大腸癌早期診斷技術(shù)PPT課件

1、Septin9基因甲基化結(jié)直腸癌早期診斷基因甲基化結(jié)直腸癌早期診斷 早發(fā)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)大腸癌早期發(fā)現(xiàn)大腸癌 無創(chuàng)傷無創(chuàng)傷無恐懼感無風(fēng)險(xiǎn)無恐懼感無風(fēng)險(xiǎn) 高靈敏高靈敏與腸鏡符合率與腸鏡符合率95.6% 易采樣易采樣僅需抽取靜脈血僅需抽取靜脈血u已經(jīng)獲得了國際專利；u獲得了歐盟CE認(rèn)證；u即將取得美國FDA認(rèn)證，完成了近萬例臨床試驗(yàn)。u美國和歐洲的著名臨床檢測中心已列為常規(guī)檢測項(xiàng)目，至今已檢測幾十萬例。u美國和歐洲已將此檢測列入醫(yī)療保險(xiǎn)。u國內(nèi)正在進(jìn)行SFDA申報(bào)的臨床實(shí)驗(yàn)。u參與國內(nèi)重大課題“五癌”篩查國家項(xiàng)目，并已經(jīng)啟動。Epi公司Septin9基因甲基化進(jìn)行結(jié)直腸癌早期診斷的國際認(rèn)證1結(jié)直腸

2、癌背景介紹3大腸是消化系統(tǒng)的最后一部分，是一個長約1.5米的較粗的管狀器官。大腸由兩個主要部分組成：結(jié)腸和直腸。它們在腹部彎曲病形成一個圍繞著小腸的長方形。4世界范圍內(nèi)結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率高u癌癥是世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，每年全球約800萬人死于癌癥，其中結(jié)直腸癌是人類最常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤第三位，隨著人口趨向老齡化，生活水平日益提高，飲食結(jié)構(gòu)發(fā)生改變等因素的影響，在西方發(fā)達(dá)國家，結(jié)直腸癌已成為僅次于肺癌的第二大惡性腫瘤。u結(jié)直腸癌是腫瘤中第二大殺手，每年在美國有140,000新發(fā)病例，以及每年導(dǎo)致50,000人死亡；u在發(fā)達(dá)國家中，北美和歐洲發(fā)病率最高，每10萬人中

3、就有15-20人死于結(jié)直腸癌； 中國結(jié)直腸癌發(fā)病率與死亡率呈急劇上升趨勢u近十年發(fā)病率逐年攀升u每年新發(fā)約40萬人u每年死亡約19.5萬人u每年增速約為4.2%，遠(yuǎn)超2%的國際平均水平u已從第六位躍為第三位u在上海是第二位，僅次于肺癌21 2012 中國腫瘤登記年報(bào)2 2013年第九屆上海國際大腸癌高峰論壇報(bào)道結(jié)直腸癌早期篩查可以拯救生命病人病人5 5年生存率年生存率早期篩查73%73%不做早期篩查46%u結(jié)直腸癌患者在診斷時(shí)，80%為中晚期，早期診斷的比例僅為11.8%。u有效的早期篩查和干預(yù)治療可使癌的發(fā)生率下降60%，病死率下降80%篩查可提高結(jié)直腸癌篩查可提高結(jié)直腸癌5 5年生存率年生

4、存率 Epigenomics AG Corporate Presentation 2013.1中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院監(jiān)測數(shù)據(jù)北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院，上海市疾控中心李世榮, 大腸癌早期診斷的基本策略.繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育, 2007. 21(9): p. 22-25 目前中國結(jié)直腸癌檢測主要有兩種方法：目前中國結(jié)直腸癌檢測主要有兩種方法：n便潛血檢測 (FOBT)和糞便免疫化學(xué)法（FIT）：主要針對消化道出血；糞便樣本，采樣不方便；假陽性率高，結(jié)果穩(wěn)定性差；受檢率3%n結(jié)腸鏡檢查: 雖然是檢測金標(biāo)準(zhǔn)， 但患者對檢查有恐懼感，存在腸道出血及感染等風(fēng)險(xiǎn)，依從性差； 左右半腸結(jié)果差異明顯。受檢率5%n現(xiàn)有方法受檢率低

5、，急需更易于患者接受的早期檢測方法。結(jié)直腸癌的方法和面臨的主要問題便潛血（FOBT) 檢測結(jié)腸鏡檢查患者的需求？早發(fā)現(xiàn)早發(fā)現(xiàn)能夠早期能夠早期發(fā)現(xiàn)大腸癌發(fā)現(xiàn)大腸癌無無創(chuàng)傷創(chuàng)傷沒有恐懼感，沒有風(fēng)險(xiǎn)沒有恐懼感，沒有風(fēng)險(xiǎn)高靈敏高靈敏檢出率高檢出率高易易采樣采樣不臟，不煩，不痛不臟，不煩，不痛v我們提供的方法：我們提供的方法：v采采10ml10ml血樣血樣v95.6%95.6%與腸鏡吻合與腸鏡吻合v可檢測到可檢測到I I期結(jié)腸癌期結(jié)腸癌v當(dāng)日拿到檢測結(jié)果當(dāng)日拿到檢測結(jié)果2Septin9基因檢測項(xiàng)目介紹1011DNA提取和轉(zhuǎn)化對照組熒光定量PCR技術(shù) 包括 oligos, 聚合酶、和專利的緩沖液對照是基于

