毛細(xì)管電泳與超臨界流體色譜

1、第四部分第四部分 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳與超臨界流體色譜與超臨界流體色譜 第一章第一章 毛細(xì)管電泳毛細(xì)管電泳 第一節(jié)第一節(jié) 概述概述一、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）又稱高效毛細(xì)管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和（或）分配系數(shù)的不同而進(jìn)行分離的一類新型液相分離技術(shù)。 二、毛細(xì)管電泳的發(fā)展史及新動(dòng)向 瑞典科學(xué)家Tiselius在1937年首先提出電泳，創(chuàng)造了Tiselius電泳儀，并建立了移動(dòng)界面電泳方法。1948年他獲

2、得了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。 1988年美國(guó)Bio-Rad公司研制出第一臺(tái)毛細(xì)管電泳儀HPE-100型 。 1989年在Boston召開首屆HPCE專題會(huì)議。 1981年，Jorgenson創(chuàng)立了毛細(xì)管電泳技術(shù) 。三、電泳與色譜1. 作用原理作用原理2. 分離過(guò)程分離過(guò)程3. 儀器構(gòu)成儀器構(gòu)成4. 分離通道的形狀分離通道的形狀四、毛細(xì)管電泳的特點(diǎn) 1. 高靈敏度 紫外檢測(cè)器的檢測(cè)限可達(dá)10- -1310- -15 mol，激光誘導(dǎo)檢測(cè)器可達(dá)10- -1910- -21 mol； 三高二少一廣三高二少一廣 2. 高分離效能 每米理論塔板數(shù)可達(dá)幾百萬(wàn)甚至幾千萬(wàn)； 3. 高速度 通常的分析時(shí)間不超過(guò)30 mi

3、n。有1.7 min內(nèi)分離19種陽(yáng)離子及3 min內(nèi)分離30種陰離子的報(bào)道； 4. 樣品用量少 只需納升級(jí)的進(jìn)樣量； 5. 分析成本低（消耗少） 只需少量（幾毫升）流動(dòng)相，分析過(guò)程是在價(jià)格低廉的毛細(xì)管柱中進(jìn)行行； 6. 應(yīng)用范圍廣 可分離小分子（氨基酸、藥物等）、離子（無(wú)機(jī)及有機(jī)離子）、生物大分子（蛋白質(zhì)等）、甚至各種顆粒（如細(xì)胞、硅膠顆粒等），具有“萬(wàn)能”分析功能或潛力。 五、毛細(xì)管電泳的分類 1. 毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE） 又稱自由溶液毛細(xì)管電泳 2. 毛細(xì)管凝膠電泳（CGE） 屬非自由溶液電泳，含有“分子篩”效應(yīng)。 3. 毛細(xì)管等速電泳（CITP） 電泳型 4. 毛細(xì)管等電聚焦（CIEF

4、） 按等電點(diǎn)分離，屬電泳型，要求完全抑制電滲流動(dòng)。 5. 膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MECC） 又稱電動(dòng)色譜（EKC），是電泳技術(shù)和色譜技術(shù)巧妙結(jié)合的分離新技術(shù)，為CZE擴(kuò)展的色譜型。 6. 毛細(xì)管電色譜（CEC） 又稱毛細(xì)管電動(dòng)色譜，屬非自由溶液色譜型。 7. 微乳液電動(dòng)毛細(xì)管色譜（MEEKC） 為CZE擴(kuò)展的色譜型 8. 非水毛細(xì)管電泳（NACE） 屬自由溶液電泳型。 第二節(jié) 毛細(xì)管電泳理論一、電泳和電泳淌度 電泳電泳是帶電粒子在直流電場(chǎng)作是帶電粒子在直流電場(chǎng)作用下于一定介質(zhì)（溶劑）中所發(fā)用下于一定介質(zhì)（溶劑）中所發(fā)生的定向移動(dòng)。生的定向移動(dòng)。 在電場(chǎng)作用下，帶電粒子定向遷移的速度（電泳速度）可

