǎn)特異性重組）（位點(diǎn)特異性重組） Cre/loxP系統(tǒng)是目前位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)中研究較多的一種，其原理是將標(biāo)記基因構(gòu)建于2個(gè)同向重復(fù)的lox位點(diǎn)(34 bp)之間，

11、將目的基因構(gòu)建于lox位點(diǎn)之外。在獲得轉(zhuǎn)基因植株后,再誘導(dǎo)植株體內(nèi)Cre基因的表達(dá)，將位于lox位點(diǎn)之間的選擇標(biāo)記基因切除。 （王賀偉等，2013）三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 Cre重組酶介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的重組是一個(gè)動態(tài)、可逆的過程，可以分成三種情況：v1、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，且方向相同，Cre重組酶能有效切除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間的序列；v2、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)位于一條DNA鏈上，但方向相反，Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè)LoxP位點(diǎn)間

12、的序列倒位；v3、如果兩個(gè)LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre酶能介導(dǎo)兩條DNA鏈的交換或染色體易位。3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）三三、MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.3 Site-specific Recombination System（Cre/loxP）三三、MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.3 Site-specific Recombination System應(yīng)用實(shí)例：應(yīng)用實(shí)例： Andrew等以pART27為骨架構(gòu)建了一個(gè)ART54-PCre-1去標(biāo)記系統(tǒng)，其中pART54載體TDNA中含

13、一個(gè)uidA報(bào)告基因，一個(gè)nptII選擇標(biāo)記基因和一個(gè)指示刪除反映的負(fù)標(biāo)記基因codA，PCre載體是一個(gè)含有Cre基因和hpt基因的雙元載體。 Luo等開發(fā)的基于該系統(tǒng)的“基因刪除(GM-Gene-Deletor)”技術(shù)（2007），以高效的外源基因刪除效率成功應(yīng)用于煙草、玉米(Zea mays)和油菜(Brassica，napus)等經(jīng)濟(jì)植物。三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.4 Transposes Mediated Reorientation（轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)）（轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)） 通過轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座作用實(shí)現(xiàn)基因重組，轉(zhuǎn)座子由自主成員和非自主成員兩部分組成，如玉米的Ac/Ds系統(tǒng)，其自主成員

14、Ac基因編碼轉(zhuǎn)座酶用于自身和非自主成員Ds基因的轉(zhuǎn)座。非自主成員是由自主成員缺失了某些序列后所形成的，不具備合成轉(zhuǎn)座酶的能力。非自主成員兩端有數(shù)百個(gè)核苷酸是必需的，中間可換成或插入較大的外源基中間可換成或插入較大的外源基因因，而插入外源基因的非自主成員仍能同自主成員一起被轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)移。把標(biāo)記基因置于整個(gè)轉(zhuǎn)座子的外部，目的基因?qū)⒃O(shè)于非自主成員內(nèi)部，轉(zhuǎn)化后植物可通過轉(zhuǎn)座作用將二者分離，最后分離出無標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因后代。三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑3.1.4 Transposes Mediated Reorientation應(yīng)用實(shí)例：應(yīng)用實(shí)例： 金維正等（2003）， 利用了Ac/Ds轉(zhuǎn)座系統(tǒng)獲得了

15、無選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)基因水稻；（目的基因轉(zhuǎn)座） Ebinuma等（1997）和CotsafIis等（2002），就是采用標(biāo)記基因轉(zhuǎn)座，得到了高轉(zhuǎn)化頻率且僅含有目的基因的轉(zhuǎn)基因煙草和水稻。（標(biāo)記基因轉(zhuǎn)座）三三、 MFTPS獲得途徑獲得途徑 該方法將選擇標(biāo)記基因同位點(diǎn)特異重組R/RS體系或玉米的轉(zhuǎn)座元件進(jìn)行整合，利用特異性重組或轉(zhuǎn)座將轉(zhuǎn)化細(xì)胞中的標(biāo)記基因剔除。3.1.5 Multi-auto-transformation (MAT)載體系統(tǒng)載體系統(tǒng)三、MFTPS獲得途徑獲得途徑l R/RS是從酵母中獲得另外一種位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)。重組酶基因切除與之相鄰位于重組位點(diǎn)RS之間的DNA片段。將選擇標(biāo)記基因