6、博爾誠提供的細(xì)胞系基于磁珠提取及專利的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化技術(shù)12S SEPTINEPTIN9 9的生物學(xué)功能的生物學(xué)功能人類SEPTIN (SEPT) 蛋白家族成員-13個在在SeptinSeptin蛋白家族中，蛋白家族中，Septin9Septin9蛋白最明顯的蛋白最明顯的特征：特征：長延伸的N端可變區(qū)非極性的脯氨酸富集區(qū)缺少C端螺旋區(qū)Septin蛋白復(fù)合物的形成Septin9 Septin9 獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征決定了其在復(fù)合物中的位置獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征決定了其在復(fù)合物中的位置 缺少C端螺旋區(qū)的Septin9 蛋白，使其位于在八聚體復(fù)合中末端。 暴露的Septin9 N端可變區(qū)影響復(fù)合物的整體功能。 保守

7、的Septin9 N端的脯氨酸富集區(qū)決定了復(fù)合物的非極性末端。哺乳動物的Septin蛋白家族形成非極性、棒狀八聚體的復(fù)合物（SEPT9-SEPT7SEPT6SEPT2SEPT2SEPT6SEPT7-SEPT9)。SEPTIN蛋白復(fù)合物在細(xì)胞分裂期的作用Septin蛋白復(fù)合物參與細(xì)胞分裂的功能：1. Cytoskeletal scaffold （細(xì)胞骨架的支架），平行于肌動蛋白應(yīng)力纖維（Actin filament），為參與肌球蛋白II（Myosin II）活性的分子提供附著點(diǎn)，參與Rho信號通路，涉及細(xì)胞類型和功能變化。2. Diffusion barrier（膜蛋白擴(kuò)散障礙），束縛跨膜蛋白和

8、胞內(nèi)膜蛋白的無序擴(kuò)散。腫瘤細(xì)胞具有很高的膜動力學(xué)特征。若若Septin9Septin9蛋白蛋白失調(diào)，失調(diào)，SeptinSeptin蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，從而擾亂細(xì)胞分裂過程，導(dǎo)蛋白復(fù)合物結(jié)構(gòu)失去穩(wěn)定，從而擾亂細(xì)胞分裂過程，導(dǎo)致細(xì)胞朝癌變發(fā)展致細(xì)胞朝癌變發(fā)展甲基化5甲基胞嘧啶基因啟動子區(qū)甲基化效應(yīng)：基因表達(dá)下降或失活，蛋白水平下降效應(yīng)：基因表達(dá)下降或失活，蛋白水平下降甲基化是腫瘤發(fā)生的早期事件Epigenetic changes resulting in transcriptional silencing of cancer genes are among the most frequentl

9、y discovered evens in human tumor samples and altered chromain structure in 5-regulatory region. Hypermethylation of gene promoter associated CpG islands occurs early during colorectal cancer development, suggesting its utility as a molecular marker for both early detection and monitoring progressio

10、n of the disease.- Glockner, S.C., et al., Cancer Research, 2009, 69:4691-9在基因啟動子區(qū)域CpG島區(qū)域發(fā)生的甲基化事件，通常發(fā)生在結(jié)直腸癌的早期，因此可以把甲基化作為結(jié)直腸癌早期診斷和監(jiān)測疾病進(jìn)展的分子標(biāo)記物。Septin9基因啟動子gamma區(qū)域的甲基化導(dǎo)致該基因的表達(dá)發(fā)生改變發(fā)生甲基化的發(fā)生甲基化的septin9septin9基基因從腫瘤細(xì)胞中脫落，因從腫瘤細(xì)胞中脫落，進(jìn)入血管進(jìn)入血管血液血液游離甲基化片段游離甲基化片段和腫瘤細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞結(jié)直腸癌的癌變與septin9基因甲基化游離游離DNADNA血紅細(xì)胞血紅細(xì)胞

11、 腫瘤細(xì)胞腫瘤細(xì)胞德國EpiGenomics公司專利的外周血游離DNA甲基化檢測技術(shù)提高了微量甲基化DNA檢測的靈敏度Blocker引物屏蔽非甲基化的DNA，避免其與探針結(jié)合。特異水解探針的應(yīng)用提高了血液中甲基化基因的檢出率。德國Epigenomics公司在世界不同國家，包括中國都申請了該技術(shù)的專利游離的腫瘤游離的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞DNADNA大腸大腸 血管血管Septin 9Septin 9基因基因的甲基化在腫的甲基化在腫瘤中特異發(fā)生瘤中特異發(fā)生 SEPTIN9 基因甲基化結(jié)直腸癌的檢測原理n外周血采樣n甲基化基因檢測n熒光定量PCR法n自動化結(jié)果判讀自動化結(jié)果判讀腫瘤細(xì)胞正常細(xì)胞CE數(shù)據(jù)2011

