11DNA重組技術(shù)的基本工

1、基因工程又叫做基因工程又叫做基因拼接技術(shù)基因拼接技術(shù)或或DNA重組技術(shù)重組技術(shù)。是指按照人。是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過通過體外體外DNA重組重組和和轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)基因等等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。新的生物類型和生物產(chǎn)品。 DNA 重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具本節(jié)知識內(nèi)容 1.1 DNA1.1 DNA重組技術(shù)的基本工具重組技術(shù)的基本工具專題一專題一 基因工程基因工程“分子手術(shù)刀分子手術(shù)刀” 限制酶限制酶 “分子縫合針分子縫合針” DNA連接酶連接酶 “分

2、子運(yùn)輸車分子運(yùn)輸車” 基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體 粘性末端粘性末端平末端平末端1、種類：、種類：Ecoli DNA連接酶連接酶T4 DNA連接酶連接酶 來源：來源：大腸桿菌大腸桿菌作用：作用：使黏性末端之間連接使黏性末端之間連接來源：來源： T4噬菌體噬菌體作用：作用：既能連接黏性末既能連接黏性末端也端也 能連接平末端，但能連接平末端，但連接平末端之間的效率連接平末端之間的效率比較低比較低2、作用部位：、作用部位： 磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵 DNA連接酶連接酶DNA聚合酶聚合酶連接連接DNA鏈鏈雙鏈雙鏈單鏈單鏈連接部位連接部位在兩在兩DNA片段之間片段之間形成磷酸二酯鍵形成磷酸二

3、酯鍵將單個(gè)核苷酸加將單個(gè)核苷酸加到已存在的核酸到已存在的核酸片段的片段的3末端的末端的羥基上，形成磷羥基上，形成磷酸二酯鍵酸二酯鍵是否需要模板是否需要模板不需要模板不需要模板需要模板需要模板DNA連接酶與連接酶與DNA聚合酶的比較：聚合酶的比較：基因的載體“分子運(yùn)輸車”載體必須具備的條件：載體必須具備的條件： 1、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接；、具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接； 2、能夠在自主復(fù)制，或整合到染色體、能夠在自主復(fù)制，或整合到染色體DN上隨染色上隨染色體體DNA進(jìn)行復(fù)制；進(jìn)行復(fù)制； 3、具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（如抗菌素、具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行篩選。（

4、如抗菌素的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等的抗性基因、產(chǎn)物具有顏色反應(yīng)的基因等 ） 4、對受體細(xì)胞無害、對受體細(xì)胞無害 5、大小適中，便于操作、大小適中，便于操作載體的作用：載體的作用： 1、將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。、將外源基因轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中去。 2、利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對外源基因進(jìn)行大量、利用運(yùn)載體在受體細(xì)胞內(nèi)，對外源基因進(jìn)行大量復(fù)制。復(fù)制。常用的載體有：常用的載體有： 質(zhì)粒，質(zhì)粒，噬菌體的衍生物，動植物病毒等噬菌體的衍生物，動植物病毒等能復(fù)制并帶著插能復(fù)制并帶著插入的目的基因一入的目的基因一起復(fù)制起復(fù)制有切割位點(diǎn)有切割位點(diǎn)有標(biāo)記基因的存有標(biāo)記基因的存在，將來可用含在，將來可用

5、含青霉素的培養(yǎng)基青霉素的培養(yǎng)基鑒別。鑒別。質(zhì)粒質(zhì)粒 質(zhì)粒是基因工質(zhì)粒是基因工程最常用的運(yùn)載體，程最常用的運(yùn)載體，它廣泛地存在于細(xì)它廣泛地存在于細(xì)菌中，菌中，是細(xì)菌染色是細(xì)菌染色體外能夠自主復(fù)制體外能夠自主復(fù)制的很小的環(huán)狀的很小的環(huán)狀DNA分子，分子，大小只有普大小只有普通細(xì)菌擬核通細(xì)菌擬核DNA的的百分之一。百分之一。1.2 基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 與與RNARNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)聚合酶結(jié)合位點(diǎn)啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)編碼區(qū)： 能轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)能

