《分析樣品制備技術(shù)》教學(xué)課件—3.5-色譜分離法

1、色譜分離法簡(jiǎn)介 色譜分離法簡(jiǎn)介 1、色譜分離技術(shù)的概念 2、色譜分離系統(tǒng)的組成 3、色譜分離技術(shù)的分類 4、色譜法的特點(diǎn)1、色譜分離技術(shù)的概念 色譜（chromatography）分離技術(shù)是一類分離方法的總稱，又稱色譜法、層析法、層離法等。它是利用不同組分在固定相和流動(dòng)相中的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分在兩相中以不同的速率移動(dòng)而進(jìn)一步分離的技術(shù)。 色譜分離法簡(jiǎn)介 固定相:在色譜法中，表面積較大的固體或附著在固體上且不運(yùn)動(dòng)的液體，靜止不動(dòng)的一相稱為固定相； 流動(dòng)相:自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相 。2、色譜分離系統(tǒng)的組成 色譜分離法簡(jiǎn)介 根據(jù)分離時(shí)一次進(jìn)樣量的多少，色譜分離的規(guī)

2、模可分為: 色譜分析規(guī)模(小于10mg)、 半制備(1050mg)、 制備規(guī)模(0.110g)和 工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模(10g)。色譜分離的規(guī)模小，但產(chǎn)值高。3、色譜分離技術(shù)的分類 色譜分離法簡(jiǎn)介3、色譜法的分類 超臨界流體色譜流動(dòng)相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體 根據(jù)流動(dòng)相的相態(tài)不同:氣相色譜以氣體作流動(dòng)相液相色譜以液體作流動(dòng)相 色譜分離法簡(jiǎn)介固定相涂敷在玻璃或金屬板上薄層色譜3、色譜法的分類根據(jù)固定相的附著方式分類 液體固定相涂在紙上紙色譜(平板色譜) 固定相裝在圓柱管中柱色譜 色譜分離法簡(jiǎn)介 色譜法的缺點(diǎn)是處理量小、操作周期長(zhǎng)、不能連續(xù)操作。4、色譜法的特點(diǎn)(1) 分離效果高(2) 應(yīng)用

3、范圍廣(3) 選擇性強(qiáng)(4) 設(shè)備簡(jiǎn)單 色譜分離法簡(jiǎn)介 1、色譜分離技術(shù)的概念 2、色譜分離系統(tǒng)的組成 3、色譜分離技術(shù)的分類 4、色譜法的特點(diǎn)總結(jié)紙色譜法1、概念 紙色譜法又稱紙層析法，是一種以濾紙為載體的色譜分離方法。紙色譜法12對(duì)濾紙的一般要求是：（1）質(zhì)地和厚薄必須均勻，邊緣整齊，平整無(wú)折痕，無(wú)污漬。（2）紙纖維疏松度適當(dāng)。過(guò)于疏松易使斑點(diǎn)擴(kuò)散，過(guò)于緊密則流速慢。（3）有一定的強(qiáng)度，不易斷裂。（4）純度高，不含填充劑，灰分在0.01%以下。否則金屬離子雜質(zhì)會(huì)與某些組分結(jié)合，影響分離效果。1、概念 紙色譜法又稱紙層析法，是一種以濾紙為載體的色譜分離方法。紙色譜法 (1)劃線：先將濾紙放在

4、被有機(jī)溶劑的蒸氣所飽和的容器內(nèi)，確定起始線及原點(diǎn)，用鉛筆在離濾紙一端23cm處畫一直線。(2)點(diǎn)樣：用一支吸取試樣的毛細(xì)管點(diǎn)在濾紙的原點(diǎn)上，再將濾紙一端浸入有機(jī)溶劑中。（3）展開：點(diǎn)樣斑點(diǎn)直徑為0.20.5cm，干燥后再展開。（4）測(cè)量：2、紙色譜法的操作過(guò)程紙色譜法 紙色譜法的展開方法上行展開法徑向展開法下行展開法二向展開法紙色譜法常用比移值Rf來(lái)表示某組分在濾紙上的移動(dòng)情況，其表達(dá)式為：比移值最大等于1，此時(shí)組比移值最大等于1，此時(shí)組分隨展開劑一起上升到濾紙前沿；比移值比移值最小等于0，此，此時(shí)組分始終留在原點(diǎn)，組分不隨展開劑上升而停留在原點(diǎn)。紙色譜法3、紙色譜法的基本原理1、濾紙中的纖維

5、素通常吸收20。25的水分，其中約6的水分子通過(guò)氫鍵與纖維素上的經(jīng)基結(jié)合，在分離過(guò)程中不隨有機(jī)溶劑流動(dòng)，形成紙色譜中的固定相；2、有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，又稱展開劑。3、待分離組分在固定相和流動(dòng)相分配或吸附的差異來(lái)進(jìn)行分離。紙色譜組分固定相：不流動(dòng)吸附的水或其他溶劑流動(dòng)相/展開劑：沿著濾紙流動(dòng)的溶劑或混合溶劑紙色譜法 吸附色譜是靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。吸附力主要是范德華力，有時(shí)也可能形成氫鍵或化學(xué)鍵。吸附法的關(guān)鍵是選擇吸附劑和展開劑。3、紙色譜法的基本原理常見的展開劑及其極性大小順序如下：水乙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯氯仿乙醚甲苯苯四氯化碳環(huán)己烷醇、酰胺伯胺酯、醛、酮腈、叔胺、硝

