電泳技術(shù)及應(yīng)用

1、電泳技術(shù)及其應(yīng)用1234電泳原理及其分類SDS-PAGE電泳技術(shù)等電泳聚焦電泳雙向電泳技術(shù)1 電泳原理及其分類原理： 帶電顆粒在作用下電場(chǎng)，向著與其電性相反的電極移動(dòng)，稱為電泳(electrophoresis, EP)。利用帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)速度不同而達(dá)到分離的技術(shù)稱為電泳技術(shù)。電泳分類：1 依據(jù)支持物的性狀：紙質(zhì)電泳、粉末電泳、凝膠電泳、緣線電泳2 依據(jù)支持物的裝置形式：平板電泳、垂直板電泳、柱狀（管狀）電泳3 依據(jù)pH的連續(xù)性：連續(xù)pH電泳（無(wú)濃縮膠）、非連續(xù)pH電泳常用的電泳技術(shù)：聚丙烯酰胺凝膠電泳等電聚焦電泳雙向電泳瓊脂糖電泳（大分子核酸、病毒類物質(zhì)）2 丙烯酰胺凝膠電泳原理：聚丙烯

2、酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在加速劑N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和催化劑過(guò)硫酸銨(AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。它的遷移率取決于它所帶凈電荷凈電荷以及分子的大小和分子的大小和形狀形狀等因素。分子量與凝膠濃度的關(guān)系丙烯酰胺濃度（%）線性分離范圍（kD） 1512431016687.536945.057212SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE） ：如果在丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中加入陰離子去污劑十二烷基磺酸鈉(SDS)，則蛋白質(zhì)分子的電泳遷移率主要取決于它的分子

3、量，而與所帶電荷和形狀無(wú)關(guān)。因此可以利用SDS-PAGE測(cè)定蛋白質(zhì)分子量。 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15KD200KD之間時(shí)，電泳遷移率與分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系。 依據(jù)分子量的大小分子量的大小確定濃縮膠和分離膠的濃度及標(biāo)準(zhǔn)蛋白。v制備分離膠封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。倒出水或正丁醇，并用濾紙吸干加入濃縮膠溶液 pH6.8v制備濃縮膠插入樣品梳樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。安裝-制膠-進(jìn)樣-電泳過(guò)程-剝膠-染色-脫色處理-凝膠成像-軟件處理3 等電聚焦電泳原理： 等電聚焦電泳(IEF)是利用兩性電解質(zhì)載體形成一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)

4、定的線性pH梯度，將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當(dāng)其處在低于其本身等電點(diǎn)的環(huán)境中則帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)；若其處在高于其本身等電點(diǎn)的環(huán)境中，則帶負(fù)電向正極移動(dòng)。當(dāng)泳動(dòng)到其自身特有的等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，泳動(dòng)速度下降到零，具有不同等電點(diǎn)的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點(diǎn)位置 ，形成一個(gè)個(gè)清晰的區(qū)帶，分辨率極高。 如果在電泳系統(tǒng)中建立一個(gè)由陽(yáng)極至陰極，如果在電泳系統(tǒng)中建立一個(gè)由陽(yáng)極至陰極，pH由由低到高（即環(huán)境由酸到堿）的連續(xù)而穩(wěn)定的低到高（即環(huán)境由酸到堿）的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度，梯度，則處于一個(gè)系統(tǒng)的各種蛋白質(zhì)分子，將根據(jù)各自的則處于一個(gè)系統(tǒng)的各種蛋白質(zhì)分子，將根據(jù)各自的pI值與所處位點(diǎn)的值與所處位點(diǎn)的oH值的差別帶上正電或負(fù)電。值的差別帶上正電或負(fù)電。等電聚焦電泳圖譜4 雙向電泳雙向電泳（two-dimensional electrophoresis）是等電聚焦電泳和SDS-PAGE的組合，即先進(jìn)行等電聚焦電泳（按照pI分離），然后再進(jìn)行SDS-PAGE（按照分子大小），經(jīng)染色得到的電泳圖是個(gè)二維分布的蛋白質(zhì)圖。蛋白雙向電泳的分辨率分辨率和靈敏度和靈敏度很高,可分離1000-3000個(gè)蛋白質(zhì),最高可分辨11000個(gè)蛋白質(zhì),pI差別小于01003個(gè)pH單位也可