如何正確進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)

1、如何正確進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)強(qiáng)制降解試驗(yàn)為方法學(xué)驗(yàn)證中的重要內(nèi)容，為了幫助大家了解國外對(duì)強(qiáng)制降解試驗(yàn)的要求，今天分享一篇FDA關(guān)于強(qiáng)制降解試驗(yàn)的相關(guān)要求的文章。1強(qiáng)制降解試驗(yàn)簡介強(qiáng)制降解試驗(yàn)也稱破壞性試驗(yàn)，其試驗(yàn)?zāi)康拿鞔_。強(qiáng)制降解試驗(yàn)可預(yù)測(cè)原料藥的穩(wěn)定性或影響制劑的純度、有效性和安全性的因素。了解不同破壞條件下藥物的降解產(chǎn)物和降解途徑是非常必要的。強(qiáng)制降解試驗(yàn)可以為分析方法的建立、說明書的制定和處方設(shè)計(jì)的確定等提供有益的參考。樣品破壞的程度取決于藥物本身的性質(zhì)和產(chǎn)品的劑型。ICHQ1B為光穩(wěn)定性試驗(yàn)提出了一些建議，在ICH穩(wěn)定性指導(dǎo)原則和驗(yàn)證指南中，沒有可以參考的關(guān)于其他降解條件的建議，對(duì)于氧化和

2、水解降解研究也僅有有限的信息。原料藥與輔料分析方面的藥物專著可以為不同原料藥的各降解條件提供參考。2仿制藥強(qiáng)制降解試驗(yàn)研究存在的問題仿制藥申請(qǐng)時(shí)提供的強(qiáng)制降解試驗(yàn)研究數(shù)據(jù)不完整是中報(bào)的一大缺陷。美國仿制藥申報(bào)常見缺陷解讀（CMC部分）已經(jīng)出版，常見的一些例子說明，強(qiáng)制降解試驗(yàn)的缺陷包括以下幾個(gè)方面：原料藥在各破壞條件下均不產(chǎn)生降解。請(qǐng)重復(fù)破壞試驗(yàn)以獲得足夠的降解產(chǎn)物，若沒有產(chǎn)生降解，請(qǐng)?zhí)峁┮罁?jù)。破壞條件過于劇烈，導(dǎo)致大部分藥物均被降解。請(qǐng)用溫和的破壞條件或減少樣品暴露時(shí)間以產(chǎn)生相關(guān)的降解產(chǎn)物。請(qǐng)注意即使你已經(jīng)用含量測(cè)定的方法對(duì)破壞的樣品進(jìn)行了檢測(cè)，為了驗(yàn)證有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法具有穩(wěn)定性指示功能，

3、破壞的樣品也應(yīng)用有關(guān)物質(zhì)的方法進(jìn)行測(cè)定。請(qǐng)?zhí)峁┧龅尿?yàn)證試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以證明用以檢測(cè)未破壞樣品和破壞樣品的方法能夠檢測(cè)出所有的降解雜質(zhì)。請(qǐng)對(duì)破壞樣品中已知和未知的降解產(chǎn)物進(jìn)行列表總結(jié)。請(qǐng)確定檢測(cè)軟件對(duì)峰純度檢測(cè)的峰高要求。請(qǐng)說明破壞樣品質(zhì)量不守衡的理由。請(qǐng)鑒別原料藥與輔料相互作用產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。光穩(wěn)定性研究表明藥品對(duì)光敏感，請(qǐng)解釋這一點(diǎn)是如何在分析方法，生產(chǎn)工藝以及藥品運(yùn)輸過程反映出來的。在仿制藥申請(qǐng)中，盡量減少以上缺陷，通常會(huì)建議在申請(qǐng)過程中報(bào)告強(qiáng)制降解試驗(yàn)的相關(guān)信息。強(qiáng)制降解試驗(yàn)獲取的信息能夠?yàn)殚_發(fā)穩(wěn)定性指示分析方法、生產(chǎn)工藝，產(chǎn)品運(yùn)輸和儲(chǔ)存條件的確定提供依據(jù)。3如何進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)1、降解條

