【課件】重組DNA技術(shù)的基本工具課件2021-2022學(xué)年高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

1、從社會中來番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會大大下降。番木瓜容易受番木瓜環(huán)斑病毒的侵襲。當(dāng)番木瓜被這種病毒感染后，產(chǎn)量會大大下降?？茖W(xué)家通過精心設(shè)計，用科學(xué)家通過精心設(shè)計，用“分子工具分子工具”培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑培育出了轉(zhuǎn)基因番木瓜，它可以抵御番木瓜環(huán)斑病毒。病毒。DNA雙螺旋的直徑只有雙螺旋的直徑只有2nm,對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細(xì)的工作，對如此微小的分子進行操作，是一項非常精細(xì)的工作，更需要專門的更需要專門的“分子工具分子工具”。轉(zhuǎn)基因番木瓜（左）與非轉(zhuǎn)基因番木瓜（右）指按照人們的愿望,進行嚴(yán)格的設(shè)計并通過體外DNA重

2、組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性,創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設(shè)計和施工的，因此又叫作DNA重組技術(shù)。【歸納定義】【歸納定義】工程工程別名：別名： 操作對象：操作對象： 操作水平：操作水平： 工程工程實質(zhì)：實質(zhì)：什么是基因工程？DNADNA重組技術(shù)重組技術(shù)基因基因DNADNA分子水平分子水平基因重組基因重組第1節(jié)三種“分子工具”“分子手術(shù)刀”“分子縫合針”“分子運輸車”來源：種類：主要來自原核生物特點：數(shù)千種能識別雙鏈DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。（限制酶不是一種酶，而是一類酶）一、限制性內(nèi)切核

3、酸酶 分子手術(shù)刀根據(jù)你所掌握的知識你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是什么？主要起到切割外源DNA使之失效，從而達到保護自身的目的。12345 G限制酶12345 A磷酸二酯鍵磷酸二酯鍵TGCCGTAA一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀5353仔細(xì)觀察仔細(xì)觀察以下四種以下四種限制酶識別的特定序列有何限制酶識別的特定序列有何特點？特點？EcoR G-A-A-T-T-CC-T-T-A-A-GHind A-A-G-C-T-TT-T-C-G-A-ABamH G-G-A-T-C-CC-C-T-A-G-GTaqT-C-G-AA-G-C-T限制酶所識別的序列的特點是：呈現(xiàn)堿基互補對稱，無論是6個堿基還是4個

4、堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的 ，稱為回文序列。一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀黏性末端黏性末端黏性末端黏性末端一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀EcoRI 限制酶的切割：只能識別GAATTC序列，并在G和A之間切開。伸出的核苷酸互補配對黏性末端中軸線SmaI 限制酶的作用： 只能識別CCCGGG序列，并在C和G之間切開。在C和G之間切開一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀平末端一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀結(jié)果： 產(chǎn)生黏性末端或平末端一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀（1）該DNA片段上EcoRI的識別序列在哪兒？（2）請用剪刀模擬EcoRI的識別

5、序列和切割位點將目的基因“切割”下來。實踐活動一、實踐活動一、用剪刀模擬用剪刀模擬EcoRIEcoRI剪切目的基因剪切目的基因(Bt(Bt基因基因) )操作操作5.TAG3.ATCTTAAAATTCCA.3 GGT.5AATTC . B t . GG .基因.CTTAA黏性末端目的基因黏性末端 要想獲得某個特定性狀的目的基因必須要用限制酶切幾個切口？可產(chǎn)生幾個黏性(平)末端？ 如果把兩種來源不同的DNA用同種限制酶來切割，會怎樣？要切2個切口，產(chǎn)生4個黏性(平)末端。會產(chǎn)生相同的黏性(平)末端一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀【反饋練習(xí)】【反饋練習(xí)】1.下面哪項不具有限制酶識別序列的特征（ ）A

6、GAATTC BGGGGCCCC CTTAAG CCCCGGGGCCTGCAG DCTAAATC GACGTC GATTTAGD一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀 2.下列下列是由同種限制酶切割形成的是由同種限制酶切割形成的DNA片段是片段是（ ）CTGCA GGCTTAA GACGTC AATTC GA. ； B. ；C. ； D.以上都不對以上都不對A 缺口怎么辦？缺口怎么辦？一、限制性內(nèi)切核酸酶 分子手術(shù)刀什么樣的末端才能連接起來？，1. 作用：2. 種類： Ecoli DNA連接酶 T4 DNA連接酶將雙鏈 DNA片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵 。二、DN

7、A連接酶 分子縫合針兩DNA片段要具有互補的黏性末端才能拼起來可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的兩條單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！3、DNA連接酶的縫合作用二、DNA連接酶 分子縫合針 可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，即恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵二、DNA連接酶 分子縫合針二、DNA連接酶 分子縫合針3.Ecoli DNA連接酶與T4DNA連接酶比較：類型功能大腸桿菌T4噬菌體恢復(fù)磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)相同點差別DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？二、DNA連接酶 分子縫合針 A A T T