5、用下式表示： Euepep電泳速度淌度電場(chǎng)強(qiáng)度 電場(chǎng)強(qiáng)度是指單位距離的電壓降（V/cm）。 淌度（mobility）是指溶質(zhì)在單位電場(chǎng)下的遷移速度，即單位電場(chǎng)下的電泳速度。 在無(wú)限稀釋溶液中（稀溶液數(shù)據(jù)外推）測(cè)得的淌度稱為絕對(duì)淌度（absolute mobility） 。 絕對(duì)淌度是在無(wú)限稀釋時(shí)單位電場(chǎng)強(qiáng)度下帶電粒子的平均遷移速度，是該離子在一定溶液中的特征物理常數(shù)。 電場(chǎng)力： 根據(jù)流體力學(xué)知道，（球型）離子的流動(dòng)阻力F Ff ：qEFE離子電荷溶劑粘度離子有效半徑ErruFepf66 一定時(shí)間后，兩種力的作用達(dá)到平衡，即FE = Ff，此時(shí)離子作勻速運(yùn)動(dòng)，電泳進(jìn)入穩(wěn)態(tài)。 qEErep6iep

6、rq326溶液的介電常數(shù)粒子的Zeta電勢(shì)棒狀粒子： 4iep 顯然，分子半徑小，電荷大的離子具有較大的電泳淌度，而分子半徑大，電荷小的離子具有較小的電泳淌度。 有效淌度（effective mobility）是實(shí)際測(cè)出的離子淌度，可表示為：epiief樣品分子中的第i級(jí)解離度活度系數(shù) 它與帶電粒子的電荷、形狀、大小、離解度、溶劑化作用，溶劑的介電常數(shù)、粘度、pH值和溫度有關(guān)。 電泳分離的基礎(chǔ)是建立在各分離組分有效淌度的差異上。 二、電滲 電滲流（electroosmotic flow，EOF），簡(jiǎn)稱電滲，是指管內(nèi)溶液在外力電場(chǎng)作用下整體向一個(gè)方向運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象。 HPCE通常采用的是石英毛細(xì)管柱

7、，一般情況下（pH3），硅醇基（SiOH）電離為硅氧基負(fù)離子（SiO- -），使管壁表面帶負(fù)電，為了保持電荷平衡，溶液中水合離子（一般為陽(yáng)離子）被吸附到表面附近，形成雙電層。當(dāng)在毛細(xì)管兩端加高電壓時(shí)，雙電層中的陽(yáng)離子向陰極移動(dòng)，由于離子是溶劑化的，所以帶動(dòng)了毛細(xì)管中溶液整體向陰極移動(dòng)，產(chǎn)生電滲流。 電滲流的大小可用電滲速度和電滲淌度os表示。 EEuososos 一般情況下，電滲流的速度是電泳速度的57倍。電滲速度電滲淌度管壁的Zeta電勢(shì)三、表觀淌度和權(quán)均淌度 在毛細(xì)管電泳中，同時(shí)存在電泳和電滲，若不考慮它們之間的相互作用，粒子在毛細(xì)管內(nèi)的遷移速度應(yīng)當(dāng)是電泳速度和電滲速度的矢量和，即 ：Eu

8、uu)(efosefosapefosap表觀遷移速度電滲速度電泳速度表觀淌度 組分 表觀淌度 表觀遷移速度正離子中性分子負(fù)離子efososefos-efosuuosuefosuu-分離后出峰次序?yàn)椋赫x子中性分子負(fù)離子+- -+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - - - - - - - - - - - - - - - -

9、 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -圖圖 毛細(xì)管分離示意圖毛細(xì)管分離示意圖四、兩相分配與權(quán)均淌度 如果特意在毛細(xì)管中引入另一相，稱為 P 相，樣品在電遷移過(guò)程中同時(shí)會(huì)發(fā)生相間分配，其遷移速度或淌度將發(fā)生變化，這樣改變了的粒子遷移速度和淌度，稱為加權(quán)平均速度和加權(quán)平均淌度，簡(jiǎn)稱權(quán)均速度和權(quán)均淌度。 設(shè)相分配過(guò)程遠(yuǎn)快于電泳過(guò)程，則有： pppappkkkEu111容