12、.9德國埃爾蘭根大學(xué)醫(yī)學(xué)院提交FDA關(guān)鍵臨床數(shù)據(jù)FDA補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)2012.12病例對照 ARUP實(shí)驗(yàn)室 腫瘤病理分期pT1pT4pT1pT4pT0/Tis pT4pT0/Tis pT4病例數(shù)2471847,940300144敏感性80.6%179.3%68%171%190%2特異性99.3%199%80%186%188%2注：CE要求是I期期腫瘤病人。FDA要求腺瘤，原位癌和I期期腫瘤病人。 1) Epigenomics AG Corporate Presentation 2013.12) Case control study results with ARUPs LDT test publis

13、hed Nov 16, 201124國內(nèi)臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)顯示SEPTIN9檢測針對中國人群同樣具有高靈敏性和特異性總數(shù)靈敏性特異性結(jié)直腸癌組4785.1% （4047)健康正常組36100% （3636）u檢測樣本總數(shù)83例，包括47例結(jié)直腸癌和36例健康對照u結(jié)果：靈敏性85.1%，特異性100%SEPTIN9 檢測可檢出大部分早期大腸癌Warren, J.D., et al., Septin 9 methylated DNA is a sensitive and specific blood test for colorectal cancer. BMC Med, 2011. 9: p. 13

14、3. SEPTIN9檢測結(jié)腸左右側(cè)無差異左側(cè)腫瘤右側(cè)腫瘤Septin9檢測96.4%94.4%便潛血檢測83.3%50.0%Grutzmann, R., et al., Sensitive detection of colorectal cancer in peripheral blood by septin 9 DNA methylation assay. PLoS One, 2008. 3(11): p. e3759.注：注：FIT 國內(nèi)不常用。國內(nèi)不常用。這組數(shù)據(jù)結(jié)果是這組數(shù)據(jù)結(jié)果是Epigenomics在美國采用目前最先進(jìn)靈敏度最高的試劑盒（日本產(chǎn)），受檢者連續(xù)三在美國采用目前最先進(jìn)靈

15、敏度最高的試劑盒（日本產(chǎn)），受檢者連續(xù)三天取便樣，檢測天取便樣，檢測3次大便標(biāo)本。次大便標(biāo)本。1)Chin J Gastroenterol，2001，Vo|6，No 4 244-2512) Case control study results with Epi proColon 2.0 final product published Sep 19, 2011 3) Case control study results with ARUPs LDT test published Nov 16, 2011方法靈敏性特異性Septin9 2,380.6%99.3%愈刨木酯法gFOBT1便潛血試驗(yàn)45

16、.8%78.9%免疫法iFOBT1便潛血試驗(yàn)52.9%86.1%免疫化學(xué)法 FIT(美國數(shù)據(jù)）便潛血（3次便樣）2,368.2%70.6%癌胚抗原CEA2、351.8%85.3%28SEPTIN9結(jié)直腸癌檢測適用于哪些人群u1）一般風(fēng)險(xiǎn)人群：大于40歲人群u2）高風(fēng)險(xiǎn)人群：結(jié)直腸癌家族史和家族性腺瘤性息肉病,大于20歲人群。炎癥性腸病多年不愈、病變范圍較廣的潰瘍性結(jié)腸炎化放療治療效果評估，術(shù)后檢測。u建議上述人群，每年進(jìn)行一次結(jié)直腸癌早期篩查。 The Best Screening Test Is the Screening Test That Gets Done .最好的篩查項(xiàng)目是容易操作的

17、項(xiàng)目 -Sidney Winawer, MD Chief of Gastroenterology at Memorial Sloan Kettering Cancer Center ASCO 2001 The Best Test Is the Test the Patients Can Get and Will Take.最好的檢測是病人能夠做并愿意做的檢測-Durado BrooksAmerican Cancer Societyhttp:/ -2009專家評語SEPTIN9 結(jié)直腸癌篩查檢測周期短DNA提取及亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化 5小時(shí)整個結(jié)果在8小時(shí)內(nèi)完成SEPTIN9 結(jié)直腸癌篩查就診流程u與腸鏡檢測“優(yōu)勢互補(bǔ)”，提高腸鏡的一次陽性檢出率u與腸鏡檢測有很高的符合率可使用的四種熒光定量PCR儀Applied Biosystems 7500 Fast Dx配有SDS 1.4軟件帶有21 CFR part 11Roche LightCycler 480 Instrument ISoftware Version 1.5Roche LightCycler 480 Instrument IISoftware Version 1.5Applied Biosystems 7500 Fast配有SDS 1.4軟件SEPTIN9 結(jié)直腸癌早期篩查早發(fā)現(xiàn)