8、 GCAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶DNA聚合酶的作用二、DNA連接酶 分子縫合針4.幾種相關(guān)酶的比較幾種相關(guān)酶的比較名稱作用部位作用結(jié)果限制酶 DNA連接酶DNA聚合酶DNA(水解)酶解旋酶二、DNA連接酶 分子縫合針磷酸二酯鍵堿基對之間的氫鍵將DNA切成兩個片段磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈3.根據(jù)所學(xué)知識，完成以下填空：限制酶 解旋酶 DNA連接酶 DNA聚合酶 RNA聚合酶baA.切斷a處的酶為_B.連接

9、a處的酶為_C.切斷b處的酶為_a：磷酸二酯鍵；b：氫鍵【反饋練習(xí)】二、DNA連接酶 分子縫合針4.4.如圖為DNADNA分子在不同酶的作用下所發(fā)生的變化，圖中依次表示限制性內(nèi)切核酸酶、DNADNA聚合酶、DNADNA連接酶、解旋酶作用的正確順序是() A B C DC二、DNA連接酶 分子縫合針5.基因工程技術(shù)也稱為DNA重組技術(shù),下列有關(guān)基因工程的說法錯誤的是 ()A.基因工程的基本原理是基因重組B.基因工程常用的工具酶有限制酶、DNA連接酶和載體C.基因工程可以定向改造生物的性狀D.基因工程常用的載體有質(zhì)粒、噬菌體和動植物病毒B【反饋練習(xí)】二、DNA連接酶 分子縫合針質(zhì)粒將外源基因送入受

10、體細(xì)胞, 在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進行大量復(fù)制. 1.作用：動植物病毒噬菌體2.種類：三、基因進入細(xì)胞的載體分子運輸車質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。大腸桿菌及質(zhì)粒結(jié)構(gòu)模式圖3、運載體需具備的條件（1）能夠在宿主細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存（2）有一個至多個限制酶切點（3）有某些標(biāo)記基因（4）對受體細(xì)胞無害、易分離能進入受體細(xì)胞并在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并表達；便于與不同目的基因結(jié)合便于鑒定和篩選三、基因進入細(xì)胞的載體分子運輸車5. pBI121 .GAATTC.3 3. 質(zhì) 粒 .CTTAAG.5 實踐活動二實踐活動二 、請請

11、將代表將代表pBI121pBI121質(zhì)粒的序列首尾黏貼在一起，模擬環(huán)化質(zhì)粒質(zhì)粒的序列首尾黏貼在一起，模擬環(huán)化質(zhì)粒三、基因進入細(xì)胞的載體分子運輸車5. pBI121 .GAATTC.3 3. 質(zhì) 粒 .CTTAAG.5 實踐活動三、重組實踐活動三、重組DNADNA分子的模擬操作分子的模擬操作三、基因進入細(xì)胞的載體分子運輸車 請請用剪刀模擬用剪刀模擬EcoRIEcoRI識別下面質(zhì)粒識別下面質(zhì)粒序列和切割位點進行序列和切割位點進行“切割切割”，將將切下的片段與目的基因片段進行重組，并用透明膠條將切口粘連起來切下的片段與目的基因片段進行重組，并用透明膠條將切口粘連起來。目的基因1.剪刀剪刀和透明膠條分

12、別代表哪種和透明膠條分別代表哪種“分子工具分子工具” ？剪刀代表限制酶；透明膠條代表DNA連接酶。2.你你制作的黏性末端的堿基能不能互補配對？如果不能，可能是什么原因造成的？制作的黏性末端的堿基能不能互補配對？如果不能，可能是什么原因造成的？如果制作的黏性末端的堿基不能互補配對可能是剪切位點或連接位點選得不對，也可能是其他原因。3.你你插入的插入的DNA片段能稱得上一個基因嗎？片段能稱得上一個基因嗎？不能，因為基因的長度一般在100個堿基對以上。三、基因進入細(xì)胞的載體分子運輸車6.下列有關(guān)質(zhì)粒的敘述中,正確的是 ()A.質(zhì)粒是存在于細(xì)菌中的一種細(xì)胞器 B.質(zhì)粒改造后可用作基因工程的載體C.質(zhì)粒

13、上基因的表達不遵循中心法則 D.質(zhì)粒必須具有抗生素抗性基因以便篩選B三、基因進入細(xì)胞的載體分子運輸車7基因運輸工具載體，必須具備的條件之一及理由均正確的是（ ） A能夠復(fù)制，以便目的基因插入其中 B具有多個限制酶切割位點，便于目的基因的表達 C具有某些標(biāo)記基因，便于重組DNA的篩選 D對受體細(xì)胞無害，便于重組DNA的篩選C8.根據(jù)基因工程的有關(guān)知識,回答下列問題:(1)限制性內(nèi)切核酸酶切割DNA分子后產(chǎn)生的片段,其末端類型有 和 。 (2)載體質(zhì)粒用EcoR切割后產(chǎn)生的片段如下:為使載體與目的基因相連,含有目的基因的DNA除可用EcoR切割外,還可用另一種限制性內(nèi)切核酸酶切割,該酶必須具有的特