4、件典型的強(qiáng)制降解主要包括四種機(jī)制：高溫、水解、氧化和光降解。選擇適當(dāng)?shù)钠茐臈l件，如酸堿和氧化劑的濃度、破壞溫度、適宜的破壞時(shí)間，以實(shí)現(xiàn)樣品最佳降解程度。樣品破壞過度會(huì)產(chǎn)生在藥品穩(wěn)定性研究過程中和正常破壞條件下均不會(huì)產(chǎn)生的二次降解產(chǎn)物，這并不是降解試驗(yàn)的目的。因此，控制樣品降解達(dá)到預(yù)期水平是十分必要的。為了實(shí)現(xiàn)有目的的降解，應(yīng)制定適宜的降解研究方案。同時(shí)為加速試驗(yàn)和長期試驗(yàn)的放置條件提供依據(jù)。通常認(rèn)為樣品降解量應(yīng)在520%之間。對(duì)于含量限度為標(biāo)示量的90%110%的小分子藥物，即使在文獻(xiàn)中有更廣泛的推薦范圍作為參考（例如，1030%）,通常允許10%的降解量。降解試驗(yàn)破壞條件越劇烈，則越容易產(chǎn)生

5、二級(jí)降解產(chǎn)物。1.1 光穩(wěn)定性光穩(wěn)定性試驗(yàn)是強(qiáng)制降解試驗(yàn)的重要組成部分，對(duì)光敏感藥物尤為重要。ICHQ1B指導(dǎo)原則提出了新原料藥和制劑的光穩(wěn)定性試驗(yàn)條件。原料藥、固體/液體制齊1J,應(yīng)暴露在總照度不低于1.2X106Lux?h6紫外能量不低于200w?hr/m2的條件下，相同樣品應(yīng)同時(shí)暴露在日光燈和近紫外燈下?？煽刂坪线m的溫度以減少局部溫度變化效應(yīng)。光破壞樣品要檢查樣品是否有物理性質(zhì)（如外觀、溶液的顏色或澄清度卜含量和降解產(chǎn)物的變化。Q1B中列出的決策樹可以用來確定藥物的光穩(wěn)定性試驗(yàn)條件。產(chǎn)品標(biāo)簽應(yīng)列出產(chǎn)品適宜儲(chǔ)存條件，要注意仿制藥標(biāo)簽應(yīng)和參考上市藥物標(biāo)簽以及美國藥典（USP）相關(guān)建議（如適用

6、）保持一致。1.2 熱穩(wěn)定性熱破壞試驗(yàn)條件（例如：干熱破壞和濕熱破）應(yīng)比ICHQ1A中推薦的加速試驗(yàn)條件劇烈。固體原料藥和制劑應(yīng)同時(shí)暴露于干熱和濕熱條件下，而液體制劑可以暴露于干熱條件下。建議破壞溫度應(yīng)高于加速試驗(yàn)溫度的10C,相對(duì)濕度為75%或者更高。破壞試驗(yàn)也可以在更高溫度條件下進(jìn)行短時(shí)間破壞。對(duì)破壞樣品進(jìn)行多個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，能夠充分提供降解速率、一級(jí)與二級(jí)降解產(chǎn)物的信息。即使藥物較穩(wěn)定，產(chǎn)生較少降解產(chǎn)物或無降解產(chǎn)物產(chǎn)生，也應(yīng)確保破壞強(qiáng)度高于在加速條件下（40C）放置6個(gè)月的破壞強(qiáng)度。1.3 酸堿水解原料藥與制劑應(yīng)在常溫或更高溫度條件下，以溶液狀態(tài)進(jìn)行酸堿水解破壞試驗(yàn)，酸堿種類和濃度的選擇取