6、轉(zhuǎn)錄，編碼蛋白質(zhì)非編碼區(qū)非編碼區(qū)： 不編碼蛋白質(zhì)不編碼蛋白質(zhì), ,能調(diào)控遺傳信息表達(dá)能調(diào)控遺傳信息表達(dá)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子啟動子終止子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游編碼區(qū)下游 內(nèi)含子內(nèi)含子 外顯子外顯子 與與RNARNA聚合酶聚合酶結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)編碼區(qū)：非編碼區(qū)非編碼區(qū)：外顯子：外顯子： 內(nèi)含子內(nèi)含子： 能編碼蛋白質(zhì)的序列能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列不能編碼蛋白質(zhì)的序列1）.什么是基因文庫？什么是基因文庫？2）.怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？怎樣從基因文庫中得到我們所需的目的基因？種類：基因組

7、文庫：基因組文庫：部分基因文庫部分基因文庫：（cDNAcDNA文庫文庫)P10)P10基因的核苷酸序列等2 2、利用、利用PCRPCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因技術(shù)擴(kuò)增目的基因3 3、人工合成、人工合成 含有一種生物的含有一種生物的全部全部基因基因含有一種生物的含有一種生物的部分部分基因基因根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物根據(jù)基因的有關(guān)信息：如基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA直接分離法直接分離法: : ( (鳥槍法鳥槍法) )構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫直接分離法直接分離法：供體細(xì)胞中的供體細(xì)胞中的DNADNA許多許多DNADNA片段片段運(yùn)載體運(yùn)載體限制酶限制酶分別與運(yùn)分別與運(yùn) 載體連接載體連接受體細(xì)胞受

8、體細(xì)胞分別分別 導(dǎo)入導(dǎo)入( (鳥槍法鳥槍法) )構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫mRNA 反轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄cDNA(互補(bǔ)互補(bǔ)DNA） DNA聚合酶聚合酶雙鏈雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄法：反轉(zhuǎn)錄法：構(gòu)建基因文庫構(gòu)建基因文庫依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的核苷酸序列基因的功能、基因在染色體上的位置基因的功能、基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNAmRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性?；蚍g產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性。2如何從基因文庫中得到所需要的基因？如何從基因文庫中得到所需要的基因？ 概念概念：PCRPCR全稱為全稱為_，是一項(xiàng)，是一項(xiàng) 在生物在生物_復(fù)

9、制復(fù)制_的核酸合成技術(shù)的核酸合成技術(shù) 條件：條件：原理：原理： _聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外體外特定特定DNADNA片段片段DNADNA雙鏈復(fù)制雙鏈復(fù)制四種脫氧核苷酸四種脫氧核苷酸一對引物一對引物熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶(Taq酶酶）DNA的兩條鏈為模板的兩條鏈為模板一段已知目的基因的核苷酸序列一段已知目的基因的核苷酸序列溫度控制和緩沖液溫度控制和緩沖液變性變性退火退火延伸延伸 方式：以方式：以_方式擴(kuò)增，即方式擴(kuò)增，即_（n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)）為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù)） 結(jié)果：結(jié)果：指數(shù)指數(shù)2n使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百使目的基因的片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬倍地?cái)U(kuò)增萬倍地?cái)U(kuò)增化學(xué)方法人

10、工合成：化學(xué)方法人工合成：基因較小，核苷酸序列已知，可以基因較小，核苷酸序列已知，可以利用利用DNA合成儀人工合成合成儀人工合成a、目的基因、目的基因b、啟動子、啟動子c、終止子、終止子d、標(biāo)記基因、標(biāo)記基因啟動子：啟動子：位于基因的首端的位于基因的首端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，它是片斷，它是RNARNA聚合酶識別和結(jié)合的部聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出錄出mRNAmRNA，最終獲得蛋白質(zhì)，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：終止子：位于基因的尾端的位于基因的尾端的一段特殊的一段特殊的DNADNA片斷，片斷，能終能終止止mRNAmRNA的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因標(biāo)記基因的作用是的作用是為了鑒別為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細(xì)因，從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來胞篩選出來目的目的：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目在，并且可以遺傳給下一代，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。（二）（二）方法方法導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入植物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入動物細(xì)胞導(dǎo)入微生物