14、點是 。 平末端切割產(chǎn)生的DNA片段黏性末端與EcoR切割產(chǎn)生的相同黏性末端三、基因進入細(xì)胞的載體分子運輸車(3)按其來源不同,基因工程中所使用的DNA連接酶有兩類,即DNA連接酶和DNA連接酶。 (4)基因工程中除質(zhì)粒外,和也可作為載體。 T4噬菌體動植物病毒E.coli限制酶DNA連接酶載體對受體細(xì)胞無害；有一個至多個限制酶切割位點；有特殊的標(biāo)記基因；能自我復(fù)制或能整合到宿主DNA上。質(zhì)粒、噬菌體衍生物 、動植物病毒基因工程的基本工具作為載體的條件種類：磷酸二酯鍵來源：主要來源于原核生物特點：作用部位：具有專一性結(jié)果：形成黏性末端或平末端連接部位：磷酸二酯鍵 種類： E.coliDNA連接

15、酶、T4 DNA連接酶作用： 把兩條雙鏈DNA片段拼接起來 課堂小結(jié)DNA含量相對較高的生物組織，如新鮮洋蔥、香蕉、菠菜、菜花和豬肝等。（注意：（注意：不能選擇不能選擇哺乳動物成熟的紅細(xì)胞哺乳動物成熟的紅細(xì)胞，因為哺乳動物成熟的紅細(xì)胞中，因為哺乳動物成熟的紅細(xì)胞中沒有細(xì)胞核沒有細(xì)胞核和線粒體，幾乎不含和線粒體，幾乎不含DNA。）材料用具1.選材：2.試劑：研磨液體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精2mol/L 的NaCl溶液二苯胺試劑蒸餾水溶解并提取DNA析出DNA溶解DNA鑒定DNA，要現(xiàn)配現(xiàn)用四、DNA的粗提取與鑒定稱取 ，切碎，放入研缽，倒入 ，充分研磨。在漏斗中墊上紗布過濾研磨液，4冰箱中靜置后取

16、；或?qū)⒀心ヒ旱谷胨芰想x心管中離心，取 。在上清液中加入體積相等的、 溶液, 靜置23min，溶液中出現(xiàn)的 就是粗提取的DNA 。2.去除雜質(zhì)3.DNA的析出1.破碎細(xì)胞洋蔥研磨液上清液上清液預(yù)冷的酒精白色絲狀物方法步驟 思考：如何評價結(jié)果？看提取物顏色看與二苯胺反應(yīng)顏色的深淺DNA純度DNA的量用玻璃棒沿一個方向攪拌，卷起絲狀物；或?qū)⑷芤旱谷胨芰想x心管中離心，取沉淀物晾干。析出DNA四、DNA的粗提取與鑒定將絲狀物或沉淀物溶于 溶液中，加入 試劑，混合均勻后，將試管置于沸水中加熱5min4.DNA的鑒定二苯胺2mol/L的NaCl方法步驟 空白對照組： 在等體積的NaCl溶液中加入二苯胺試劑，

17、將試管置于同等沸水浴中加熱5min。四、DNA的粗提取與鑒定（1）選什么樣的材料實驗更易成功？用洋蔥做材料，為什么要充分研磨？（2）豬血和雞血，哪個適合用作提取DNA的材料？操作時如何防止血液凝固？（3）如果用雞血動物細(xì)胞做材料，也需要研磨裂解釋放細(xì)胞中的DNA嗎？豬血（哺乳動物的成熟紅細(xì)胞）無細(xì)胞核，不適合；雞血中紅細(xì)胞有核DNA，且核DNA的量較多，適合。含DNA的生物材料都可以，選取DNA含量相對較高的生物組織，成功率更大。充分研磨，可以破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，釋放DNA。加入清水，讓細(xì)胞吸水脹破，釋放DNA。思考與討論：思考與討論：如果是豬肝呢？雞血中加入檸檬酸鈉，可防止血液凝固。四、D

18、NA的粗提取與鑒定1.一環(huán)狀DNA分子,設(shè)其長度為1。限制性內(nèi)切核酸酶A在其上的切點位于0.0處;限制性內(nèi)切核酸酶B在其上的切點位于0.3處;限制性內(nèi)切核酸酶C的切點未知。但C單獨切或與A或B同時切的結(jié)果如下表,請確定C在該環(huán)形DNA分子的切點應(yīng)位于圖中的( )A.0.2和0.4處 B.0.4和0.6處 C.0.5和0.7處 D.0.6和0.9處AC單切長度為0.8和0.2的兩個片段C與A同時切2個長度為0.2和1個0.6的片段C與B同時切2個長度為0.1和1個0.8的片段課 堂 測 評【能力提升】2.有2個不同來源的DNA片段A和B，A片段用限制酶SpeI進行切割，B片段分別用限制酶Hind、XbaI、EcoRV和XhoI進行切割。各限制酶