7、決于藥物本身的特點(diǎn)。其中一種酸堿破壞試驗(yàn)方案為樣品于室溫條件下放置，在不同pH條件下破壞兩周，并且破壞程度建議應(yīng)不高于15%。酸降解一般采用0.1mol/L-1.0mol/L的鹽酸或硫酸，堿降解采用0.1mol/L-1.0mol/L的氫氧化鈉或氫氧化鉀溶液。對(duì)于脂溶性藥物，可選擇惰性溶劑溶解藥物，在選擇助溶劑時(shí)，應(yīng)考慮藥物分子中存在的官能團(tuán)不與助溶劑發(fā)生反應(yīng)。了解化合物的相關(guān)性質(zhì)對(duì)于選擇破壞條件是有用的，例如，一個(gè)化合物含有酯基，則它對(duì)堿是不穩(wěn)定的，則可選擇較低濃度的堿進(jìn)行破壞，在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，能夠了解降解速率和區(qū)分一級(jí)、二級(jí)降解產(chǎn)物。1.4 氧化破壞氧化破壞試驗(yàn)相對(duì)較復(fù)雜，過氧化

8、氫應(yīng)用較廣泛，因?yàn)槟軌蛴盟鼇砟M輔料中可能含有的過氧化物，其他氧化劑，如金屬離子，氧氣，以及自由基引發(fā)劑（例如，偶氮二異丁月青，AIBN）也可以應(yīng)用。氧化劑種類和濃度的選擇取決于藥物本身的性質(zhì)。原料藥在溶液狀態(tài)下，制劑在溶液或固體狀態(tài)下進(jìn)行氧化破壞。據(jù)報(bào)道杵品放置于室溫，在中性條件下經(jīng)濃度為0.1%到3%的過氧化氫破壞7天，最多能產(chǎn)生20%的降解產(chǎn)物。在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，以選擇所需的降解水平，不同的降解條件會(huì)產(chǎn)生相同或不同的降解產(chǎn)物，降解的類型和程度取決于樣品的官能團(tuán)和降解條件。2、分析方法2.1 試驗(yàn)方法首選檢測(cè)方法是反相高效液相色譜法，原因如下：與水和有機(jī)溶劑具體良好的相容性，準(zhǔn)確

9、度好，靈敏度高，能夠檢測(cè)極性化合物。通過選擇合適的色譜柱、柱溫，調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，從而達(dá)到各峰的分離。低保留，極性較大的雜質(zhì)會(huì)在溶劑峰前出峰。梯度洗脫作為分析方法的一部分，流動(dòng)相中有機(jī)相比例由低到高過度，能夠檢測(cè)出低保留極性化合物和高度保留的非極性化合物。也可以用梯度方法對(duì)破壞樣品進(jìn)行檢測(cè)，來評(píng)估目前的洗脫方法是否能夠?qū)悠愤M(jìn)行有效的檢測(cè)，選擇的樣品溶液和流動(dòng)相應(yīng)能充分反映和檢測(cè)出藥物本身、潛在雜質(zhì)和降解產(chǎn)物。破壞樣品的制備方法應(yīng)盡可能地模擬分析過程中所用的樣品制備方法。對(duì)酸堿破壞樣品溶液進(jìn)行酸堿中和稀釋是必要的。破壞樣品的圖譜應(yīng)與空白溶液和未破壞樣品的圖譜進(jìn)行對(duì)比，從而確定各降解產(chǎn)物的降解

10、途徑。計(jì)算雜質(zhì)含量時(shí)，應(yīng)扣除空白峰，空白，未破壞樣品和破壞樣品的圖譜均應(yīng)顯示所有的已知和未知雜質(zhì)的含量。另外，手性化合物應(yīng)該用手性分析手段來確定手性化合物的純度和穩(wěn)定性。分析方法應(yīng)有足夠的靈敏度以檢測(cè)出較低水平的雜質(zhì)，（例如，應(yīng)檢測(cè)出0.05%濃度的雜質(zhì)或者更低濃度的雜質(zhì)），并且峰響應(yīng)值應(yīng)在線性范圍內(nèi)的峰響應(yīng)值以下。分析方法應(yīng)能檢測(cè)到穩(wěn)定性研究過程中產(chǎn)生的所有雜質(zhì)（濃度為報(bào)告限度濃度或更低），依據(jù)ICH的要求和穩(wěn)定性研究結(jié)果，來決定降解產(chǎn)物是否應(yīng)該被鑒定和界定。常規(guī)檢測(cè)方法（例如柱色譜法）或聯(lián)用技術(shù)（例如,LCHMS,LC-NMR）均可應(yīng)用于降解產(chǎn)物的鑒別和界定。通過使用這些技術(shù)可以更深入的了