6、基化合物醚烯烴鹵代烴烷烴（2）展開劑：選擇展開劑時(shí)，主要考慮極性，其洗脫能力與極性成正比。分離極性大的化合物贏選用極性展開劑，而分離極性小或非極性的化合物應(yīng)選用極性小的展開劑。單一溶劑極性大小順序如下：酸吡啶甲醇乙醇正丙醇丙酮乙酸乙酯乙醚氯仿二氯甲烷甲苯苯四氯化碳二硫化碳環(huán)己烷石油醚二、吸附劑與展開劑的選擇 （1）制板 傾注法： 將適量過(guò)濾倒入燒杯中，加少量水?dāng)嚢璩删鶆蚝隣?，迅速倒在玻璃板上，用玻棒小心鋪平，輕輕振動(dòng)，盡量使吸附劑均勻。然后風(fēng)干，置于烘箱中，在105110下活化45min左右，取出放于干燥器中備用。 刮平法：將一長(zhǎng)條玻璃的兩邊放置兩塊合適的玻璃為邊，再將調(diào)好的糊狀硅膠迅速倒在玻

7、璃板上，用有機(jī)玻璃尺沿一個(gè)方向?qū)⒐枘z刮為均勻薄層。去掉兩邊玻璃，晾干、活化，取出放于干燥器中備用。 涂布器法：用轉(zhuǎn)移的涂布器（市售或自制）來(lái)制作薄層，快速方便，制成的薄板質(zhì)量好。三、薄層色譜法操作過(guò)程（2）點(diǎn)樣 用一根玻璃毛細(xì)管或點(diǎn)樣器，吸取樣品溶液，在距薄層一端約2cm的起始線上點(diǎn)樣，每點(diǎn)間距約2cm，樣品點(diǎn)直徑一般小于0.5cm。注意點(diǎn)樣量要適中，太少時(shí)，某些成分不能被檢出；太多時(shí)容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，即每個(gè)斑點(diǎn)都拉得很長(zhǎng)，互相重疊，不能分開。 (3）展開 將點(diǎn)好樣的薄層板置于已為展開劑蒸氣飽和的層析缸中，點(diǎn)有樣品的一端浸入展開劑中，蓋好蓋子，使層析缸密閉，直至展開完畢。 對(duì)于樣品中的有色組分

8、，在薄層上會(huì)出現(xiàn)對(duì)應(yīng)的有色斑點(diǎn)，而無(wú)色組分需用合適方法使其斑點(diǎn)顯色，顯色之前應(yīng)使展開劑完全揮發(fā)。 三、薄層色譜法操作過(guò)程(4)檢測(cè)顯色也稱定位，即用某種方法使經(jīng)色譜展開后的混合物斑點(diǎn)呈現(xiàn)顏色，以便觀察其位置，顯色方法主要有以下幾種: 蒸氣顯色法：利用樣品組分與單質(zhì)碘、液溴、濃氨水等物質(zhì)的蒸氣作用而顯色。將上述易揮發(fā)物質(zhì)放于密閉容器中，再將展開劑已完全揮發(fā)的薄層板放入則顯色。 顯色劑顯色法：將一定濃度的顯色劑溶液均勻噴灑在薄層上，是樣品組分顯色。 紫外顯色法：某些化合物在紫外光照射下回發(fā)出熒光，可將展開劑揮發(fā)后的薄層在紫外燈下觀察熒光斑點(diǎn)，并用鉛筆在薄層上做記號(hào)。一些不發(fā)熒光的物質(zhì)用熒光衍生化試

9、劑作用后也可用同樣的方法觀察。 三、薄層色譜法操作過(guò)程四、注意事項(xiàng)1）展開時(shí)，層析缸中的有機(jī)溶劑蒸氣必須達(dá)到飽和，否則，Rf值將不能重現(xiàn)。2）在薄層用的吸附劑中，硅膠適用于酸性和中性組分的分離，堿性組分與硅膠有相互作用，不易展開，或發(fā)生拖尾現(xiàn)象，不好分離；氧化鋁適用于堿性好中性組分的分離，但不適用于酸性組分的分離。3）如果單一展開劑效果不好，可以用混合溶劑，通過(guò)改變?nèi)軇┙M分和比例來(lái)調(diào)整展開劑的極性，從而達(dá)到分離效果的目的。4）點(diǎn)樣時(shí)要注意待前一滴溶劑揮發(fā)后再點(diǎn)后一滴，這樣能夠使點(diǎn)成的斑點(diǎn)盡量小，不會(huì)嚴(yán)重?cái)U(kuò)散。5）樣品濃度要合適，太高容易引起斑點(diǎn)拖尾，太低則斑點(diǎn)擴(kuò)散，一般控制濃度為0.1%1%。