10、量因子樣品在P相中的分子數(shù)樣品在溶劑相中的分子數(shù)P相的表觀淌度sppnnk P相在電場(chǎng)中可靜止，也可遷移，運(yùn)動(dòng)方向可正、可負(fù)。利用引入P相，可使中性組分產(chǎn)生不同的權(quán)均淌度，因而解決了中性組分在毛細(xì)管電泳中的分離問(wèn)題。 （一）遷移時(shí)間tR五、分離效率與譜帶展寬 帶電粒子從進(jìn)樣口遷移至檢測(cè)窗所用的時(shí)間，稱為遷移時(shí)間。 VLLuLtddRap遷移時(shí)間毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度毛細(xì)管的總長(zhǎng)度外加電壓（二）柱效和塔板高度 25 . 0)(54. 5WtnRnLHd理論塔板數(shù)遷移時(shí)間半峰寬塔板高度毛細(xì)管的有效長(zhǎng)度（三）譜帶展寬 1. 流型 以電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)產(chǎn)生的EOF，與HPLC 中靠外部泵壓產(chǎn)生的液流不同。EOF的流

11、型屬扁平流型或稱“塞流”。扁平型的塞子流不會(huì)引起樣品區(qū)帶的增寬，是毛細(xì)管電泳高效的重要原因 。 HPLC的流型則是拋物線狀的層流，它在壁上的速度為零，中心速度為平均速度的2倍。 Van Deemter方程： 空心毛細(xì)管柱，則用Golay方程式表示：CuB/uAHCuB/uH渦流擴(kuò)散項(xiàng)分子擴(kuò)散項(xiàng)傳質(zhì)阻力 由于在毛細(xì)管電泳中，無(wú)固定相和流動(dòng)相兩相，因此不存在傳質(zhì)項(xiàng)，而且速度流型又是扁平的，于是只有縱向擴(kuò)散項(xiàng)：D/uB/uH2DELDu/Ln2/2dapd擴(kuò)散系數(shù) 毛細(xì)管電泳特別適合分離生物大分子。 2. 自熱 15003cEd管徑是影響自熱的一個(gè)重要因素。理論上：E=50kV/m，c=0.01mo

12、l/L，d140 m實(shí)際應(yīng)用2575 m的毛細(xì)管 使用小內(nèi)徑、大外徑的毛細(xì)管，適當(dāng)降低外加電壓、降低緩沖溶液的濃度以及對(duì)毛細(xì)管恒溫等均可以減小溫度梯度，提高柱效。3. 擴(kuò)散與吸附（1 1）擴(kuò)散 （2 2）吸附 組分與毛細(xì)管壁的相互作用主要為管壁對(duì)組分的吸附。 六、分離度 分離度是指將淌度相近的組分分開的能力。 4)(2121221RRRRttWWttR-遷移時(shí)間峰底寬度標(biāo)準(zhǔn)偏差分離度也可表示為柱效的函數(shù)： 不考慮電滲流時(shí)： )(4efefnR)(4uunR當(dāng)考慮電滲流時(shí)： 2/1)(241osefdefDLVLR第三節(jié) 毛細(xì)管電泳儀器系統(tǒng) 毛細(xì)管電泳儀主要包括高壓電源、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測(cè)