11、解雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，以及了解各雜質(zhì)是否存在基因毒性警示結(jié)構(gòu)，并對(duì)這些雜質(zhì)進(jìn)行嚴(yán)格的控制。還應(yīng)注意的是，對(duì)在穩(wěn)定性研究過程中產(chǎn)生的超過界定閾值限度的雜質(zhì)應(yīng)進(jìn)行界定?？梢杂貌煌臋z測(cè)方法對(duì)各破壞樣品進(jìn)行檢測(cè)（例如，紫外和質(zhì)譜），所用的檢測(cè)器應(yīng)具有三維數(shù)據(jù)分析的能力，例如，二極管陣列檢測(cè)器或質(zhì)譜分析能夠檢測(cè)到光譜的非均勻性。當(dāng)主峰和雜質(zhì)峰紫外吸收?qǐng)D譜相似或者系統(tǒng)噪音水平過高從而掩蓋了雜質(zhì)或降解產(chǎn)物時(shí)二極管陣列檢測(cè)器可進(jìn)行多波長檢測(cè)。具有相同分子量和官能團(tuán)的化合物（例如非對(duì)映異構(gòu)體）會(huì)呈現(xiàn)出相似的紫外吸收?qǐng)D譜。這種情況下，需要改變色譜參數(shù)以實(shí)現(xiàn)色譜峰的分離。應(yīng)選定最佳波長來檢測(cè)和定量潛在雜質(zhì)和降解雜質(zhì)。如果被

12、分析物、雜質(zhì)和降解產(chǎn)物紫外吸收沒有重疊，則應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行多波長檢測(cè)。在方法開發(fā)時(shí)，應(yīng)對(duì)匯總不同檢測(cè)波長下雜質(zhì)的信息以發(fā)現(xiàn)峰值分布的異同。2.2 峰純度檢測(cè)峰純度是一種方法開發(fā)的輔助工具，當(dāng)不同化合物共同洗脫時(shí)，依據(jù)化合物的光譜特性來反映峰純度指標(biāo)。未破壞樣品和破壞樣品的峰純度或峰均勻性是根據(jù)二極管陣列檢測(cè)器的光譜信息確立的。用于確定峰光譜純度的儀器軟件，相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照生產(chǎn)廠商的說明書進(jìn)行設(shè)置，并確定峰純度檢測(cè)時(shí)對(duì)色譜峰峰高的要求。因?yàn)槲舛戎颠^大，紫外檢測(cè)呈非線性，應(yīng)同時(shí)設(shè)置儀器閾值，以確保共洗脫峰均能被檢出，并選擇參比光譜的最佳位置。在梯度洗脫過程中，應(yīng)驗(yàn)證軟件自動(dòng)校正不斷變化的溶劑峰的能力。

13、峰純度檢測(cè)不是確定檢測(cè)峰是否為純峰的絕對(duì)證明，當(dāng)共洗脫峰光譜相似、樣品濃度低于檢測(cè)限濃度、檢測(cè)峰沒有發(fā)色團(tuán)，或者樣品沒有溶解的情況下，峰純度檢測(cè)具有一定的局限性。2.3 質(zhì)量守衡盡管不是在所有的情況下，破壞樣品均能達(dá)到質(zhì)量平衡，但這種方法能使穩(wěn)定性指示方法更加充分。此法可以通過樣品測(cè)量值、所有雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的測(cè)量值之和與未破壞樣品初始值接近100%的程度來確定，在計(jì)算時(shí)適當(dāng)考慮產(chǎn)生的分析誤差。盡量使所有的破壞樣品均達(dá)到質(zhì)量守衡。若樣品質(zhì)量不守衡，則應(yīng)進(jìn)行深入研究，并對(duì)這種情況給出說明。由于被分析物和雜質(zhì)紫外吸收情況有顯著差異，應(yīng)用外標(biāo)法對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。揮發(fā)性雜質(zhì)的潛在損失、非紫外吸收化合物的形