10、五、薄層色譜法-應(yīng)用 痕量組分的檢測(cè) 同系物與異構(gòu)體分離 無(wú)機(jī)離子的分離 薄層色譜法概念及原理 吸附劑與展開劑的選擇 薄層色譜法操作過(guò)程 注意事項(xiàng) 薄層色譜法應(yīng)用 總結(jié)固相萃取概念與原理一 、固相萃取(SPE)概念SPE ：Solid Phase Extraction是一種液相色譜分離，利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物與干擾化合物分離，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。固相萃取概念與原理慢中等快淋洗液固相萃取概念與原理二 、固相萃取的模式及原理 陰離子交換 陽(yáng)離子交換反相固相萃取正相固相萃取離子交換固相萃取固相萃取概念與原理1、反相固相萃取流動(dòng)相：極性（水溶液）或中等極性固定相：非極性。分

11、離對(duì)象：中等到非極性物質(zhì)。 固相萃取概念與原理（1）反相固相萃取原理分析物中的CH鍵 + 硅膠表面官能團(tuán)吸附極性溶液中的有機(jī)分析物保留在SPE。用非極性溶劑解吸吸附在固定相中的目標(biāo)物質(zhì)。 固相萃取概念與原理（2）常用反相固相萃取柱LC-18、LC-8 ：標(biāo)準(zhǔn)的單鍵合硅膠ENVI-18、ENVI-8 ：聚合鍵合類填料ENVI-Chrom P：苯乙烯：疏水 ENVI-Carb：含碳 固相萃取概念與原理2、正相固相萃取流動(dòng)相：非極性、中等極性固定相：極性。分析物質(zhì)：極性、中等極性、非極性固相萃取概念與原理（1）正相固相萃取原理 保留取決于分析物的極性官能團(tuán)與吸附劑表面的極性官能團(tuán)之間的相互作用。 用

12、比樣品本身更極性的溶劑洗脫吸附的分析物質(zhì)。固相萃取概念與原理（2）常用正相固相萃取柱 極性官能團(tuán)鍵合硅膠 LC-CN， LC-NH2， LC-Diol 極性吸附物質(zhì) LC-Si， LC-Florisil， ENVI-Florisil， LC-Alumina固相萃取概念與原理流動(dòng)相固相萃取概念與原理目標(biāo)物質(zhì)分離 固相萃取(SPE)概念 固相萃取的模式及原理 反相固相萃取 正相固相萃取總結(jié)固相萃取操作篩板篩板篩板固相萃取的裝置固相萃取操作1、固相萃取的裝置固相萃取操作1、固相萃取的裝置固相萃取操作 1、固相萃取的裝置流量控制閥 堵頭 裝置頂蓋 頂蓋支腳 導(dǎo)向針 試管架 真空表 玻璃缸 廢液槽固相萃

13、取操作2、操作程序（1）活化吸附劑 萃取之前要用適當(dāng)?shù)娜軇┝芟葱≈?，以使吸附劑保持濕?rùn)，可以吸附目標(biāo)化合物或干擾化合物。固相萃取操作2、操作程序（2）上樣（吸附） 樣品倒入活化后的固相萃取小柱，然后利用抽真空，加壓或離心的方法使樣品進(jìn)入吸附劑。固相萃取操作2、操作程序 （3）洗滌（去除雜質(zhì)）在樣品進(jìn)入吸附劑，目標(biāo)化合物被吸附后，可先用較弱的溶劑將弱保留干擾化合物洗掉。固相萃取操作2、操作程序 （4）洗脫和收集 再用較強(qiáng)的溶劑將目標(biāo)化合物洗脫下來(lái)，加以收集。固相萃取操作活化吸附劑進(jìn) 樣洗 滌洗 脫總結(jié)固相萃取的應(yīng)用HPLC與SPE的比較固相萃取的應(yīng)用1、柱子的比較 柱接頭 螺帽柱管 過(guò)濾片型號(hào)：C18柱管篩板固定相尖端？固相萃取的應(yīng)用2、塔板數(shù)的比較N = L/H固相萃取的應(yīng)用五、固相萃取 應(yīng)用1、食品領(lǐng)域應(yīng)用2、環(huán)境檢測(cè)應(yīng)用3、藥物分析中的應(yīng)用固相萃取的應(yīng)用1、食品領(lǐng)域應(yīng)用農(nóng)藥殘留：茶葉中519種農(nóng)藥及相關(guān)化學(xué)品殘留量的測(cè)定（GB/T 23204-2008）獸藥殘留：水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定（GB/T 20361-2006）污染物： 動(dòng)植物油脂中苯并（a）芘的測(cè)定（GB/T 5009.27-2016）非食用物質(zhì)：食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法（GB/T 19681-2005）固相萃取的應(yīng)用2、環(huán)境檢測(cè)應(yīng)用 水