13、系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。 1234655圖圖 毛細(xì)管電泳裝置示意圖毛細(xì)管電泳裝置示意圖1高壓電源高壓電源 2檢測(cè)器檢測(cè)器 3液冷溫控毛細(xì)管液冷溫控毛細(xì)管 4數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng)數(shù)據(jù)記錄系統(tǒng) 5緩沖液槽緩沖液槽 6緩沖液緩沖液一、高壓電源 常用的高壓電源為能提供030 kV，電流為200300 A的連續(xù)可調(diào)的直流高壓電源，為了獲得遷移時(shí)間的高重現(xiàn)性，操作電壓要穩(wěn)定在0.1%范圍內(nèi)。 高壓電源要能夠切換極性，最好是雙極性高壓源。 必須注意高壓的安全保護(hù)問(wèn)題。 高壓源有恒壓、恒流或恒功率等方式。最常用的是恒壓源。 二、進(jìn)樣系統(tǒng) 毛細(xì)管內(nèi)徑很小，進(jìn)樣量必須很少，一般進(jìn)樣長(zhǎng)度為毛細(xì)管總長(zhǎng)度的1%2%。進(jìn)樣體積為納升

14、（nl）級(jí)。所以毛細(xì)管的進(jìn)樣采用無(wú)死體積的進(jìn)樣方法。 毛細(xì)管的進(jìn)樣是讓毛細(xì)管直接與樣品接觸，然后由重力、電場(chǎng)力或其他動(dòng)力來(lái)驅(qū)動(dòng)樣品流入管中，進(jìn)樣量可以通過(guò)控制驅(qū)動(dòng)力的大小或時(shí)間長(zhǎng)短來(lái)控制。 在毛細(xì)管電泳中常采用的進(jìn)樣方式為電遷移進(jìn)樣和流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣，除此還有擴(kuò)散進(jìn)樣。 1. 電遷移進(jìn)樣apVSuQ ErcEScQcQosefosefVin)()(2000進(jìn)樣體積毛細(xì)管的橫截面積進(jìn)樣時(shí)間進(jìn)樣量樣品濃度 電動(dòng)進(jìn)樣的控制參數(shù)是電場(chǎng)強(qiáng)度E和進(jìn)樣時(shí)間 。通過(guò)改變進(jìn)樣電壓和進(jìn)樣時(shí)間可以控制進(jìn)樣量。其中E是進(jìn)樣動(dòng)力，取值多在110 kV/60cm之間，僅為分離時(shí)操作電壓的1/51/3。 是進(jìn)樣時(shí)間，取值通常

15、在110 s之間，有時(shí)可達(dá)1 min或更大。 電動(dòng)進(jìn)樣對(duì)毛細(xì)管內(nèi)的填充介質(zhì)沒有特別限制，可實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化，但在電遷移進(jìn)樣中存在一種歧視效應(yīng)，即電泳淌度大的組分進(jìn)樣量大，電泳淌度小的組分進(jìn)樣量小或不進(jìn)，會(huì)降低分析的準(zhǔn)確度和可靠性。2. 流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣)(820PLSrcQin進(jìn)樣量樣品濃度毛細(xì)管兩端壓力差毛細(xì)管長(zhǎng)度溶液的黏度 顯然， P和 是控制參數(shù)，其中 P 是進(jìn)樣動(dòng)力，可以通過(guò)如下幾種方式進(jìn)行：（a）在進(jìn)樣端加氣壓（正壓）；（b）在出口端抽真空（管尾抽吸，負(fù)壓）；（c）利用虹吸作用，即所謂的重力進(jìn)樣。 P 的取值一般在3450 Pa（約3447 Pa）附近。 的取值通常在15 s之間，有時(shí)可

16、超過(guò)60 s。 在流體動(dòng)力學(xué)進(jìn)樣中不存在像電遷移進(jìn)樣中的歧視效應(yīng)。利用重力虹吸進(jìn)樣：HgP 顯然，進(jìn)樣量也可由 H 控制。 H 的取值通常在520 cm之間，多數(shù)取10 cm，對(duì)應(yīng)的 多在530 s間取值。緩沖溶液的密度重力加速度毛細(xì)管進(jìn)、出口的液面落差 虹吸進(jìn)樣方式一般為沒有壓力進(jìn)樣功能的儀器系統(tǒng)所采納。3. 擴(kuò)散進(jìn)樣DScQin24000 擴(kuò)散進(jìn)樣動(dòng)力屬不可控制參數(shù)，進(jìn)樣量?jī)H由擴(kuò)散時(shí)間控制。擴(kuò)散進(jìn)樣時(shí)間在1060 s間，屬普適性進(jìn)樣方法。 擴(kuò)散系數(shù)三、分離系統(tǒng) 分離系統(tǒng)包括毛細(xì)管、毛細(xì)管恒溫系統(tǒng)、電極和緩沖液池。 1. 毛細(xì)管 目前最常用的是厚壁，內(nèi)徑為2575 m，有效長(zhǎng)度為3075 c