14、成，不保留雜質(zhì)，強(qiáng)保留雜質(zhì)等情況都應(yīng)被考慮在內(nèi)。交替檢測(cè)技術(shù)，例如示差折光檢測(cè)器與液質(zhì)聯(lián)用可以用來檢測(cè)非紫外吸收的降解產(chǎn)物。3、研究終點(diǎn)確保樣品在各降解條件下進(jìn)行充分的暴露后即可終止強(qiáng)制降解試驗(yàn)，藥物分子典型活化能從12kcal/mol變換到24kcal/mol。一種化合物不一定在每種降解條件下均產(chǎn)生降解，暴露極值的一般準(zhǔn)則可參考相關(guān)文獻(xiàn)。一些穩(wěn)定藥物在任意降解條件下均不會(huì)產(chǎn)生降解，可以通過在藥物中加入已知雜質(zhì)來建立分析方法，同時(shí)應(yīng)保證各峰能夠達(dá)到基線分離。另,在使用藥典和USP<621>中概述的限制使用的方法，降解試驗(yàn)是沒有必要研究的。因?yàn)橥凰幬锏牟煌涂赡芫哂胁煌姆€(wěn)定性特

15、征，當(dāng)一個(gè)仿制藥產(chǎn)品品型不同于RLD產(chǎn)品晶型時(shí)，原料藥應(yīng)進(jìn)行降解試驗(yàn)來評(píng)價(jià)多品性藥物的理化變化。4相關(guān)說明在QbD理念中，研究關(guān)鍵質(zhì)量屬性滿足預(yù)定目標(biāo)的產(chǎn)品，必須運(yùn)用強(qiáng)制降解試驗(yàn)中獲得的數(shù)據(jù)信息。在QbD理念中，一個(gè)精心設(shè)計(jì)的強(qiáng)制降解試驗(yàn)研究對(duì)于分析方法的開發(fā)是不可或缺的，它有助于建立一個(gè)穩(wěn)定的特異性指示方法和預(yù)測(cè)在穩(wěn)定性研究中可能形成的潛在降解產(chǎn)物。將所有潛在雜質(zhì)混合進(jìn)行分析方法的建立，并且通過建立各峰峰純度的理念來幫助避免不必要的方法再開發(fā)和再驗(yàn)證。藥物在各降解條件下的化學(xué)變化，為制劑處方篩選提供有用的信息。輔料相容性試驗(yàn)的目的是了解藥物研發(fā)過程中，處方中各成分的相互作用，它是藥物研發(fā)過程

16、中不可或缺的一部分。分別對(duì)原料藥、制劑與參比制劑進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)和雜質(zhì)分布對(duì)比，藥物與輔料相互作用或者復(fù)方中藥物和藥物的相互作用而產(chǎn)生的降解雜質(zhì)是可以考察的。從中獲得的藥物相關(guān)峰與藥物非相關(guān)峰的信息則可應(yīng)用于更穩(wěn)定的制劑處方的選擇和研究。例如，如果一種藥物對(duì)氧敏感，需考慮在處方中加入抗氧劑；如果藥物本身對(duì)酸不穩(wěn)定，或者在酸性介質(zhì)中會(huì)轉(zhuǎn)換成其他物質(zhì)，那么將這種藥物做成緩釋制劑可能是必要的。酸堿水解破壞試驗(yàn)可以為藥品制成液體制劑或混懸溶液制劑提供參考依據(jù)。在強(qiáng)制降解試驗(yàn)研究中獲得的信息可以促進(jìn)生產(chǎn)工藝過程的改進(jìn)，如果光穩(wěn)定性試驗(yàn)研究顯示藥物對(duì)光敏感，那么在藥品生產(chǎn)過程中就應(yīng)注意這點(diǎn)。原料藥和制劑熱破壞性試驗(yàn)可以為工藝開發(fā)提供有用的信息（例如，濕法制粒還是干法制粒，以及溫度的選擇）。止匕外，提高降解產(chǎn)物和降解機(jī)制的科學(xué)認(rèn)知可能有助于確定導(dǎo)致穩(wěn)定性試驗(yàn)失敗的因素，如