16、位于RS之間，而目的基因位于RS區(qū)域外。 l sugit等報(bào)道了兩步法轉(zhuǎn)化煙草，MAT載體中R重組酶由來源于玉米的化學(xué)誘導(dǎo)啟動子谷膚甘膚-s-轉(zhuǎn)移酶(GST-n-27)啟動，轉(zhuǎn)基因植株培養(yǎng)添加外源除草劑的解毒劑SafenerR29148即可激活，R重組酶的將篩選標(biāo)記iPt切除，從而高效獲得無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物(圖3)。經(jīng)過二次篩選，獲得大量的單拷貝、無篩選標(biāo)記且表型正常的植株。3.1.5 Multi-auto-transformation (MAT)載體系統(tǒng)應(yīng)用載體系統(tǒng)應(yīng)用 3.1.6 Tissue Specific Expression（組織特異性）（組織特異性） 利用一個(gè)能在時(shí)間或空間上

17、起控制作用的組織特異性表達(dá)的啟動子（如G10-90、AoPRLl、AFP啟動子等）調(diào)控選擇標(biāo)記基因在轉(zhuǎn)化位點(diǎn)的表達(dá)，即使選擇標(biāo)記基因只在早期篩選時(shí)表達(dá)，而在轉(zhuǎn)基因植株生長過程中不表達(dá)，也可能在成熟植株中獲得不表達(dá)選擇標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化體。 在食用植物上有重要的應(yīng)用價(jià)值，例如定向刪除果實(shí)、菜葉等食用器官中的標(biāo)記基因，以降低對人體健康的影響。三、MFTPS獲得途徑獲得途徑三、MFTPS獲得途徑獲得途徑 3.1.6 Tissue Specific Expression（組織特異性）（組織特異性） 應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例A、腫瘤特異性調(diào)控元件調(diào)控基因表達(dá)腫瘤特異性調(diào)控元件調(diào)控基因表達(dá) 許多腫瘤都有其自身特異性的

18、標(biāo)志物，即腫瘤相關(guān)抗原。將治療治療基因置于這類抗原的順式調(diào)控元件（如啟動子、增強(qiáng)子）的調(diào)控之下基因置于這類抗原的順式調(diào)控元件（如啟動子、增強(qiáng)子）的調(diào)控之下，可以使目的基因在相應(yīng)的腫瘤細(xì)胞中獲得高表達(dá)，正常細(xì)胞由于缺乏與該順式調(diào)控元件相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄激活因子等原因而不表達(dá)該基因。B B、組織特異性調(diào)控元件調(diào)控基因表達(dá)、組織特異性調(diào)控元件調(diào)控基因表達(dá) 這類調(diào)控元件調(diào)控元件與腫瘤特異性調(diào)控元件并沒有嚴(yán)格的界限，外源基因在組織特異性啟動子調(diào)控下，可使基因治療局限于發(fā)生癌變的組織和基因治療局限于發(fā)生癌變的組織和器官中器官中，而不至于給其它組織帶來損害。 例如：Selvakumaran等 從鼠卵巢中分離得到462bp的卵巢特異性啟動子，并用于卵巢癌的基因治療。 3.2 Marker-free Mransformation(無標(biāo)記轉(zhuǎn)化）的轉(zhuǎn)化技術(shù)無標(biāo)記轉(zhuǎn)化）的轉(zhuǎn)化技術(shù) 左鍵儒等發(fā)現(xiàn)在擬南芥中可利用化學(xué)調(diào)控(chemical-inducible),DNA位點(diǎn)切除(site-specific DNA excision system)調(diào)控 Cre/loxP 載體DNA 重組系統(tǒng)。重組酶的表達(dá)受雌激素載體融合XVE反式激活因子嚴(yán)格控制。被感應(yīng)到的-雌二醇，可標(biāo)記編碼序列，Cre和兩個(gè)loxP端夾住的XVE從擬南芥的基因組移除。 Sum等在擬南芥基因組中發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因