17、m的熔融石英毛細(xì)管柱。并定期清洗。 2. 毛細(xì)管恒溫系統(tǒng) 毛細(xì)管溫度的控溫精度應(yīng)達(dá)到0.1。目前商品儀器配備的恒溫系統(tǒng)有高速氣流恒溫和液體恒溫兩種。 3. 電極和緩沖液池 在毛細(xì)管電泳系統(tǒng)中，正負(fù)鉑電極、進(jìn)樣端緩沖液池、檢測(cè)端緩沖液池和充滿運(yùn)行緩沖液的毛細(xì)管構(gòu)成了一個(gè)導(dǎo)電回路。 緩沖溶液液面高度控制是保證毛細(xì)管電泳分離效率和遷移時(shí)間重現(xiàn)性的重要因素。 緩沖液要經(jīng)常更新，這樣有助于提高電泳分離的重現(xiàn)性。 （一）紫外檢測(cè)四、檢測(cè)系統(tǒng) 紫外吸收檢測(cè)是目前毛細(xì)管電泳最常用的檢測(cè)方法，用于檢測(cè)有紫外吸收的物質(zhì)。依檢測(cè)方式的差異，紫外檢測(cè)器可分為固定波長(zhǎng)、可變波長(zhǎng)、二極管陣列等類型 一般采用柱上檢測(cè)方式，

18、也可實(shí)現(xiàn)柱后檢測(cè)。質(zhì)量檢測(cè)限為10-13 10-16 mol，濃度檢測(cè)限為10-5 10-8 mol/L，其特點(diǎn)為通用性好，二極管陣列可提供光譜信息。 紫外檢測(cè)器由光源、光路系統(tǒng)、信號(hào)接收和處理系統(tǒng)構(gòu)成。（二）熒光檢測(cè) 一般采用柱上檢測(cè)方式。質(zhì)量檢測(cè)限為10-1510-17 mol，濃度檢測(cè)限為10-710-9 mol/L，靈敏度高，需衍生化。（三）激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè) 也可采用柱上和柱后兩種檢測(cè)方式。質(zhì)量檢測(cè)限為10-1810-20 mol，濃度檢測(cè)限為10-1410-16 mol/L，靈敏度非常高，通常需樣品衍生化。 毛細(xì)管電泳的電化學(xué)檢測(cè)器有三個(gè)檢測(cè)模式：安培法、電導(dǎo)法和電位法。 （四）電化學(xué)檢測(cè) 安培法測(cè)量化合物在電極表面受到氧化或還原反應(yīng)時(shí)，失去或得到電子，產(chǎn)生與分析物濃度成正比的電極電流。1. 安培檢測(cè) 是一種高靈敏度的電化學(xué)檢測(cè)法，質(zhì)量檢測(cè)限為10-1810-19 mol，濃度檢測(cè)限為10-1010-11 mol/L，靈敏度高，只適用于電活性物質(zhì)；需要特殊的電化學(xué)和毛細(xì)管柱改性。 電導(dǎo)法和電位法是測(cè)量?jī)呻姌O間由于離子化合物的遷移引起的電導(dǎo)率或電位變化。 2. 電導(dǎo)檢測(cè)和電位檢測(cè) 電導(dǎo)檢測(cè)通用性好，質(zhì)量檢測(cè)限為10-1510-16 mol，濃度檢測(cè)限為10-7